BAB III METODE PENELITIAN A. Waktu dan Tempat Penelitan
advertisement
21 BAB III METODE PENELITIAN A. Waktu dan Tempat Penelitan Penelitian Laboratorium dilaksanakan mulai bulan Agustus 2015 sampai Februari 2016. Pengambilan sampel dilakukan di tiga tempat pemeliharaan Sapi Bali di Timor Tengah Selatan pada tempat pemeliharaan sapi secara semi intensif yaitu sekitar Danau Supul, penggemukan sapi di karantina sapi, dan di tempat pemeliharaan sapi secara ekstensif (liar). Isolasi, identifikasi dan karakterisasi bakteri dilaksanakan di Laboratorium Biologi Fakultas MIPA Universitas Sebelas Maret Surakarta, sedangkan sequencing DNA dilakasanakan di Laboratorium 1 st base Singapura. B. Alat Dan Bahan 1. Alat Alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain: cool box, botol sampel, kertas label, pensil, digital camera, tabung reaksi, cawan petri, gelas beker, erlemeyer, neraca analitik, hot plate, shaker, laminar air flow, autoclave, bunsen, batang pengaduk, gelas ukur, jarum ose, batang L, magnetic strirrer, kapas, alumunium foil, pipet, mikro pipet, freezer, tip, dan polymerase chain reaction (PCR), seperangkat alat elektroforesis, biophotometer, ultraviolet transilumminator (gel doc), tabung eppendorf. 2. Bahan Bahan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain: sampel kotoran Sapi Bali (Bos sondaicus) yang diambil di Timor Tengah Selatan. Medium 21 22 carboximetil celulosa (CMC), aquades, 63 forward primer, 1387 reservese primer,DNA template, gel agarose, PrestoTMMini gDNA bacterial kit (Geneaid), Kapa 2G Fast Ready Mix (Kapa Biosystem), buffer TAE 1X. C. Rancangan Penelitian Penelitian dilakukan dengan beberapa metode, yaitu: 1. Pengambilan sampel kotoran Sapi Bali Pengambilan sampel kotoran Sapi Bali di Timor Tengah Selatan berdasarkan titik sampling yang telah ditentukan, yaitu di tempat pemeliharaan sapi secara semi intensi disekitar Danau Supul, karantina sapi, dan lokasi pemeliharaan sapi secara ekstensif (liar). Penentuan titik sampling menggunakan metode porposive sampling. Sampling ditetapkan berdasarkan perbedaan tempat, perbedaan pakan dan keberadaan sampel pada masing-masing pengambilan sampel Gambar 4. : Liar : Sekitar Danau Supul : Karantina sapi Gambar 4. Peta lokasi pengambilan sampel kotoran Sapi Bali di Timor Tengah Selatan 23 Kotoran Sapi Bali yang diambil yaitu berupa kotoran sapi yang masih basah sebanyak 5-10 gr, dimasukan ke dalam botol sampel dan diberi label berisi informasi tempat pengambilan sampel. Tiap titik sampling diambil 3 jenis kotoran sapi yang diambil pada jarak yang tidak berjauhan, kemudian sampel dimasuk kedalam cool box, dibawa ke laboratorium dan disimpan dalam lemari pendingin 5oC, selama kurang lebih 12 jam dan dilakukan pengenceran sebelum diinokulasikan pada media CMC agar. 2. Sterilisasi alat dan bahan Proses sterilisasi dilakukan secara sterilisasi basah dengan autoclave dengan tekanan 1 atm dan suhu 121oC selama 20 menit. Peralatan yang disterilkan antara lain: tabung reaksi, cawan petri, gelas ukur, erlenmeyer, dan tip. Bahan yang disterilisasi yaitu aquades, media CMC, indikator red congo, dan NaCl. 3. Pembuatan media CMC dan indikator congo red Media CMC dibuat dengan mencampur 1 gr CMC, MgSO4 7H2O 0,02 gr, KNO3 0,075 gr, K2HPO4 0,05 gr, FesO4 7H2O 0,002 gr, CaCl2 0,004 gr, yeast ekstrak 0,2 gr, agar 1,8 gr, glukosa 0,1 gr ke dalam erlemeyer dan ditambahkan 100 mL aquades. Erlemeyer diletakan diatas hot plate, magnetic stirrer dimasukan kedalam elemeyer dan ditunggu sampai mendidih dan berwarna jernih. Lubang tabung erlemeyer ditutup dengan kapas dan alumunium foil, disterilkan dengan menggunakan autoclave pada suhu 121oC selama 20 menit. Kemudian media dituang kecawan petri dan disimpan pada suhu 37oC. Untuk membuat agar miring, setelah larutan mendidih dan berwarna jernih maka media CMC langsung dituang ke dalam tabung reaksi masing-masing 4 ml, kemudian lubang tabung reaksi ditutup menggunakan kapas dan autoclave pada 24 suhu 121oC selama 20 menit pada tekanan 1 atm. Setelah disterilkan tabung dimiringkan 45o hingga media mengeras. Pembuatan indikator congo red 0,1% dilakukan dengan mencampur 0,5 gr congo red ke dalam erlemeyer dan ditambahkan 100 ml aquades. Lubang tabung erlemeyer di tutup dengan kapas dan alumunium foil, disterilkan menggunakan autoclave 121oC selama 20 menit dengan tekanan 1 atm kemudian di simpan pada suhu 37oC. 4. Isolasi bakteri selulolitik dari kotoran Sapi Bali di Timor Tengah Selatan Isolasi bakteri selulolitik dilakukan dengan mengencerkan 1 gr sampel ke dalam 9 ml aquades steril secara aseptik, selanjutnya dibuat seri pengenceran sampai 10-6, kemudian dari seri pengenceran 10-4 sampai 10-6 diambil 0,1 ml dan disebarkan pada media CMC dengan teknik cawan sebar (spread plat), kemudian diinkubasi pada suhu 37oC selama 4 x 24 jam (Syulasmi et al., 2009). 5. Populasi bakteri selulolitik Pengamatan populasi bakteri selulolitik yang diinoklulasi pada media CMC dilakukan setelah masa inkubasi 4 x 24 jam, dengan metode hitung cawan yaitu cawan dengan jumlah koloni 30-300 dipilih kemudian dihitung jumlah masing-masing koloni dalam cawan berdasarkan penampakan morfologinya. 6. Koleksi kultur murni bakteri selulolitik Untuk mendapatkan kultur murni, koloni bakteri berbeda yang tumbuh pada media CMC diambil dengan ose dan digores kembali pada media miring CMC kemudian diinkubasi kembali pada suhu ruangan. 25 7. Seleksi dan uji aktivitas selulase bakteri selulolitik Isolat bakteri kultur murni pada media miring CMC ditotolkan pada cawan petri yang berisi media CMC, kemudian diinkubasi 48 jam dan setelah masa inkubasi berakhir selanjutnya dilakukan pewarnaan congo red 0,1%, didiamkan selama 15 menit dan dibilas dengan larutan NaCl 1M. Jika ada daerah bening di sekitar koloni menandakan adanya hidrolisis selulosa oleh enzim selulase (Jalgaonwala et al., 2011). 8. Isolasi DNA genom bakteri selulolitik Tahap pertama untuk mengisolasi DNA bakteri adalah bakteri ditumbuhkan dalam media cair CMC dan diinkubasi pada inkubator shaker selama 24 jam. Sebanyak 1,5 ml kultur disentrifugasi pada kecepatan 14.000 rpm. Kemudian DNA diekstrak dengan menggunakan PrestoTMMini gDNA bacterial kit (Geneaid). 9. Analisis kemurnian dan kosentrasi DNA dengan biofotometer Analisis DNA dilakukan dengan menambahkan 5 l DNA hasil isolasi ke dalam kuvet biofotometer yang berisi blanko 95 µl. Blanko biofotometer dengan kuvet berisi 1 ml aquades dibaca absorbansi sampel dengan biofotometer pada 260 nm dan 280 nm. Kualitas DNA yang berhubungan dengan kemurnian terhadap kontaminan protein dapat dilihat dari perbandingan absorbansi suspensi DNA pada panjang gelombang 260 nm terhadap 280 nm. Rasio OD 260 / OD 280 antara 1,8 – 2,0 menujukan DNA yang relatif murni dan terbebas dari kontaminan protein. Panjang gelombang yang digunakan untuk mengetahui DNA / RNA mengunakan biofotometri UV adalah 260 nm, sedangkan untuk mengetahui 26 kandungan protein menggunakan biofotometri UV dengan panjang gelombang 280 nm. 10. Amplifikasi gen penyandi 16S rRNA dengan PCR Gen penyandi 16S rRNA diamplifikasi menggunakan polymerase chain reaction (Veriti Thermal Cycler). Reaksi dilakukan dengan mencampurkan 12,5 μl Kapa 2G Fast Ready Mix (Kapa biosystem), 1,25 μl 63 forward primer (5’CAGGCCTAACACAT-GCAAGTC-3’), 1,25 μl 1387 reverse primer (5’GGCGGAWGTGTACAAGGC-3’), 2 μl DNA template dan 8 μl ddH2O. PCR dijalankan dengan profil sebagai berikut: predenaturasi pada suhu 94oC selama 2 menit, diikuti dengan 30 siklus tahap denaturasi pada suhu 94 oC selama 30 detik, penempelan primer (annealing) pada suhu 55oC selama 30 detik, elongasi 72 oC selama 1 menit, dan finalizing pada suhu 72 oC selama 5 menit. Kemudian disimpan pada suhu 4oC untuk digunakan dan diperiksa menggunakan elektoforesis (Marchesi et al., 1998). DNA di sekuensing di laboratorium 1 st base singapure. Analisis hasil sekuensing urutan basa nukleutida gen penyandi 16S rRNA diawali dengan mengsejajarkan (alignment) urutan basa DNA pengkode 16S rRNA sekuen forward (F) dan sekuen reverse (R) dengan menggunakan program bioedit contig assembly program (CAP), kemudian hasil contig dianalisis lanjut menggunakan program BLAST dan dibandingkan dengan beberapa sekuen gen penyandi 16S rRNA yang ada pada GenBank. Perbandingan dilakukan menggunakan sekuen-sekuen yang paling mirip (highly similar sequence) dan mempunyai kesamaan dengan spesies yang telah diketahui sebelumnya. Identifikasi bakteri dengan menggunakan metode gen 16S rRNA melibatkan 27 perbandingan antara hasil sekuensing yang akan diidentifikasi dengan sekuen referensi yang tersimpan di database GenBank (Waturangi et al., 2008). 11. Analisis hubungan kekerabatan Hubungan kekerabatan antar spesies bakteri selulolitik dari kotoran Sapi Bali di sekitar Danau Supul, karantina dan liar yang ditemukan dengan spesies lain yang sudah ditemukan pada penelitian-penelitian sebelumnya dianalisis dengan menggunakan sofware MEGA (Molecular Evolutionary Genetics Analysis) 7.0 pada perangkat komputer (Koichiro et al., 207). D. Analisis Data Data isolat dan data uji aktivitas bakteri selulolitik yang ditandai dengan terbentuknya zona bening ketika ditambahkan congo red 0,1% kemudian diamati secara deskriptif. Amplikon hasil amplifikasi gen penyandi 16S rRNA diperiksa dan dianalisis dengan melihat adanya pita-pita pada gel elektroforesis. Sekuen gen penyandi 16S rRNA dianalisis dengan bioinformatika untuk mendapatkan data identifikasi spesies bakteri selulolitik. Sekuen gen penyandi 16S rRNA yang diperoleh dianalisis menggunakan perangkat BLAST pada NCBI untuk melihat kemiripan bakteri yang bakt. Hubungan kekerabatan dianalisis dengan menggunakan sofware MEGA 7.0 untuk mendapatkan struktur pohon phylogenetic yang menggambarkan hubungan kekerabatan bakteri selulolitik kemudian dianalisis secara deskriptif.
