TRANSFORMASI TANAMAN PADI DENGAN GEN
advertisement
1 TRANSFORMASI TANAMAN PADI DENGAN GEN OsDREB1A MELALUI Agrobacterium tumefaciens MUHAMAD HUSNI MUBAROK DEPARTEMEN BIOKIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2016 2 3 PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA* Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Transformasi Tanaman Padi dengan Gen OsDREB1A melalui Agrobacterium tumefaciens adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Penelitian ini didanai oleh DIPA BB Biogen Tahun 2014. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini. Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor. Bogor, Oktober 2015 Muhamad Husni Mubarok NIM G84110006 4 ABSTRAK MUHAMAD HUSNI MUBAROK. Transformasi Tanaman Padi dengan Gen OsDREB1A melalui Agrobacterium tumefaciens. Dibimbing oleh DJAROT SASONGKO HS. dan ALBERTA DINAR AMBARWATI. Kekeringan, salinitas tinggi dan suhu rendah merupakan kendala abiotik yang dapat menurunkan produktivitas padi. Penggunaan varietas toleran kekeringan, salinitas tinggi dan suhu rendah merupakan alternatif yang tepat. Perakitan tanaman padi toleran kekeringan, salinitas tinggi dan suhu rendah dilakukan dengan transformasi gen OsDREB1A melalui Agrobacterium tumefaciens. Penelitian bertujuan untuk mendapatkan tanaman putatif transgenik padi Nipponbare dan IR64 yang mengandung gen OsDREB1A. Dari 410 embrio muda tanaman padi Nipponbare menghasilkan 40 (9,8%) tanaman putatif transgenik. Dari 40 tanaman putatif transgenik 28 (70%) tanaman transgenik positif mengandung gen OsDREB1A melalui analisis molekuler. Transformasi gen OsDREB1A pada 440 embrio muda tanaman padi IR64 belum berhasil mendapatkan tanaman putatif transgenik. Karakter agronomi menunjukkan bahwa 13 tanaman galur padi transgenik Nipponbare OsDREB1A generasi To mempunyai jumlah malai yang lebih banyak dibandingkan Nipponbare yang tidak mengandung OsDREB1A dan Nipponbare wild type yang ditumbuhkan dari biji. Sedangkan 6 tanaman galur padi transgenik Nipponbare OsDREB1A (To) mempunyai kisaran persentase gabah isi yang sama dengan Nipponbare wild type. Kata kunci: analisis molekuler, gen OsDREB1A, padi, transformasi. ABSTRACT MUHAMAD HUSNI MUBAROK. Transformation of rice plants with the gen OsDREB1A by Agrobacteruim tumefaciens. Supervised by DJAROT SASONGKO HS. and ALBERTA DINAR AMBARWATI Drought, high salinity, and low temperature are an abiotic constraints which can reduce rice productivity. The use of varieties tolerant to drought, high salinity and low temperature is an appropriate alternative. Development of rice tolerant to drought, high salinity, and low temperature was conducted by transforming OsDREB1A gene via Agrobacterium tumefaciens. This research aimed to obtain transgenic rice of Nipponbare and IR64 which contained OsDREB1A gene. Out of 410 immature embryos of Nipponbare obtained 40 (9,8%) transgenic putative plants, and 28 (70%) transgenic plants positively contained OsDREB1A gene through molecular analysis. Transformation of OsDREB1A gene on 440 immature embryos of IR64 had not obtain putative transgenic plants. Agronomic characters showed that 13 plants of transgenic rice Nipponbare OsDREB1A (To) had the number of panicles higher than Nipponbare without OsDREB1A and Nipponbare wild type which was grew from seed. While 6 plants of transgenic rice Nipponbare OsDREB1A (To) had percentage of filled grain in similar range to Nipponbare wild type Key words: molecular analysis, OsDREB1A gene, rice, transformation. 5 TRANSFORMASI TANAMAN PADI DENGAN GEN OsDREB1A MELALUI Agrobacterium tumefaciens MUHAMAD HUSNI MUBAROK Skripsi Sebagai salah satu syarat memperoleh gelar Sarjana Sains pada Departemen Biokimia DEPERTEMEN BIOKIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2016 6 8 PRAKATA Puji dan syukur kehadirat Allah SWT atas rahmat dan karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi yang berjudul “Transformasi Tanaman Padi dengan Gen OsDREB1A melalui Agrobacterium tumefaciens”. Penulis mengucapkan terima kasih kepada Bapak Dr Djarot Sasongko HS, MS dan Ibu Dr A Dinar Ambarwati, MSc atas bimbingan, arahan berikut kritik dan sarannya dalam penulisan skripsi ini. Secara khusus juga penulis ucapkan terima kasih kepada kedua orang tua penulis Bapak H. Saparudin dan Ibu Hj. Ikoy Rokoyah atas doa dan dorongan semangat untuk kesuksesan, kelancaran dan kemudahan jalan hidup bagi penulis. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada Bapak Dr Tri Joko Santoso, Ibu Nur, Pak Heri, Kak Mira, Kak Dina serta teman-teman dari biokimia 48 dengan kepedulian mereka sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi ini. Penulis menyadari bahwa tulisan ini belum sempurna sehingga saran dan kritik yang membangun sangat penulis harapkan. Akhir kata penulis berharap tulisan ini dapat berguna bagi penulis maupun semua pihak demi kemajuan ilmu pengetahuan. Bogor, 8 Oktober 2015 Muhamad Husni Mubarok i DAFTAR ISI DAFTAR ISI i DAFTAR TABEL ii DAFTAR GAMBAR ii DAFTAR LAMPIRAN ii PENDAHULUAN 1 BAHAN DAN METODE 2 Waktu dan Tempat Penelitian 2 Alat dan Bahan 2 Metode Penelitian 2 HASIL 6 Transformasi Embrio Muda Padi 6 Amplikon Gen OsDREB1A Tanaman Putatif Transgenik Nipponbare 8 Karakter Agronomi Tanaman Padi Nip.OsDREB1A Generasi T0 9 PEMBAHASAN 12 Transformasi Embrio Muda Padi 12 Amplikon Gen OsDREB1A Tanaman 13 Karakter Agronomi Tanaman Padi Nip.OsDREB1A Generasi T0 14 SIMPULAN 14 SARAN 14 DAFTAR PUSTAKA 15 LAMPIRAN 17 RIWAYAT HIDUP 20 ii DAFTAR TABEL 1 Transformasi embrio muda padi varietas Nipponbare dengan gen OsDREB1A melalui Agrobacteirum tumefaciens 6 2 Transformasi embrio muda padi varietas IR64 dengan gen OsDREB1A melalui Agrobacteirum tumefaciens 6 3 Karakter agronomi padi transgenik Nipponbare OsDREB1A dan non transgenik Nipponbare 9 DAFTAR GAMBAR 1 Induksi kalus dan regenerasi padi yang ditransformasi dengan gen OsDREB1A melalui A. tumefaciens 7 2 Amplikon gen OsDREB1A 8 3 Distribusi jumlah malai tanaman padi transgenik Nipponbare T0 10 4 Distribusi panjang malai tanaman padi transgenik Nipponbare T0 11 5 Distribusi gabah isi tanaman padi transgenik Nipponbare T0 11 6 Distribusi gabah hampa tanaman padi transgenik Nipponbare T0 11 DAFTAR LAMPIRAN 1 Bagan alir penelitian 18 2 Komposisi media 19 1 PENDAHULUAN Padi merupakan tanaman pangan utama bagi penduduk Indonesia, sehingga produktivitasnya perlu ditingkatkan. Berdasarkan data Badan Pusat Statistik (BPS) diketahui bahwa produksi padi, khususnya di Jawa Barat diramalkan mengalami penurunan 4.02% dibanding tahun 2014. Penurunan ramalan produksi padi tahun 2015 lebih disebabkan penurunan ramalan luas panen sebesar 6.47% (BPS 2015). Usaha untuk meningkatkan produktivitas padi masih menghadapi banyak kendala, salah satunya adalah perubahan iklim. Perubahan iklim dapat memberikan dampak yang cukup serius di antaranya karena menyebabkan peningkatan suhu bumi, meluasnya area atau lahan yang mengalami kekeringan sedangkan beberapa area lainnya terjadi genangan (terendam banjir), serta meningkatnya salinitas pada lahan-lahan di sekitar pantai akibat meluapnya air laut ke daratan dan naiknya permukaan air laut (Gorantla et al. 2005). Hasil penelitian di rumah kaca menunjukkan bahwa cekaman kekeringan dapat menurunkan hasil padi rata-rata 52.3% (Samaullah dan Darajat 2001). Kendala tersebut dapat diatasi dengan menanam varietas padi yang toleran terhadap cekaman kekeringan, salinitas tinggi, dan suhu rendah. Perakitan varietas padi toleran kekeringan dapat dilakukan melalui persilangan konvensional maupun menggunakan teknologi transformasi genetik (Suardi et al. 2004). Rekayasa genetik melalui teknik transformasi dapat diterapkan dalam perakitan tanaman padi dengan sifat-sifat tertentu yang dikehendaki. Teknik transformasi dapat dilakukan secara langsung misalnya dengan penembakan partikel, elektroporasi, PEG (polyethylene glycol) maupun secara tidak langsung melalui vektor Agrobacterium. Transformasi genetik dengan perantara Agrobacterium tumefaciens merupakan salah satu teknik transformasi yang banyak dilakukan oleh para peneliti pada tanaman padi dan telah berhasil dengan baik (Rahmawati 2006). Bakteri A. tumefaciens merupakan mikroorganisme yang berperan untuk membantu menyisipkan gen ke dalam genom tanaman, misalnya pada transformasi tanaman padi dengan gen CBF/DREB1A dan ABF3 dari Arabidobsis untuk toleransi terhadap cekaman abiotik (Oh et al. 2005). Gen Dehydration Responsive Element Binding (DREB) merupakan faktor transkripsi spesifik tanaman yang sangat penting peranannya dalam pengaturan respon tanaman dan menginduksi gen-gen lain yang berhubungan dengan cekaman abiotik (Xiong & Fei 2006). Hasil penelitian Dubouzet et al. (2003) menunjukkan bahwa over ekspresi dari gen OsDREB1A yang berasal dari genom padi pada tanaman Arabidopsis transgenik dapat menginduksi over-ekspresi gen target DREB1A, dan menghasilkan tanaman Arabidopsis yang lebih toleran terhadap cekaman kekeringan, salinitas tinggi, dan suhu rendah. Gen-gen berbasis DREB yang telah diisolasi oleh Dubouzet et al. (2003) dari genom padi adalah OsDREB1A, OsDREB1B, OsDREB1C, OsDREB1D, dan OsDREB2A. Tanaman padi subspesies Japonica yang ditransfomasi dengan 35S::OsDREB1A memperlihatkan lebih toleran terhadap kekeringan (Ito et al. 2006). Sedangkan pada tanaman padi subspesies Indica belum berhasil ditransformasikan karena kemampuan regenerasi setelah ditransformasi masih rendah. Dewi (2003) melaporkan bahwa kandungan poliamin kalus padi subspesies indica lebih rendah dibandingkan dengan 2 subspesies japonica, sebaliknya kandungan ACC (1-aminosiklopropana-1karboksilat) dan aktivitas ACC oksidase padi subspesies indica lebih tinggi. Diduga hal tersebut yang menyebabkan padi spesies indica lebih sulit beregenerasi daripada japonica. Beberapa contoh varietas padi yang termasuk dalam subspesies Japonica adalah Nipponbare, Taipei 309, dan contoh varietas padi yang termasuk dalam subspesies Indica adalah IR64, IR8. Diperolehnya tanaman transgenik padi yang mengandung gen OsDREB1A dapat digunakan sebagai sumber plasma nutfah padi toleran terhadap kekeringan, salinitas tinggi dan suhu rendah. Secara garis besar penelitian ini terdiri atas 3 tahapan utama, yaitu tahap persiapan eksplan tanaman padi dan biakan bakteri A. tumefaciens, selanjutnya adalah transformasi, dan diakhiri dengan analisis molekuler tanaman putatif transgenik hasil transformasi. Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan tanaman transgenik padi Nipponbare atau IR64 yang mengandung gen OsDREB1A. BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian dilakukan di Laboratorium Biologi Molekuler, Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian pada bulan Januari 2015 sampai September 2015. Alat dan Bahan Alat yang diguanakan adalah kabinet ESCO laminar air flow model AHC4A1/LA2-4A1, pinset, sudip, kain penyaring, mikroskop, alat gelas, Lab-Line shaker inkubator 3591-1, sentrifus berpendingin Hitachi Himac CF15R High Speed Microcentrifuge, Vortex Genie 2, cawan Petri, perangkat spektrofotometer CO 8000 Biowave Cell Densitymeter, mesin PCR Bio-Rad T100, pipet mikro Gilson, Eppendorf AG Multipette Plus, perangkat elektroforesis gel agarosa Mupid-exU, marker 1kb plus, dan ChemiDoc EQ Bio-Rad. Bahan tanaman yang digunakan ialah padi varietas Nipponbare dan IR64. Transformasi menggunakan bakteri A. tumefaciens pembawa konstruk gen OsDREB1A. Bahan-bahan kultur in-vitro seperti media Murashige & Skoog (MS) meliputi media A201, A202, A203, A204, A205 dan PM140 dengan pemberian antibiotik kanamisin, rifampisin dan higromisin serta asetosiringon. Bahan-bahan untuk analisis molekuler tanaman putatif transgenik menggunakan mix PCR dengan primer 35S F (5’-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3’) dan primer OsDREB1A R (5’-ACAGTCGACACTTGTTCCATCACATTACCGA-3’). Metode Penelitian Persiapan Tanaman untuk Sumber Eksplan (Apriana et al. 2013) Padi dikecambahkan dengan cara disemai pada cawan Petri yang berisi kertas saring yang sudah diberi air dan didiamkan hingga berkecambah. 3 Kecambah dipindahkan ke dalam pot berisi tanah/lumpur yang mengandung pupuk di rumah kaca dan dipelihara secara optimal. Biji padi berumur 8-12 hari setelah antesis digunakan sebagai sumber eksplan. Biji dikupas dan disterilkan menggunakan alkohol 70% selama 10 detik dan direndam dalam 20% pemutih komersial selama 5 menit. Setelah itu dicuci dengan akuades steril sebanyak 6 kali. Persiapan Bakteri Agrobacterium tumefaciens (Apriana et al. 2013) Vektor A. tumefaciens yang digunakan untuk transformasi berasal dari koloni tunggal yang ditumbuhkan selama 1-2 hari di media LB cair. Dari suspensi bakteri tersebut kemudian diambil 5 µL ke media LB cair 5 mL yang mengandung antibiotik kanamisin 5 mg/L dan rifampisin 20 mg/L. Bakteri kemudian diinkubasi pada suhu 28 oC dengan shaker selama 1-2 hari. Suspensi bakteri diambil dengan ose dan dioleskan pada media AB padat yang mengandung kanamisin 5 mg/L dan rifampisin 20 mg/L kemudian diinkubasi pada suhu 28oC selama 3 hari. Sebelum digunakan untuk transformasi, bakteri dilarutkan dalam media A200 cair dengan menambah asetosiringon 1M sebanyak 2 µL, kemudian diukur OD600 dengan spektrofotometer. Kepadatan sel bakteri yang digunakan untuk transformasi adalah mencapai OD600= 0.3 (0.9-1.5×109 sel/ml). Transformasi Embrio Muda Padi (Hiei & Komari 2006) Biji padi yang sudah disterilkan, diambil embrio mudanya dengan menggunakan pinset. Eksplan diletakkan pada cawan Petri yang berisi media A201. Transformasi dilakukan dengan cara eksplan embrio muda ditetesi suspensi bakteri A. tumefaciens::pCAMBIA1301 yang telah disuspensikan dalam media A200 cair dengan penambahan asetosiringon 1M sebanyak 2 µL. Kultur diinkubasi di ruang gelap dengan suhu 25oC selama 7 hari. Plasmid pCAMBIA 1301 mengandung hptII (gen yang menyandi antibiotik higromisin) dan gen gus (gen yang menyandikan enzim β-glucuronidase). Setelah 7 hari diinkubasi, embrio muda berkecambah, kemudian kecambah dipotong/dihilangkan. Embrio muda dikeringkan sebanyak 3 kali menggunakan kertas saring, kemudian dipindahkan ke media seleksi (A203) dan diinkubasi selama 10 hari di ruang terang pada suhu 28-30oC. Kalus yang tumbuh dipotong menjadi 4 bagian kemudian dipindahkan ke media seleksi (A203) dan kultur diinkubasi selama 10 hari di ruang terang pada suhu 28-30oC. Kalus dipindahkan lagi ke media seleksi (A203) dan diinkubasi selama 10 hari di ruang terang pada suhu 28-30oC. Media seleksi A203 mengandung higromisin 30 mg/L. Untuk padi subspesies Indica sebelum dipindahkan ke media seleksi, embrio perlu dipindahkan terlebih dahulu ke media resting (A202). Kalus yang berhasil lolos di media seleksi kemudian dipindahkan ke media pre-regenerasi (A204) yang mengandung higromisin 30 mg/L dan dikulturkan selama 10 hari. Kalus yang dapat tumbuh dimedia pre-regenerasi (A204) kemudian dipindah ke media regenerasi (A205) yang mengandung higromisin 30 mg/L dan dikulturkan hingga muncul tunas hijau. Tunas dipindahkan ke media perakaran (PM140) yang mengandung higromisin 40 mg/L selama beberapa hari sampai tanaman berakar. Tunas yang sudah berakar 4 diaklimatisasi dengan media air. Tanaman dengan perakaran yang kuat dipindahkan ke pot berisi tanah berlumpur dan dipelihara di rumah kaca. Analisis Molekuler Tanaman Putatif Transgenik Isolasi DNA Padi (Doyle & Doyle 1990) Sampel yang digunakan untuk isolasi adalah daun padi. Terlebih dahulu daun padi dipanen dengan mengambil daun padi yang masih muda. Daun padi kemudian dimasukkan ke dalam tabung Eppendorf yang telah diberi label dan ditempatkan didalam cool box. Daun padi selanjutnya digerus dengan nitrogen cair supaya daun membeku, kemudian dihaluskan dengan menggerus daun dengan sumpit didalam tabung tersebut. Daun yang sudah halus kemudian ditambah dengan buffer CTAB 1000 µL. Buffer CTAB dengan kandungan garam yang tinggi dapat memisahkan polisakarida dari dinding sel. Tahap selanjutnya dilakukan proses inkubasi selama 15 menit didalam penangas air dengan suhu 65oC. Tahapan ini dilakukan untuk mengoptimalkan kerja buffer ekstrak yang ditambahkan ke dalam sampel. Sebanyak 100 µL Naasetat dan 1000 µL larutan Chisam ditambahkan ke dalam suspensi, selanjutnya disentrifus selama 5 menit dengan kecepatan 12000 rpm. Na-asetat adalah senyawa yang berikatan dengan debris sel dan protein sehingga membentuk senyawa kompleks dengan CTAB-potassium asetat-protein-debris sel. Suspensi bagian atas kemudian dipisahkan ke dalam tabung Eppendorf baru yang telah diberi label. Selanjutnya ditambahkan Na-asetat sebanyak 1/10 dan isopropanol sebanyak 2/3 dari rata-rata suspensi yang diambil dari hasil sentrifugasi. Penambahan isopropanol berfungsi untuk pengendapan protein dan dilanjutkan proses presipitasi DNA dengan menggunakan etanol yang berfungsi sebagai penghilang debris. Larutan kemudian disentrifus kembali dengan kecepatan 12000 rpm selama 15 menit untuk mendapatkan DNA. Setelah itu dilakukan dekantasi dan ditambahkan etanol 70% sebanyak 200 µL ke dalam tube. Suspensi kemudian disentrifus selama 5 menit dengan kecepatan 12000 rpm. Supernatan hasil sentrifus dibuang dan tube dikeringkan didalam oven 40oC selama ± 5 menit. Setelah itu ditambahkan TE-RNAse sebanyak 50 µL ke dalam tube, selanjutnya diinkubasi dengan suhu 37oC selama 30 menit didalam inkubator. Amplifikasi DNA menggunakan PCR (Sambrook & Russell 1989) DNA yang diperoleh selanjutnya diamplifikasi dengan menggunakan teknik PCR. PCR dilakukan dengan total volume 10 µL yang terdiri atas 1 µL DNA cetakan, 5 µL Mix PCR Kappa 2G, 0,5 µL DMSO (dimethyl sulfoxide), 0,5 µL primer 35S F (5’-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3’) dengan konsentrasi 5 µM, 0,5 µL primer OsDREB1A R (5’-ACAGTCGACACTTGTTCCATCACATTACCGA-3’) dengan konsentrasi 5 µM, dan 2,5 µL NF Setiap reaksi dilakukan dalam tabung mikro 200 µL. Reaksi amplifikasi dilakukan dengan program sebagai berikut: denaturasi awal pada suhu 95 ºC selama 3 menit sebanyak 1 siklus, dilanjutkan dengan 35 siklus pada suhu 94 ºC selama 1 menit, annealing (penempelan primer) pada suhu 55 ºC selama 1 menit, dan extension (pemanjangan primer) pada suhu 72 oC selama 1 menit 30 detik. Selanjutnya pemanjangan primer terakhir selama 15 menit pada suhu 72 oC. 5 Produk PCR (amplikon) kemudian dielektroforesis dengan menggunakan gel agarosa 1%. Elektroforesis Gel Agarosa (Sambrook & Russell 1989) Gel agarosa 1% dibuat dengan melarutkan 0.2 g agarosa dengan 20 mL buffer TAE 1x. Agarosa dipanaskan dengan microwave selama 1-2 menit. Agarosa yang telah larut didinginkan dengan air mengalir hingga uap yang dihasilkan hilang dan dituangkan ke cetakan agar. Gel agarosa yang memadat dimasukkan ke dalam tangki elektroforesis yang telah diisi bufer TAE 1x. Produk amplifikasi PCR sebanyak 5 µL ditambahkan dengan 1 µL gelRed dan dicampur. Campuran tersebut dimasukkan ke dalam sumur gel. Marker yang digunakan untuk melihat ukuran DNA yakni 1 kb plus ladder sebanyak 3 µL dicampur dengan 1µL loading dye yang dicampur dengan gelRed. Tahap selanjutnya sampel DNA dialiri arus dengan voltase 100 volt selama 25 menit dan gel agarosa divisualisasi dengan UV Illuminator ChemiDoc EQ Biorad. Setelah divisualisasi pita DNA yang dihasilkan dicek ukuran pasang basanya. Pengamatan Karakter Agronomi Tanaman Padi Nipponbare-OsDREB1A dan IR64-OsDREB1A generasi T0 (IRRI 1996) Tanaman padi Nipponbare-OsDREB1A diamati penampilan fenotipiknya. Parameter yang diamati di antaranya adalah (1) jumlah malai, (2) panjang malai, (3) jumlah gabah isi, dan (4) jumlah gabah hampa. Hasilnya dibandingkan dengan tipe Nipponbare wildtype 6 HASIL Transformasi Embrio Muda Padi Transformasi merupakan suatu teknik untuk mengintroduksi atau menyisipkan fragmen DNA ke sel inang yang diinginkan. Gen OsDREB1A disisipkan ke tanaman padi varietas Nipponbare dan IR64 menggunakan transformasi melalui A. tumefaciens. Hasil transformasi pada kedua varietas padi tersebut disajikan pada Tabel 1 dan 2. Transformasi dilakukan sebanyak tiga kali untuk setiap varietas dengan jumlah eksplan yang berbeda setiap periodenya. Transformasi padi varietas Nipponbare dilakukan pada 410 eksplan embrio muda (Tabel 1). Seleksi kalus dilakukan sebanyak 3 kali pada media A203, dan persentase kalus yang tahan sampai seleksi ketiga semakin berkurang, berturutturut dari 57.8%, 46.3% dan 45.1%. Transformasi menghasilkan 148 (36.1%) kalus yang membentuk spot hijau dan dapat beregenerasi menghasilkan 40 (9.8%) planlet/tanaman. Transformasi padi varietas IR64 dilakukan pada 440 eksplan embrio muda (Tabel 2). Seperti halnya transformasi pada Nipponbare, jumlah kalus yang tahan sampai seleksi ketiga juga semakin berkurang, berturut-turut dari 43.2%, 42.7% dan 40.9%. Transformasi menghasilkan 8 (1.8%) kalus dengan spot hijau, namun belum dapat beregenerasi membentuk planlet. Tabel 1 Transformasi embrio muda padi varietas Nipponbare dengan gen OsDREB1A melalui Agrobacteirum tumefaciens Jumlah kalus yang tahan Jumlah Jumlah kalus pada media seleksi kalus beregenerasi spot hijau (bertunas) 1 2 3 1 125 62 60 55 2 170 128 100 100 131 40 3 115 47 30 30 17 237 190 185 148 40 410 Total (57.8) (46.3) (45.1) (36.1) (9.8) Angka dalam kurung menyatakan persentase terhadap jumlah eksplan Transformasi Jumlah eksplan Jumlah planlet 40 40 (9.8) Tabel 2 Transformasi embrio muda padi varietas IR64 dengan gen OsDREB1A melalui Agrobacteirum tumefaciens Transform asi 1 2 3 Jumlah eksplan 125 170 145 Jumlah kalus media resting Jumlah kalus yang tahan pada media seleksi 1 2 3 Jumlah kalus spot hijau 80 70 69 69 80 50 50 50 57 70 69 69 8 217 190 188 180 8 Total 440 (49.3) (43.2) (42.7) (40.9) (1.8) Angka dalam kurung menyatakan persentase terhadap jumlah eksplan Jumlah kalus beregenerasi (bertumas) Jumlah planlet - - - - Proses transformasi pada tanaman padi dari berbagai tahapan yang dilakukan ditunjukkan oleh Gambar 1 dengan waktu kurang lebih 3 bulan untuk menghasilkan tunas. Gambar 1A menunjukkan eksplan embrio muda yang tumbuh menghasilkan kecambah, sedangkan pada Gambar 1B kalus-kalus 7 embriogenik yang dapat tumbuh di media seleksi higromisin 30 mg/L. Gambar 1C menunjukkan adanya spot hijau pada kalus embriogenik yang selanjutnya menghasilkan tunas (Gambar 1D). Tunas dipindah ke media perakaran (Gambar 1E) dan menghasilkan tunas yang memiliki akar. Gambar 1F merupakan tanaman padi saat aklimatisasi dalam media air sebelum ditanam dan dipelihara di rumah kaca (Gambar 1G) hingga menghasilkan benih (Gambar 1H). A B D E G C F H Gambar 1 Induksi kalus dan regenerasi padi yang ditransformasi dengan gen OsDREB1A melalui A. tumefaciens. (A) Eksplan embrio muda di media Ko-kultivasi (A201); (B) Kalus embriogenik di media seleksi higromisin 30 mg/L (A203); (C) Embrio somatik di media Preregenerasi (A204) dengan higromisin 30 mg/L; (D) Regenerasi tunas di media regenerasi (A205) dengan higromisin 30 mg/L; (E) Planlet di media perakaran (PM140) dengan higromisin 40 mg/L; (F) Aklimatisasi tanaman putatif transgenik di media air; (G) Aklimatisasi tanaman putatif transgenik OsDREB1A di rumah kaca; (H) Tanaman putatif transgenik yang sudah menghasilkan benih. 8 Amplikon Gen OsDREB1A Tanaman Putatif Transgenik Nipponbare Semua (40) tanaman putatif transgenik Nipponbare dianalisis secara molekuler menggunakan PCR dengan primer 35S F dan primer OsDREB1A R. DNA padi hasil isolasi dilakukan amplifikasi dengan PCR sehingga menghasilkan amplikon gen OsDREB1A yang selanjutnya dielektroforesis dan divisualisasikan pada Gambar 2. Hasil menunjukkan bahwa dari 40 tanaman putatif transgenik dihasilkan 28 (70%) tanaman yang positif mengandung gen OsDREB1A. Tanaman yang positif mengandung gen OsDREB1A memiliki ukuran pita sebesar 1600 pb. M P W 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 12000 pb 5000 pb 2000 pb 1650 pb 1600 pb 1000 pb 850 pb 650 pb 500 pb 400 pb 300 pb 200 pb 100 pb M P W 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 12000 pb 5000 pb 2000 pb 1650 pb 1600 pb 1000 pb 850 pb 650 pb 500 pb 400 pb 300 pb 200 pb 100 pb M P W 35 36 37 38 39 40 1600 pb Gambar 2 Elektroforegram gen OsDREB1A pada 40 genotipe tanaman padi sNipponbare putatif transgenik (T0) dengan menggunakan primer 35S F dan OsDREB1A R. M = Marker 1kb plus; P = Kontrol + (Plasmid OsDREB1A); W = Kontrol – (DNA Nipponbare wild type); 140 = Nip.OsDREB1A 9 Karakter Agronomi Tanaman Padi Nip.OsDREB1A Generasi T0 Tanaman padi Nip.OsDREB1A tidak hanya dianalisis secara molekuler tetapi juga diamati penampilan fenotipiknya di rumah kaca, yaitu karakter jumlah malai, panjang malai (cm), serta persentase gabah isi dan gabah hampa per malai. Selain itu juga dilakukan pengamatan untuk tanaman Nipponbare yang tidak membawa gen OsDREB1A. Hasil pengamatan disajikan pada Tabel 3. Sedangkan distribusi kisaran jumlah malai, panjang malai, persentase gabah isi dan persentase gabah hampa disajikan pada Gambar 3, 4, 5, dan 6. Tabel 3 Karakter agronomi tanaman padi transgenik Nipponbare OsDREB1A dan non transgenik Nipponbare Panjang % Gabah ∑Gabah ∑Gabah Malai Isi/ Isi/Malai Hampa/Malai (cm) Malai % Gabah Hampa/ Malai Galur/Varietas Jumlah Malai Nip.OsDREB1A 1 54 12.87 16.95 12.33 57.89 42.11 Nip.OsDREB1A 2 12 13.68 7.85 29.85 20.82 79.18 Nip.OsDREB1A 3 38 13.59 22.36 8.44 72.61 27.39 Nip.OsDREB1A 4 49 12.66 15.50 10.78 58.99 41.01 Nip.OsDREB1A 5 21 14.31 9.00 27.82 24.44 75.56 Nip.OsDREB1A 6 20 13.58 21.57 10.19 67.92 32.08 Nip.OsDREB1A 7 17 12.62 17.28 9.94 63.47 36.53 Nip.OsDREB1A 8 5 9.57 12.00 5.33 69.2 30.77 Nip.OsDREB1A 9 6 10.16 13.14 6.71 66.19 33.81 Nip.OsDREB1A 10 3 5.30 6.50 2.75 70.27 29.73 Nip.OsDREB1A 11 6 8.21 9.86 4.00 71.13 28.87 Nip.OsDREB1A 12 14 8.75 9.07 5.33 62.96 37.04 Nip.OsDREB1A 13 12 9.63 14.00 4.54 75.52 24.48 Nip.OsDREB1A 15 4 10.46 7.00 14.20 33.02 66.98 Nip.OsDREB1A 16 5 7.65 7.00 4.33 61.76 38.24 Nip.OsDREB1A 17 8 9.02 10.00 6.11 62.07 37.93 Nip.OsDREB1A 18 29 11.23 11.73 10.43 52.93 47.07 Nip.OsDREB1A 19 24 11.39 15.08 7.36 67.20 32.80 Nip.OsDREB1A 20 13 10.46 13.71 4.29 76.19 23.81 Nip.OsDREB1A 21 4 9.95 13.50 3.75 78.26 21.74 Nip.OsDREB1A 22 3 11.00 8.75 12.25 41.67 58.33 Nip.OsDREB1A 23 10 13.47 10.73 23.18 31.64 68.36 Nip.OsDREB1A 25 10 11.55 8.82 14.45 37.89 62.11 Nip.OsDREB1A 28 4 7.88 8.40 6.40 56.76 43.24 10 Lanjutan Tabel 3... Jumlah Malai Panjang Malai (cm) ∑Gabah Isi/Malai ∑Gabah Hampa/ Malai % Gabah Isi/Malai % Gabah Hampa/ Malai Nip.OsDREB1A 29 4 8.48 7.40 7.40 50.00 50.00 Nip.OsDREB1A 30 14 11.49 13.07 10.67 55.06 44.94 Nip.OsDREB1A 31 5 8.60 9.33 4.17 69.14 30.86 Nip.OsDREB1A 33 2 7.80 7.67 4.00 65.71 34.29 Nip.(-)OsDREB1A 5 9.66 11.63 8.36 58.18 41.82 Nip.wild type 9 14-21 43.67 15.67 73.59 26.41 Galur/Varietas Keterangan: Nip. OsDREB1A: Nipponbare positif mengandung gen OsDREB1A, Nip.(-) OsDREB1A: Nipponbare tidak mengandung gen OsDREB1A, Nip.wild type: Nipponbare tidak ditransformasi (ditumbuhkan dari biji). Secara umum dapat dilihat pada Tabel 3 terdapat 3 galur tanaman Nipponbare generasi To yang mengandung gen OsDREB1A (Nip.OsDREB1A 1, 4 dan 28) mempunyai persentase gabah isi yang hampir sama (kisaran 56.76 – 58.99%) dengan Nipponbare yang tidak mengandung OsDREB1A (58.18%). Enam belas (16) galur tanaman Nipponbare yang mengandung gen OsDREB1A mempunyai persentase gabah isi yang lebih tinggi (kisaran 61.76 – 78.26%) dibandingkan Nipponbare yang tidak mengandung gen OsDREB1A. Nipponbare OsDREB1A 13, 20, dan 21 mempunyai persentase gabah isi yang lebih tinggi dibandingkan Nipponbare wild type yang ditanam dari biji. Padi transgenik Nipponbare OsDREB1A rata-rata mempunyai panjang malai 9 – 14.31 cm atau dalam kisaran padi Nipponbare non transgenik. Nip.(-)OsDREB1A Nip.Wildtype Gambar 3 Distribusi jumlah malai tanaman padi transgenik Nipponbare T0 11 Nip.Wildtype Nip.(-)OsDREB1A (cm) Gambar 4 Distribusi panjang malai tanaman padi transgenik Nipponbare T0 Nip.Wildtype Nip.(-)OsDREB1A Gambar 5 Distribusi persentase gabah isi tanaman padi transgenik Nipponbare T0 Nip.Wildtype Nip.(-)OsDREB1A Gambar 6 Distribusi persentase gabah hampa tanaman padi transgenik Nipponbare T0 12 Berdasarkan hasil distribusi jumlah malai tanaman padi transgenik Nipponbare T0 diperoleh 17 tanaman yang memiliki jumlah malai berkisar 1-10 malai (Gambar 3), dua di antaranya adalah tanaman Nipponbare yang tidak mengandung gen OsDREB1A dan Nipponbare wild type yang ditanam dari biji, sedangkan 15 tanaman lainnya merupakan tanaman transgenik Nipponbare yang mengandung gen OsDREB1A. Tiga belas tanaman Nip.OsDREB1A lainnya terdapat pada kisaran jumlah malai yang bervariasi, yaitu pada kisaran 11-20 terdapat 7 tanaman, 21-30 terdapat 3 tanaman, dan 31-40; 41-50; 51-60 masingmasing terdapat 1 tanaman. Hasil distribusi panjang malai tanaman padi transgenik Nipponbare T0 (Gambar 4) diperoleh 13 tanaman yang memiliki panjang malai pada kisaran 1-10 cm, 1 di antaranya merupakan tanaman Nipponbare yang tidak mengandung gen OsDREB1A sedangkan tanaman lainnya merupakan tanaman Nip.OsDREB1A. Tujuh belas tanaman lainnya berada pada kisaran panjang malai 11-20 cm, 1 di antaranya merupakan tanaman Nipponbare wild type yang ditanam dari biji dan 16 tanaman lainnya merupakan tanaman Nip.OsDREB1A. Hasil distribusi persen gabah isi tanaman padi Nipponbare T0 (Gambar 5) diperoleh 6 tanaman Nip.OsDREB1A yang memiliki kisaran persen gabah isi terbanyak yaitu 71-80%, tanaman Nipponbare wild type juga memiliki kisaran persen gabah isi pada 71-80%. Sedangkan tanaman padi Nip.(-)OsDREB1A berada pada kisaran 51-60%. Gambar 5 menunjukkan bahwa terdapat 16 tanaman Nip.OsDREB1A yang memiliki kisaran persen gabah isi yang lebih besar dibandingkan dengan kisaran Nip.(-)OsDREB1A. Hasil distribusi persen gabah hampa tanaman padi Nipponbare T0 (Gambar 6) diperoleh 6 tanaman Nip.OsDREB1A yang memiliki kisaran gabah hampa terkecil yaitu 21-30%, sama dengan Nipponbare wild type. Kisaran gabah hampa terbesar 71-80% diperoleh 2 tanaman, yaitu Nip.OsDREB1A 2 dan 5. Tanaman Nip.(-)OsDREB1A berada pada kisaran 41-50%. PEMBAHASAN Transformasi Embrio Muda Padi Embrio muda padi diinduksi dalam media ko-kultivasi (A201) untuk menghasilkan kalus sebagai bahan transfromasi (Gambar 1A). Kalus yang telah ditransformasi dengan gen OsDREB1A dikulturkan di media seleksi (A203) yang mengandung higromisin 30 mg/L. Kalus yang tidak tahan pada media seleksi higromisin berubah warnanya menjadi coklat dan bersifat non embriogenik. Kalus yang berwarna putih kekuningan merupakan kalus yang embriogenik dan tahan terhadap higromisin (Gambar 1B) sehingga dapat berkembang. Selanjutnya kalus tersebut dipindahkan ke media pre-regenerasi (A204) dan tumbuh menghasilkan spot hijau (Gambar 1C). Kalus yang menghasilkan spot hijau dipindah ke media regenerasi (A205) dan menghasilkan tunas (Gambar 1D). Tunas hijau selanjutnya ditumbuhkan di media perakaran (PM140) (Gambar 1E), yang masih mengandung higromisin 40 mg/L, sehingga diharapkan tunas yang dapat lolos dan membentuk akar adalah planlet (tanaman) yang benarbenar terseleksi. Dalam penelitian ini terdapat dua macam planlet yang berkembang, yaitu planlet yang berakar putih dan planlet yang berakar coklat. 13 Pada umumnya, planlet yang akarnya berwarna coklat akan mati. Planlet tersebut kemungkinan berasal dari kalus yang tidak mengalami transformasi dan akhirnya mati dalam media perakaran atau pada waktu aklimatisasi. Menurut Santosa et al. (2011) planlet yang akarnya berwarna putih sebagian besar dapat hidup menjadi tanaman, namun ada juga yang mati. Planlet yang memiliki akar kuat selanjutnya diaklimatisasi di media air yang bertujuan agar tanaman dapat beradaptasi sebelum nantinya ditumbuhkan di media tanah. Transformasi pada varietas Nipponbare menghasilkan 40 (9.8%) tanaman putatif transgenik dari 410 total eksplan yang ditransformasi, sedangkan pada varietas IR64 tidak diperoleh tanaman transgenik tetapi hanya diperoleh kalus spot hijau. Tranfromasi melalui A. tumefaciens pada padi subspesies Japonica menunjukkan efisiensi transformasi lebih tinggi 10-20% (Saika et al. 2011; Apriana et al. 2011) jika dibandingkan dengan subspesies Indica 2.5-10% (Hiei & Komari 2006). Belum berhasilnya kalus spot hijau beregenerasi menjadi tunas pada kalus IR64 dipengaruhi oleh beberapa faktor. Menurut Opabode (2006), keberhasilan transformasi tanaman padi dipengaruhi oleh beberapa faktor seperti genotipe tanaman, komposisi media dan suhu lingkungan. Sedangkan menurut Purnamaningsih (2006), daya regenerasi kalus membentuk tunas sangat ditentukan oleh waktu pemindahan kalus ke media regenerasi. Tanaman padi subspesies Japonica lebih responsif ditransformasi dibandingkan padi subspesies Indica. Hasil tersebut sesuai dengan data yang dilaporkan Purnamaningsih (2006) bahwa padi subspesies Japonica memiliki daya regenerasi lebih tinggi dibandingkan padi subspesies Indica. Hal ini yang diduga menyebabkan subspesies Japonica lebih responsif ditransformasi dibandingkan padi subspesies Indica Menurut Apriana et al. (2013) keberhasilan transformasi pada tanaman padi melalui A. tumefaciens dipengaruhi oleh beberapa faktor yaitu, genotipe tanaman, strain Agrobacterium, kondisi infeksi dan ko-kultur, antibiotik untuk eliminasi Agrobacterium, serta media induksi, ko-kultivasi dan regenerasi. Amplikon Gen OsDREB1A Tanaman Hasil amplifikasi PCR untuk semua sampel DNA padi putatif transgenik Nipponbare menggunakan primer 35S F dan primer OsDREB1A R menunjukkan bahwa sampel yang positif mengandung gen OsDREB1A menghasilkan fragmen atau pita DNA berukuran 1600 pb (Gambar 2). Ukuran pita yang dihasilkan ini sudah tepat, sesuai dengan ukuran pita yang dihasilkan oleh DNA Plasmid OsDREB1A. Menurut Santosa (2011) gen OsDREB1A beserta promotor 35S berukuran 1600 pb. Terdapat 28 tanaman padi transgenik yang positif membawa gen OsDREB1A, hal ini ditunjukkan dengan pita DNA yang terbentuk berukuran 1600 pb, sedangkan 12 tanaman lainnya negatif karena tidak membawa gen OsDREB1A dengan tidak terbentuknya pita DNA berukuran 1600 pb. Tidak terbentuknya pita ini disebabkan oleh primer yang digunakan merupakan primer spesifik gen 35S:OsDREB1A, sehingga jika pada sampel tidak terdapat gen OsDREB1A maka primer tersebut tidak akan mengamplifikasi sampel dan tidak akan terbentuk pita yang diinginkan. Penyebab lainnya dapat disebabkan pada saat proses transformasi kalus tersebut tidak menyentuh media atau hanya menyentuh media sebagian sehingga diperoleh kalus yang lolos dari tahap seleksi (escape) padahal kalus tersebut tidak mengandung gen yang diinginkan sehingga 14 ketika dianalisis molekuler tidak didapatkan pita yang diinginkan. Tingginya jumlah tanaman escape dapat disebabkan oleh sistem seleksi yang digunakan kurang efektif, penyisipan gen yang tidak sempurna, atau gen yang ditransfer tidak stabil terintegrasi di dalam genom tanaman dan hilang selama proses pembelahan sel (Saini et al. 2003). Karakter Agronomi Tanaman Padi Nip.OsDREB1A Generasi T0 Tanaman Nipponbare generasi T0 yang mengandung gen OsDREB1A umumnya memiliki persentase gabah isi yang lebih tinggi dibandingkan Nipponbare yang tidak mengandung gen OsDREB1A dan Nipponbare wild type yang ditanam dari biji. Padi transgenik Nipponbare OsDREB1A rata-rata memiliki panjang malai 9-14,21 cm atau dalam kisaran padi Nipponbare non transgenik. Hal ini menunjukkan bahwa proses transformasi tanaman menyebabkan jaringan tanaman mengalami cekaman selama periode infeksi Agrobacterium maupun selama periode seleksi pada media kultur jaringan (Santosa 2011). Namun demikian tanaman transgenik Nip.OsDREB1A menunjukkan karakter agronomi yang sama dengan atau lebih baik dibandingkan dengan padi Nip.wild type. Jumlah malai padi Nip.OsDREB1A memiliki kisaran jumlah malai yang lebih besar dibandingkan dengan padi Nip.wild type. Panjang malai padi Nip. OsDREB1A memiliki kisaran panjang malai yang sama dengan padi Nip.wild type. Persentase gabah isi dan persentase gabah hampa padi Nip.OsDREB1A memiliki persentase yang sama dengan persentase gabah isi dan hampa padi Nip.wild type. Hal ini menunjukkan bahwa tanaman padi transgenik generasi T0 memiliki karakter agronomi yang hampir sama dengan padi non transgenik. SIMPULAN Transformasi gen OsDREB1A melalui A. tumefaciens pada 410 embrio muda tanaman padi Nipponbare menghasilkan 40 (9,8%) tanaman putatif transgenik. Dari 40 tanaman putatif transgenik yang dianalisis molekuler menghasilkan 28 (70%) tanaman transgenik Nipponbare positif mengandung gen OsDREB1A. Transformasi gen OsDREB1A pada 440 embrio muda tanaman padi IR64 belum berhasil mendapatkan tanaman putatif transgenik. Tiga belas (13) tanaman padi transgenik Nipponbare OsDREB1A T0 mempunyai jumlah malai yang lebih banyak dibandingkan Nipponbare yang tidak mengandung OsDREB1A dan Nipponbare wild type yang ditumbuhkan dari biji, 16 tanaman berada pada kisaran panjang malai yang sama dengan Nipponbare wild type dan 6 tanaman dengan kisaran persentase gabah isi yang sama dengan Nipponbare wild type. SARAN Perlu dilakukan analisis ekspresi gen OsDREB1A pada tanaman padi transgenik Nipponbare terhadap cekaman kekeringan, salinitas tinggi atau suhu rendah, dan perlu dilakukan analisis stabilitas integrasi gen OsDREB1A. 15 DAFTAR PUSTAKA Apriana A, Toto H, dan Ahmad D. 2013. Optimasi sistem regenerasi dan transformasi padi varietas elit Indonesia. J. AgroBiogen. 9(1):1-10. [BPS] Badan Pusat Statistik. 2015. Produksi Padi, Jagung, dan Kedelai (Angka Ramalan II Tahun 2015). Bandung (ID): BPS. Dewi IS. 2003. Peranan fisiologis poliamin dalam regenerasi tanaman pada kultur antera padi (Oryza sativa). [Disertasi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor. Doyle JJ, Doyle JL. 1990. Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus. Moscow. 12(1):13-15. Dubouzet JG, Sakuma YZY, Ito YY, Kasuga M, Dubouzet EG, Miura ZS, Seki M, Shinozaki K, and Shinozaki KY. 2003. OsDREB genes in rice, Oryza sativa L., encode transcription activators that function in drought-, high-, salt- and cold-responsive gene expression. Plant 33:751-763. Gorantla M et al. 2005. Functional genomics of drought stress response in rice: Transcript mapping of annoted unigenes of an Indica rice (Oryza sativa L. cv. Nagina 22). Current Science. 89:469-514. Hiei Y, T Komari. 2006. Improved protocols for transformation of indica rice mediated by Agrobacterium tumefaciens. Plant Cell. 85:271-283. [IRRI] International Rive Research Institute. 1996. Standard Evaluation System of Rive. 4th ed. Los Banos (PH): IRRI. Ito Y, Katsura K, Maruyama K, Taiji T, Kobayashi M, Seki M, Shinozaki K, and Yamaguchi SK. 2006. Fuctional analysis of rice DREB1A/CBF type transcription factors involved in cold-responsive gene expression in transgenic rice. Plant Physiology 47(1):141-163. Oh SJ, Song SI, Kim YS, Jang HJ, Kim SY, Kim M, Kim YK, Nahm BH, and Kim JK. 2005. Arabidopsis CBF3/DREB1A and ABF3 in transgenic rice increased tolerance to abiotic stress without stunting growth. Plant Physiology Preview 11 p. Opabode JT. 2006. Agrobacterium-mediated transformation rapid growth and bio assays with tobacco tissues cultures. Physiol plant. 1(1):12-20. Purnamaningsih R. 2006. Induksi kalus dan optimasi regenerasi empat varietas padi melalui kultur in vitro. Jurnal AgroBiogen. 2(2):74-80. Rahmawati S. 2006. Status perkembangan perbaikan sifat genetik padi menggunakan transformasi Agrobacterium. Jurnal AgroBiogen. 2(1):3644. Saika H, W Sakamoto, M Maekawa, S Toki. 2011. Highly efficient visual selection of transgenic rice plants using green flourescent protein or anthocyanin synthetic genes. Plant Biotechnol. 28:107-110. Saini R, Jaiwal S, Jaiwal PK. 2003. Stable genetic transformation of Vigna mungo L. Hepper via Agrobacterium tumefaciens. Plant Cell Rep. 21:851-859. Samullah, M.Y. dan A.A. Darajat. 2001. Toleransi beberapa genotipe padi gogo terhadap cekaman kekeringan. Penelitian Pertanian Tanaman Pangan. 20 (1):17-23. Sambrook J, DW Russell. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Edisi 3. New York (US): Coldspring Harbor Laboratory Press. 16 Santosa B, Sobir, Sriani S, Kurniawan RT. 2011. Penyisipan gen OsDREB1A pada tanaman padi untuk regenerasi sifat toleran kekeringan. Penelitian Pertanian Tanaman Pangan. 30(2):95-100. Suardi D, Silitonga, N Abdullah, Suhartini. 2004. Evaluasi spesies padi liar toleran kekeringan. Penelitian Pertanian Tanaman Pangan. 23(1):23-27. Xiong YW, Fei SZ. 2006. Fuctional and phylogenetic analysis of a DREB/CBF like gene in Perennial ryegrass (Lolium Perenne L.) Planta 224:878-888. 17 LAMPIRAN 18 Lampiran 1 Bagan alir penelitian TAHAP PERSIAPAN Persiapan eksplan ( Nipponbare & IR64 ) Persiapan bakteri A. tumefaciens TRANSFORMASI Ko-kultivasi Resting Seleksi Pre-regenerasi Regenerasi Aklimatisasi ANALISIS MOLEKULER TANAMAN PUTATIF TRANSGENIK Isolasi DNA (Doyle & Doyle 1990) Amplifikasi DNA dengan PCR (Sambrook & Russell 1989) Elektroforesis gel agarosa (Sambrook & Russell 1989) TANAMAN TRANSGENIK PENGAMATAN KARAKTER AGRONOMI Jumlah malai Panjang malai Gabah isi Gabah hampa 19 Lampiran 2 Komposisi media Media Komposisi A200 AA salt macro, AA salt micro, AA iron, B5 vitamin A201 N6 makro 1, N6 makro 2, N6 makro 3, N6 makro 4, B5 minor 1, B5 minor 2, B5 minor 3, B5 minor 4, B5 vitamin A202 N6 makro 1, N6 makro 2, N6 makro 3, N6 makro 4, B5 minor 1, B5 minor 2, B5 minor 3, B5 minor 4, B5 vitamin A203 N6 makro 1, N6 makro 2, N6 makro 3, N6 makro 4, B5 minor 1, B5 minor 2, B5 minor 3, B5 minor 4, B5 vitamin A204 A205 PM140 Makro 1, Makro 2, Makro 3, Makro 4, Vitamin B5, Fe-EDTA MS1, MS2, MS3, MS4, Vitamin B5, Fe-EDTA MS1, MS2, MS3, MS4, Vitamin B5, Fe-EDTA 20 RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Bogor pada tanggal 1 Maret 1994 dari ayah H. Saparudin dan ibu Hj. Ikoy Rokoyah. Penulis merupakan anak kesembilan dari 9 bersaudara. Tahun 2011 penulis lulus dari SMA Insan Kamil Bogor dan pada tahun yang sama penulis lulus seleksi masuk Insitut Pertanian Bogor (IPB) dan di terima di Departemen Biokimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. Beberapa kegiatan nonakademik diikuti penulis selama masa perkuliahan, diantaranya anggota Divisi Keilmuan Biologi Molekuler di Himpunan Profesi CREBs periode 2012-2013, ketua Divisi Keilmuan Metabolisme periode 20132014, serta beberapa kegiatan kepanitiaan lainnya. Penulis pernah melaksanakan kegiatan Praktek Lapang (PL) di Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumber Daya Genetik Pertanian (BB Biogen), pada bulan JuliAgustus 2014 dengan Judul Amplifikasi Gen eui (Elongated Uppermost Internode) dari cDNA Padi dan Kloning ke pGEM-T Easy.
