Over-Ekspresi Gen OsDREB1A Guna Perbaikan

TRANSFORMASI GEN OsDREB1A DENGAN Agrobacterium tumefaciens
DAN REGENERASI TANAMAN PADI
ABSTRAK
Kekeringan merupakan salah satu faktor yang berdampak pada penurunan
produksi tanaman padi. Salah satu usaha untuk menanggulangi masalah
kekeringan adalah menanam varietas toleran. Perakitan varietas padi toleran
terhadap cekaman kekeringan dapat dilakukan menggunakan teknik rekayasa
genetik dengan mengintroduksikan gen ke genom padi melalui Agrobacterium
tumefaciens. Penelitian ini bertujuan untuk mendapat tanaman padi putatif
transgenik yang mengandung gen OsDREB1A yang ekspresinya dikendalikan
oleh promoter 35S. Kalus yang berasal dari biji padi varietas Nipponbare
ditransformasi dengan konstruk 35S::OsDREB1A melalui Agrobacterium,
kemudian diregenerasikan dan diaklimatisasi hingga menghasilkan tanaman padi
putatif transgenik. Hasil penelitian menunjukkan bahwa
konstruk
35S::OsDREB1A dapat ditransformasikan ke genom padi Japonica Nipponbare
dengan metode A. tumefaciens dan seleksi higromisin. Hasil analisis PCR
menggunakan primer HPTII memperlihatkan bahwa semua tanaman padi yang
dianalisis positif mengandung transgen. Terdapat variasi morfologi pada tanaman
padi putatif transgenik generasi T0.
Kata kunci : Transformasi, regenerasi, padi, gen OsDREB1A
ABSTRACT
Drought is a critical factor affecting the reduction in rice production. One of the
efforts to overcome the problem of drought is to grow tolerant varieties. Creating
of rice varieties tolerant to drought stress can be made using genetic engineering
techniques by introducing genes into rice genome by Agrobacterium tumefaciens.
The aim of this study was to obtain putative transgenic rice plants containing
OsDREB1A gene under the promoter 35S. Calli derived from seeds of rice variety
Nipponbare were transformed using 35S::OsDREB1A construct mediated by
Agrobacterium, then regenerated and acclimatized to generate putative transgenic
rice plants. The results showed the 35::OsDREB1A construct could be
transformed into Japonica rice cv. Nipponbare genome with A. tumefaciens
method and hygromycine selection. PCR analysisi using the primers HPTII
showed that all analyzed rice plants contained transgene. There were variation on
the morphology of putative transgenic rice T0 plants.
Key words: Transformation, regeneration, rice, gene OsDREB1A
14
Pendahuluan
Perakitan varietas padi toleran kekeringan dapat dilakukan melalui
pemuliaan klasik maupun menggunakan teknologi transformasi genetik. Sifat
toleransi kekeringan pada padi dikendalikan oleh banyak gen (Kasuga et al. 1999,
Shinozaki dan Yamaguchi-Shinozaki 2004),
sehingga sulit untuk merakit
varietas toleran bila menggunakan pemuliaan klasik. Perakitan
varietas padi
dengan menggunakan teknik transformasi genetik diharapkan dapat menghasilkan
varietas padi unggul dengan sifat-sifat yang dikehendaki. Transfomasi genetik
dengan perantaraan Agrobacterium tumefaciens merupakan salah satu teknik
transformasi yang banyak dilakukan oleh para peneliti dan telah berhasil dengan
baik. Agrobacterium merupakan bakteri yang berperanan
untuk membantu
menyisipkan gen ke dalam genom tanaman, misalnya pada transformasi tanaman
kentang dengan gen RB untuk meningkatkan ketahanan terhadap penyakit hawar
daun ( Song et al. 2003), tanaman padi dengan gen CBF3/DREB1A dan ABF3
dari Arabidobsis untuk meningkatkan toleransi terhadap cekaman abiotik (Oh et
al. 2005).
Gen DREB1A termasuk gen faktor transkripsi yang berperan dalam
meregulasi sejumlah gen lain yang berhubungan dengan karakter kekeringan ( Liu
et al. 1998). Hasil penelitian Dubouzet et al. (2003) menunjukkan bahwa over
ekspresi dari gen OsDREB1A yang berasal dari genom padi pada
tanaman
Arabidopsis transgenik dapat menginduksi over ekspresi gen target DREB1A, dan
menghasilkan tanaman Arabidopsis yang lebih toleran terhadap cekaman
kekeringan, kadar garam tinggi, dan suhu rendah. Gen-gen yang berbasis DREB
(Dehydration Response Element Binding) yang telah diisolasi oleh Dubouzet et al.
(2003) dari genom padi adalah
OsDREB1A, OsDREB1B, OsDREB1C,
OsDREB1D, dan OsDREB2A.
Beberapa tanaman hasil rekayasa transgenik yang menggunakan gen
DREB antara lain tanaman tomat transgenik (gen CBF1/DREB1B) yang lebih
toleran terhadap kekeringan (Hsieh et al. 2002). Gen DREB1B ini homolog
dengan gen DREB1A yang responsif terhadap suhu rendah dan defisit air
(Gilmour et al. 1998). Pada tanaman gandum transgenik, gen DREB1A
meningkatkan toleransi terhadap kekurangan air (Pellegrineschi et al. 2004).
15
Tanaman padi subgroup japonica yang ditransfomasi dengan 35S::OsDREB1A
memperlihatkan lebih toleran terhadap kekeringan (Ito et al. 2006). Namun, efek
over-ekspresi gen OsDREB1A pada toleransi kekeringan taanaman padi subgroup
indica belum diketahui.
Tujuan Penelitian
Untuk mendapatkan tanaman padi cv. Nipponbare yang mengandung
konstruk 35S::OsDREB1A.
Metodologi Penelitian
a. Bahan Genetik
Gen
35S::OsDREB1A
yang
dikonstruk
oleh
Mulyana
(2010)
ditransformasi ke genom padi Nipponbare melalui Agrobacterium tumefaciens.
b. Bahan tanaman
Benih padi genotipe Nipponbare yang digunakan dalam penelitian ini
diperoleh dari International Rice Research Institute.
c. Pelaksanaan Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Biologi Molekuler dan Rumah
kaca Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumber Daya
Genetik Pertanian, Bogor, Februari 2008 – Maret 2010.
Transformasi
Transformasi dan regenerasi tanaman dilaksanakan berdasarkan metode
Greco et al. (2001). Sebanyak 200 biji padi varietas Nipponbare steril digunakan
untuk sekali proses transformasi dan
sepuluh biji padi ditanam pada setiap
petridis yang mengandung media induksi kalus (media basal NB + 30 g/l sukrosa
(pH 5,8) + 3 g/l phytagel + 2,5 mg/l 2,4-D). Jaringan kalus yang embriogenik
dimasukkan dalam media ko-kultivasi cair (Media dasar R2 + 10 g/l glukosa (pH
5,2) + 2,5 mg/l 2.4-D + 100 μM acetosyringone) yang mengandung
Agrobacterium
tumefaciens
(strain
Agl-1)
yang
mengandung
plasmid
pCambia1301-35S::OsDREB1A. Kalus kemudian ditanam pada media kokultivasi padat (Media dasar R2 + 10 g/l glukosa (pH 5,2) + 3g/l phytagel + 2,5
mg/l 2.4-D + 100 μM acetosyringone) dan diinkubasi selama tiga hari dalam
keadaan gelap pada suhu 25oC. Kalus yang segar dipindahkan ke media seleksi
16
(Media dasar R2 + 30 g/l glukosa (pH 6,0) + 3g/l phytagel + 2,5 mg/l 2.4-D + 400
mg/l cefotaxime + 100 mg/l vancomycine + 50 mg/l hygromycine), kemudian
diinkubasikan dalam ruang gelap (28oC) selama dua minggu dan disubkultur pada
media dan kondisi tumbuh yang sama selama 2 minggu. Kalus yang embriogenik
dipindahkan ke dalam media induksi embrio (Media dasar LS + 30 g/l sukrosa
(pH 5,8) + 100 ml/l air kelapa + 3g/l phytagel + 2,5 mg/l 2.4-D + 400 mg/l
cefotaxime + 100 mg/l vancomycine + 50 mg/l hygromycine) dan diinkubasi
dalam ruang gelap (28oC) selama dua minggu.
Regenerasi Tanaman. Kalus embriogenik yang terseleksi dipindahkan
pada media regenerasi embrio (Media dasar LS + 40 g/l sukrosa (pH 5,8) + 3g/l
phytagel + 0,5 mg/l IAA + 0,3 mg/l BAP + 400 mg/l cefotaxime + 100 mg/l
vancomisin + 50 mg/l higromisin) dan diinkubasikan dalam ruang kultur dengan
cahaya kontinyu selama dua minggu pada suhu 25oC. Kalus yang ada bercak hijau
disubkultur pada media yang sama. Kalus yang sudah tumbuh daun/tunas
sepanjang minimal sekitar 1 cm disubkultur pada media perakaran (Media dasar
LS + 30 g/l sukrosa (pH 5,8) + 3 g/l phytagel, diautoklaf + 40 g/l higromisin).
Planlet disimpan dalam ruang kultur dengan cahaya kontinyu pada suhu ruang
(280C).
Aklimatisasi Tanaman. Planlet (tunas) yang berakar dan tinggi tajuk
minimal 5 cm dipindahkan ke media air selama satu minggu dan disimpan pada
suhu ruang. Planlet selanjutnya dipindahkan ke media tanah dalam bak plastik
untuk pembibitan selama dua sampai tiga minggu. Bibit tanaman padi
dipindahkan pada media tanah dalam ember dirumah kaca dan dipelihara sampai
menghasilkan biji. Pengamatan dilakukan terhadap tinggi tanaman, jumlah
anakan, panjang malai, jumlah gabah.
Analisis Molekuler dengan Teknik PCR
Isolasi DNA yang berasal dari serbuk daun muda tanaman padi
berdasarkan prosedur Shure et al. (1983). DNA hasil isolasi diuji integritasinya
dengan elektroforesis dan diukur konsentrasinya menggunakan spektrofotometer.
Selanjutnya DNA diencerkan dengan ddH2O untuk mencapai konsentrasi 10
ng/μl. Campuran reaksi ( 2µl buffer PCR + 1,2 µl MgCl2 + 0,4 µl DNTPs + 2 µl
primer mix HPT + 0,16 µl Taq DNA polimerase + 9,24 µl ddH2O + 5 µl sampel
17
DNA) diamplifikasi menggunakan mesin PCR. Profil suhu yang digunakan
adalah predenaturasi 94 oC selama 5 menit, dilanjutkan dengan 35 siklus meliputi
pemisahan (denaturation) pada suhu 94oC selama 1 menit, penempelan primer
(annealing) pada suhu 55oC selama 1 menit, pemanjangan primer (extension)
pada suhu 72 oC selama 2 menit. Pada tahap akhir PCR dilakukan pemanjangan
akhir pada 72
o
C selama 5 menit. Produk amplifikasi diseparasi pada
elektrofloresis gel agarose. Fragmen-fragmen DNA pada gel agarose direndam
dalam larutan ethidium bromida dan divisualisasi menggunakan Chemidoc gel
system.
Hasil Penelitian
Plasmid pCambia 1301 yang mengandung 35S::OsDREB1A berukuran
sekitar 12,6 kb. Pemotongan plasmid tersebut
menggunakan enzim EcoRI
dihasilkan dua fragmen yang berukuran 11 kb dan 1,6 kb, yang masing-masing
adalah vektor biner bakcbone pCambia 1301 dan kaset pr35S:OsDREB1A::T35S (
Gambar 6). Konfirmasi ini bertujuan untuk memastikan bahwa plasmid yang akan
digunakan untuk transformasi sudah benar.
Gambar 5. Profil plasmid pCambia 1301 (11 kb) dan pr35S::OsDREB1A::T35S
(1,6 kb) yang digunakan untuk transformasi
Transformasi dilakukan sebanyak tiga kali dengan jumlah eksplan yang
sama untuk setiap periodenya. Jumlah kalus embriogenik, jumlah planlet, dan
jumlah tanaman padi putatif transgenik (T0) yang dihasilkan untuk setiap periode
transformasi ditampilkan pada Tabel 1.
18
Tabel 1. Hasil transformasi dan regenerasi tanaman padi varietas Nipponbare
putatif transgenik (T0) dengan menggunakan 35S::OsDREB1A
Transformasi
periode
1 (B)
2 (C)
3 (D)
Total
Jumlah
Eksplan
Jumlah kalus
embriogenik
Jumlah planlet
200
200
200
600
133 (66,50%)
152 (76,00%)
105 (52,50%)
390 (65,00%)
67 (63,50%)
81 (40,50%)
57 (23,50%)
205 (34,17%)
Jumlah tanaman
padi putatif
transgenik (T0)
27 (13,50%)
35 (17,50%)
19 (9,50%)
81 (13,50%)
Semua tanaman padi transgenik (T0) dianalisis secara molekuler
menggunakan PCR dengan primer HPTII. Hasil analsis memperlihatkan bahwa
semua tanaman padi transgenik menunjukkan adanya pita DNA berukuran 500 bp
yang merupakan ukuran pita DNA yang diharapkan (Gambar 6).
M 1 2 3 4 5
6
7
8
9
10 11 12 13
14 K+ K‐ 1000bp 500bp Gambar 6. Hasil amplifikasi PCR DNA 14 genotipe tanaman padi Nipponbare
putatif transgenik (T0) dengan menggunakan primer HPTII.
Tinggi tanaman padi transgenik (T0) yang berasal dari kultur jaringan
pada umumnya lebih rendah dari padi Nipponbare non-transgenik yang berasal
dari biji (Gambar 7). Tanaman padi transgenik pada umumnya inferior dibanding
tanaman padi non-transgenik untuk karakter-karakter komponen hasil, seperti
panjang malai, jumlah malai per rumpun jumlah gabah isi per rumpun, persentase
gabah hampa per rumpun, dan jumlah gabah total per rumpun (Gambar 8 – 10).
Gambar 7. Distribusi frekuensi tinggi tanaman padi transgenik (T0)
19
Gambar 8. Distribusi frekuensi rerata panjang malai per rumpun dan jumlah malai
per rumpun tanaman padi transgenik (T0)
Gambar 9. Distribusi frekuensi jumlah gabah isi per rumpun dan persentase gabah
hampa per rumpun tanaman padi transgenik (T0)
Gambar 10. Distribusi frekuensi jumlah gabah total per rumpun tanaman
transgenik (T0)
Pembahasan
Induksi kalus yang berasal dari biji padi varietas Nipponbare dilakukan
untuk menghasilkan kalus sebagai bahan transformasi (Gambar 11a). Kalus yang
telah ditransformasi dengan gen 35S::OsDREB1A ditanam pada media seleksi
yang mengandung higromisin dan mengalami perubahan warna menjadi coklat
dan putih (Gambar 11b).
20
a
b
Gambar 11. Induksi dan seleksi kalus padi Nipponbare.
a. Induksi kalus padi Nipponbare
b. Kalus padi pada media seleksi
Kalus yang berwarna putih berkembang semakin membesar, kemudian
dipindahkan pada media regenerasi
dan berkembang menjadi planlet yang
memiliki tunas dan akar (Gambar 12a). Planlet selanjutnya dipindah ke media
perakaran yang mengandung 40 mg/l higromisin dengan tujuan untuk
memperkuat perakaran dan sebagai tahap akhir seleksi. Planlet yang akarnya
berwarna putih pada media ini menunjukkan bahwa planlet tersebut benar-benar
transgenik, sedangkan berwarna coklat merupakan planlet non transgenik yang
lolos seleksi (Gambar 12b).
a
b
Gambar 12. Regenerasi kalus padi Nipponbare.
a. Kalus padi dalam media regenerasi
b. Planlet padi dalam media perakaran
Jalur regenerasi tanaman yang digunakan dalam penelitian ini adalah
embriogenesis somatik yang memiliki keuntungan bahwa tanaman transgenik
yang dihasilkan berasal dari satu sel tunggal yang tertransformasi, sehingga
mencegah terjadinya khimera. Hal ini berbeda dengan jalur organogenesis,
dimana tanaman transgenik berasal dari kumpulan sel yang sebagian
tertransformasi dan sebagian tidak.
21
Jumlah kalus embriogenik yang dihasilkan untuk setiap periode
transformasi berbeda, demikian juga untuk jumlah planlet maupun tanaman
putatif transgenik. Kalus embriogenik yang dapat menjadi plantlet dan akhirnya
menjadi tanaman transgenik pada semua periode transformasi cenderung
menurun. Jumlah tanaman transgenik yang dihasilkan berkisar 9,5 – 17,5% (Tabel
1), variasi ini mungkin disebabkan oleh kualitas eksplan yang digunakan.
Hasil amplifikasi PCR semua sampel DNA padi transgenik yang dianalisis
menggunakan primer HPTII (Gambar 6) menunjukkan bahwa semua sampel yang
dianalisis menghasilkan
fragmen
atau pita DNA berukuran 500 bp. Kaset
pr35S::HPTIIT35S terletak lebih dekat dengan Left Border dibanding kaset
pr35S::OsDREB1A::T35S pada plasmid biner yang ditransformasi ke kalus padi.
Karena integrasi T-DNA dimulai dari Right Border dan diakhiri pada Left Border,
apabila kaset pr35S::HPTII::T35S terintegrasi dalam genom padi maka
kemungkinan besar kaset pr35S::OsDREB1A::T35S juga sudah terintegrasi dalam
genom, kecuali terjadi delesi yang cukup panjang mulai dari Right Border sampai
kaset pr35S::OsDREB1A::T35S yang kemungkinannya sangat kecil. Pada
tanaman transgenik yang memberikan hasil amplifikasi yang diharapkan pada
PCR menggunakan primer HPTII kemungkinan besar juga mengandung
35S::OsDREB1A.
Tanaman padi transgenik Nipponbare 35S::OsDREB1A generasi T0 pada
umumnya lebih pendek dan menunjukkan keragaan yang lebih jelek untuk
karakter-karakter komponen hasil dibanding tanaman Nipponbare non-transgenik
yang ditanam dari biji. Kekerdilan dan keragaan yang lebih jelek ini mungkin
disebabkan oleh pengaruh dari over-ekspresi gen OsDREB1A dengan promoter
kuat
35S,
barangkali
karena
ekspresi
terus-menerus
dari
OsDREB1A
mengaktifkan ekspresi yang kuat secara terus-menerus dari gen-gen target yang
menyebabkan energi tanaman terkuras sehingga mempengaruhi pertumbuhan
tanaman. Namun hal ini masih perlu dikonfirmasi pada generasi T1, mengingat
proses transformasi tanaman menyebabkan jaringan tanaman mengalami cekaman
selama periode infeksi Agrobacterium maupun selama periode seleksi pada media
kultur jaringan, yang biasanya menyebabkan tanaman transgenik generasi T0
menunjukkan pertumbuhan yang terhambat.
22
Simpulan
1. Gen 35S::OsDREB1A dapat ditransformasikan ke genom padi Japonica
Nipponbare dengan A. tumefaciens dan seleksi higromisin.
2. Diperoleh 81 genotipe padi Nipponbare transgenik yang mengandung gen
OsDREB1A berdasarkan analisis PCR menggunakan primer HPTII
3. Secara umum tanaman padi putatif transgenik generasi T0 menunjukkan
kekerdilan dan keragaan yang lebih jelek untuk karakter-karakter
komponen hasil dibanding tanaman padi Nipponbare non-transgenik.
Daftar Pustaka
Dubouzet JG, Sakuma YZY, Ito YY, Kasuga M, Dubouzet EG, Miura ZS, Seki
M, Shinozaki K, and Shinozaki KY. 2003. OsDREB genes in rice, Oryza
sativa L., encode transcription activators that function in drought-, highsalt- and cold-responsive gene expression. Plant 33: 751–763
Gilmour SJ, Zarka DG, Stockinger EJ, Salazar MP, Houghton JM, and
Thomashow MF. 1998. Low temperature regulation of the Arabidopsis
CBF family of AP2 transcriptional activators as an early step in coldinduced COR gene expression. Plant J. 16: 433–442
Greco R, Ouwerkerk PBF, Taal AJC, Favalli C, Beguiristan T, Puigdomenech P,
Colombo L, Hoge JHC, Pereira A. 2001. Early and multiple A
transposition in rice suitable for efficient insertion mutagenesis. Plant
Molecular Biology. 67(1): 16-37.
Hsieh TT, Lee J-t, Chang Y-y, and Chan MT. 2002. Tomato Plants Ectopically
Expressing Arabidopsis CBF1 Show Enhanced Resistance to Water
Deficit Stress. Plant Physiology 130: 618–626.
Ito Y, Katsura K, Maruyama K, Taji T, Kobayashi M, Seki M, Shinozaki K, and
Yamaguchi-Shinozaki K. 2006. Functional Analysis of Rice DREB1/CBFtype Transcription Factors Involved in Cold-responsive Gene Expression
in Transgenic Rice. Plant Cell Physiol. 47(1):141-163
Kasuga M, Liu Q, Miura S, Yamaguchi-Shinozaki K, and Shinozaki K. 1999.
Improving plant drought, salt, and freezing tolerance by gene transfer of a
single stress-inducible transcription factor. Nature Biotechnology 17: 287291
23
Liu Q, Kasuga M, Sakuma Y, Abe H, Miura S, Yamaguchi-Shinozaki K,
Shinozaki K. 1998. Two transcription factors, DREB1 and DREB2, with
an EREBP/AP2 DNA binding domain separate two cellular signal
transcription pathways in drought- and low-temperature-responsive gene
expression, recspectively, in arabidopsis. Plant Cell 10: 1931-1406.
Mulyana NS. 2010. Over-ekkspresi gen OsDREB1A (Oryza sativa DehydrationResponsive Element Binding protein 1A) untuk perbaikan sifat toleran
kekeringan pada tanaman tembakau (Nicotiana tabacum L.) (skripsi).
Universutas Gajah Mada.
Oh, S-J, Song SI, Kim YS, Jang H-J, Kim SY, Kim M, Kim Y-K, Nahm BH, and
Kim J-K. 2005. Arabidopsis CBF3/DREB1A and ABF3 in transgenic Rice
increased tolerance to abiotic stress without stunting growth. Plant
Physiology Preview 11 p.
Pellegrineschi A, Reynolds M, Pacheco M, Brito RM, Almeraya R, YamaguchiShinozaki K, and Hoisington D. 2004. Stress-induced expression in wheat
of the Arabidopsis thaliana DREB1A gene delays water stress symptoms
under greenhouse conditions. Genome 47:493-500.
Shinozaki K, Yamaguchi-Shinozaki K. 2004. Plant response to stress: regulation
of plant gene expression to drought. Encyclopedia of Plant and Crop
Science. DOI:10.1081/E-EPCS 120010660, Marcel Dekker, Inc. New
York. Pp 99-101.
Shure M, Wessler S, and Fedoroff N. 1983. Molecular identification and isolation
of the Waxy locus in Maize. Cell 35:225-233.
Song J, Bradeen JM, Naess SK, Raasch JA, Wielgus SM, Haberlach GT, Liu J,
Kuang H, Austin-Phillips S, Buell CR, Helgeson JP, Jiang J. 2003. Gene
RB cloned from Solanum bulbocastanum confers broad spectrum
resistance to potato late blight. Proc Natl Acad Sci US' 100:9128-9133.