PERAKITAN VEKTOR EKSPRESI PROTEIN G SUBUNIT α DARI

PERAKITAN VEKTOR EKSPRESI PROTEIN G SUBUNIT α DARI
KEDELAI (Glycine max) KULTIVAR SLAMET
RIAN PRATIWI
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2012
PERAKITAN VEKTOR EKSPRESI PROTEIN G SUBUNIT α DARI
KEDELAI (Glycine max) KULTIVAR SLAMET
RIAN PRATIWI
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2012
ABSTRAK
RIAN PRATIWI. Perakitan Vektor Ekspresi Protein G subunit α dari Kedelai (Glycine max)
Kultivar Slamet. Dibimbing oleh UTUT WIDYASTUTI dan SUHARSONO.
Protein heterotrimerik G terdiri atas tiga subunit yaitu α, β, dan γ. Protein Gα teraktivasi
oleh adanya cekaman biotik atau abiotik di luar sel. Protein Gα di duga berperan penting dalam
ketahanan tanaman kedelai kultivar Slamet terhadap cekaman aluminium (Al). Untuk mempelajari
peran Gα dalam ketahanan tanaman terhadap cekaman Al, gen Gα harus diekspresikan di dalam
tanaman transgenik. Untuk itu vektor ekspresi gen Gα harus dikonstruksi. Tujuan penelitian ini
adalah untuk merakit vektor ekspresi untuk protein G subunit α dari kedelai kultivar Slamet.
Vektor eskpresi pMSH1-Gα telah berhasil dirakit dengan menyisipkan gen Gα yang berukuran
1380 pb ke dalam plasmid pMSH1 yang berukuran 14000 pb dibawah kendali promotor 35S
CaMV sehingga, plasmid rekombinan pMSH1-Gα berukuran 15380 pb. Plasmid rekombinan telah
berhasil diintroduksikan ke dalam bakteri Escherichia coli galur DH5α.
Kata kunci: Gen Gα, pMSH1, konstruksi, plasmid rekombinan, transformasi
ABSTRACT
RIAN PRATIWI. Construction of expression vector of G protein subunit α of soybean (Glycine
maxI) cultivar Slamet. Supervised by UTUT WIDYASTUTI and SUHARSONO.
Heterotrimeric G protein consists of three subunits α, β, and γ. Activation of Gα protein is
induced by biotic or abiotic stress. It is supposed that Gα protein has an important role in the Al
tolerance in soybean cv. Slamet. To study the role of Gα in the tolerance to Al stress in the plant,
the gene encoding for Gα had to be expressed in the transgenic plant. For this reason, the
expression vector of this Gα gene has to constructed. So, this research had an objective to
construct the expression vector of Gα gene of soybean cv Slamet. The expression vector pMSH1Gα was succesfully constructed by inserting 1380 bp Gα gene into pMSH1 plasmid under 35S
CaMV promoter, so this size of recombinant plasmid is 15380 bp. This recombinant plasmid was
succesfully introduce into Escherichia coli DH5α strains.
Keyword: Gα gene, pMSH1, construction, recombinant plasmid, transformation
PERAKITAN VEKTOR EKSPRESI PROTEIN SUBUNIT α DARI
KEDELAI (Glycine max) KULTIVAR SLAMET
RIAN PRATIWI
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains pada
Departemen Biologi
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2012
Judul : Perakitan Vektor Ekspresi Protein G Subunit α dari Kedelai (Glycine
max) Kultivar Slamet
Nama : Rian Pratiwi
NIM : G34070045
Disetujui
Dr. Ir. Utut Widyastuti, M.Si
Pembimbing I
Prof. Dr. Ir. Suharsono, DEA
Pembimbing II
Diketahui
Dr. Ir. Ence Darmo Jaya Supena, M.Si
Ketua Departemen Biologi
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Puji dan rasa syukur penulis sampaikan kepada Allah SWT atas segala rahmat dan karuniaNya yang telah diberikan sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Judul yang dipilih dalam
penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Januari 2011 ini ialah Perakitan Vektor Ekspresi Protein
G Subunit α dari Kedelai (Glycine max) Kultivar Slamet .
Terima kasih penulis ucapkan kepada Ibu Dr. Ir. Utut Widyastuti, M.Si dan Bapak Prof. Dr.
Ir. Suharsono, DEA selaku pembimbing yang telah banyak memberi saran selama penelitian dan
penulisan laporan karya ilmiah ini. Disamping itu, ucapan terima kasih juga penulis sampaikan
kepada Dr. Ir. R. R. Dyah Perwitasari, M.Sc sebagai dosen penguji yang telah memberikan saran
dan masukan dalam penulisan karya ilmiah. Penulis mengucapkan terima kasih kepada Kepala
Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi IPB Darmaga berserta seluruh staf dan
karyawan atas sarana dan prasarananya selama penulis melakukan penelitian di Laboratorium
BIORIN (Biotechnology Research Indonesia-The Netherland). Penulis mengucapkan terima kasih
kepada hibah bersaing XII dengan nomor 317/SP3/PP/DP2M/II/2006 dan proyek KKP3T dengan
nomor 635/LB. 620/1.1/2/2009/ atas nama Dr. Ir. Utut Widyastuti, M.Si dan Prof. Dr. Ir
Suharsono, DEA.
Penulis juga sampaikan terima kasih kepada Ratna, Pepi, Fajri, Ulung, Muchdar, Mulya,
keluarga besar Lab Biorin, dan teman-teman biologi angkatan 44 yang telah membantu selama
berlangsungnya kegiatan karya ilmiah. Ucapan terima kasih juga disampaikan kepada orang tua,
serta keluarga atas segala doa dan kasih sayangnya.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Februari 2012
Rian Pratiwi
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Baru Rambang, Muara Enim pada tanggal 15 Maret 1989 dari ayah
Fahrudin dan ibu Nurlina. Penulis merupakan anak pertama dari tiga bersaudara.
Tahun 2007 penulis lulus dari SMA Negeri 3 Prabumulih dan pada tahun yang sama lulus
seleksi masuk IPB melalui Seleksi Penerimaan Mahasiswa Baru IPB. Penulis terpilih masuk
Program Studi Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam.
Selama mengikuti perkuliahan, penulis pernah menjadi asisten praktikum mata kuliah
Biologi Dasar pada semester ganjil 2010/2011, semester genap 2010/2011, mata kuliah Genetika
Molekuler pada tahun ajaran 2010/2011 dan mata kuliah Genetika Dasar pada tahun ajaran
2011/2012. Penulis aktif sebagai staf Infokom Himpunan Mahasiswa Biologi pada tahun 20102011.
Penulis pada saat mengikuti perkuliahan melakukan praktik lapang di Balai Pengujian
Mutu Pakan Ternak Bekasi Jawa Barat. Kegiatan dilaksanakan pada bulan Juli-Agustus 2011
dengan judul makalah “Analisis Mutu Pakan Ternak Di Balai Pengujian Mutu Pakan Ternak
Bekasi Jawa Barat.
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR GAMBAR .................................................................................................................
ix
DAFTAR LAMPIRAN ..............................................................................................................
ix
PENDAHULUAN
Latar Belakang Penelitian...................................................................................................
1
Tujuan Penelitian ................................................................................................................
1
BAHAN DAN METODE
Waktu dan Tempat ..............................................................................................................
1
Bahan...................................................................................................................................
1
Metode Penelitian ...............................................................................................................
2
Isolasi DNA Plasmid pSL 16......................................................................................
2
Isolasi Gen Gα dari Plasmid pSL16…........................................................................
2
Persiapan Vektor Ekspresi..........................................................................................
2
Ligasi Sisipan dan Vektor Ekspresi............................................................................
3
Introduksi Hasil Ligasi ke dalam Bakteri E.coli.........................................................
3
Isolasi Plasmid pSL16 dan Isolasi Gen Gα dari Plasmid pSL16.........................................
3
Persiapan Vektor Ekspresi ..................................................................................................
4
Ligasi Sisipan dan Vektor Ekspresi ....................................................................................
4
Introduksi Hasil Ligasi ke dalam bakteri E.coli..................................................................
4
PEMBAHASAN ........................................................................................................................
5
SIMPULAN ...............................................................................................................................
6
SARAN ......................................................................................................................................
6
DAFTAR PUSTAKA ................................................................................................................
6
HASIL
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1 Hasil isolasi plasmid pSL16 dan gen Gα ................................................................................ 4
2 pMSH1 hasil isolasi dan pemotongan dengan enzim restriksi SpeI & XbaI...........................
4
3 PCR dari hasil ligasi pMSH1 dan Gα .....................................................................................
4
4 Bakteri yang dibiakan di media LB ........................................................................................
4
5 Peta fisik daerah T-DNA dari plasmid rekombinan pMSH1-Gα .........................................
5
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1 Komposisi media LB cair ditambah antibiotik ........................................................................
8
2 Komposisi larutan solution 1.....................................................................................................
9
3 Komposisi larutan solution 2.....................................................................................................
10
4 Komposisi larutan solution 3.....................................................................................................
11
5 Komposisi larutan buffer TAE 1x ............................................................................................
12
6 Komposisi larutan TFB ............................................................................................................
13
7 Komposisi larutan media 2YT .................................................................................................
14
8 Komposisi media LB padat ditambah antibiotik ......................................................................
15
1 PENDAHULUAN
Latar Belakang Penelitian
Protein G subunit α merupakan komponen
dari protein heterotrimerik G yang
mengandung 3 subunit (α, β, γ) yang
diaktivasi oleh sinyal ekstrakseluler (Albert et
al. 2002). Pada keadaan tidak aktif protein
protein heterotrimerik berada dalam bentuk
ikatan GDP (guanosin difosfat) dan akan aktif
dengan mengubah GDP ke bentuk GTP
(guanosin trifosfat) yang berikatan pada
subunit α. GTP subunit α akan terpisah dari
subunit βγ dan keduanya akan berinteraksi
dengan efektor yang berada di down stream.
Penurunan aktivitas GTP-subunit α menjadi
GDP-subunit α melalui aktivitas GTPase
menyebabkan pembentukan kembali bentuk
heterotrimerik tidak aktif (Kolle 1997).
Kedelai
kultivar
Slamet
diketahui
merupakan kedelai toleran terhadap cekaman
aluminium (Al) (Anwar 1999). Protein G
subunit α pada tanaman kedelai kultivar
Slamet telah berhasil diisolasi dan diklon ke
dalam plasmid pGEMT dengan nama pSL16
(Suharsono & Suharsono 2004). Kedelai
varietas Slamet memiliki satu kopi gen Gα
pada genomnya (Suharsono & Suharsono
2004), sehingga untuk mempelajari fungsi gen
ini salah satunya dapat dilakukan dengan
men-knockout gen tersebut.
Ion Al3+ merupakan bentuk paling toksik
pada tanaman. Cekaman Al pada tanaman
dapat menurunkan integritas membran,
menginduksi pembentukan peroksidasi lipid
dan
kalosa
sehingga
menghambat
pertumbuhan perpanjangan akar primer
tumbuhan (Yamamoto et al. 2001). Cekaman
Al juga dapat menginduksi ekspresi sejumlah
gen yang berperan dalam sistem pertahanan
tumbuhan. Salah satu gen yang diduga terlibat
adalah gen penyandi protein G subunit α.
Keterlibatan protein Gα terhadap toleransi
Al telah diketahui dari hasil analisis ekspresi
gen pada kultivar Lumut dan Slamet melalui
pemberian cekman Al 1,6 mM. Kedelai
kultivar Slamet mengalami peningkatan
ekspresi gen Gα setelah diberikan perlakuan
tersebut dibandingkan dengan kultivar Lumut
yang merupakan tanaman peka terhadap Al
yang tidak mengalami peningkatan ekspresi
gen Gα (Suharsono & Suharsono 2006).
Penambahan mastoparan yang merupakan
aktivator protein Gα dapat meningkatkan
sistem pertahanan tanaman kedelai terhadap
cekaman
Al
melalui
pertambahan
perpanjangan akar, penurunan kandungan Al,
peroksidasi lipid, dan kalosa serta peningkatan
integritas membran (Srimulyati 2007).
Hartini (2008) melakukan pendekatan
reverse genetic dengan menonaktifkan gen Gα
melalui irradiasi sinar gamma dan berhasil
mendapatkan 10 kandidat mutan. Ciri
morfologi mutan gen Gα yaitu tanaman
pendek (Fujisawa et al. 1999) dan dengan
stomata menutup. Analisis keterlibatan protein
Gα pada mekanisme toleransi cekaman Al
dilakukan pada mutan kedelai kultivar Slamet
yaitu Slm 103 dan Slm 338. Hasil analisis
menunjukkan adanya keterlibatan protein Gα
pada tanaman yang diberi cekaman Al 1,6
mM, dengan gejala akar pendek dan
kerusakan sel di bagian epidermis sampai
korteks mutan gen Gα (Giok 2010). Oleh
karena itu untuk mempelajari fungsi gen ini
lebih lanjut penelitian tanaman transgenik
yang mengekspresikan gen ini harus
dilakukan. Vektor ekspresi yang membawa
gen Gα sangat diperlukan untuk perakitan
tanaman transgenik sehingga penelitian untuk
mengkonstruksi vektor ekspresi perlu
dilakukan.
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan melakukan
perakitan vektor ekspresi untuk protein G
subunit α dari kedelai kultivar Slamet.
BAHAN DAN METODE
Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan
Januari - Desember 2011 di Laboratorium
BIORIN Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati
dan Bioteknologi, LPPM IPB.
Bahan
Bahan yang digunakan adalah bakteri
Escherichia coli yang membawa gen Gα pada
plasmid pSL16 (Suharsono & Suharsono
2004). Primer SL-F sebagai primer forward
dengan sekuen nukleotidanya sebagai berikut
(5’TCTAGAGCTTCACACTTCACACTTA
A3’) dan SL-R bertindak sebagai primer
reverse dengan sekuen nukleotidanya sebagai
berikut (5’ACTAGTATATTGTTG TATA
CCTGACCTC3’) yang digunakan untuk
mengamplifikasi gen Gα. Plasmid pMSH1
(koleksi Prof. Yokota, NAIST, Japan),
digunakan untuk perakitan vektor ekspresi.
Primer 35S dengan sekuen nukleotidanya
sebagai berikut (5’AAACCTCCTCGGATTC
CATT3’) bertindak sebagai primer forward
dan L4 bertindak sebagai primer reverse
dengan sekuen nukleotidanya sebagai berikut
2 (5’CTTAGGACCCACTCAAAAACGTTCC3
’) digunakan untuk melakukan verifikasi hasil
ligasi dan transformasi genetik DH5α. Enzim
XbaI (TCTAGA) dan SpeI (ACTAGT) yang
digunakan untuk memotong plasmid pMSH1.
E. coli DH5α digunakan sebagai sel inang
bagi vektor ekspresi.
Metode Penelitian
Isolasi DNA Plasmid pSL16
Metode isolasi DNA plasmid mengikuti
metode Suharsono et al. (2002). Sebanyak
100 μl
biakan bakteri E. coli yang
mengandung gen Gα pada plasmidnya dengan
kode SL16 disubkultur di dalam 5 ml media
Luria Bertani (LB) cair yang mengandung 50
mg/L ampisilin (Lampiran 1). Bakteri
ditumbuhkan selama satu malam pada suhu
37ºC pada kecepatan 250 rpm didalam
inkubator
bergoyang.
Biakan
bakteri
dipindahkan ke dalam tabung mikro dan
disentrifugasi dengan kecepatan 4000 rpm
selama 5 menit pada suhu 4ºC. Endapan hasil
sentrifugasi ditambahkan 150 μl larutan
solution 1 (Lampiran 2) dan dilarutkan
kembali. Campuran kemudian ditambahkan
250 μl larutan solution 2 (Lampiran 3) untuk
melisis sel dan diinkubasi pada suhu ruang
selama 5 menit. Campuran tersebut
ditambahkan 200 μl larutan solution 3
(Lampiran 4) dan diinkubasi di dalam es
selama 10 menit. Campuran kemudian
disentrifugasi dengan kecepatan 10000 rpm
selama 10 menit pada suhu 4ºC sehingga
diperoleh supernatan. Supernatan yang
diperoleh dipindahkan ke tabung mikro,
kemudian ditambahkan larutan 1x volume
fenol-klorofrom-isoamilalkohol(PCI)
(25:24:1). Campuran disentrifugasi dengan
kecepatan 10000 rpm selama 10 menit pada
suhu 4ºC. Supernatan yang diperoleh
ditambahi dengan 1 ml alkohol absolut,
kemudian diinkubasi di dalam es selama 5
menit. Campuran disentrifugasi dengan
kecepatan 10000 rpm selama 10 menit pada
suhu 4ºC. Endapan yang merupakan DNA
ditambahkan dengan 1 ml alkohol 70 %.
Campuran disentrifugasi dengan kecepatan
10000 rpm selama 5 menit pada suhu 4ºC.
Endapan DNA yang dihasilkan kemudian
dikeringkan dengan pengering kedap udara.
DNA plasmid yang berupa endapan dilarutkan
kembali dengan menambahkan 10-20 µl
ddH2O. DNA plasmid yang sudah larut
ditambahkan 0,2 x volume RNAse (1 mg/ml)
untuk
mendegradasi
RNA
kemudian
diinkubasi pada suhu 37 ºC selama 10 menit
dilanjutkan inaktif RNAse selama 10 menit.
Hasil
isolasi
diketahui
dengan
elektroforesis agarosa 1% (b/v) menggunakan
buffer TAE 1x (Lampiran 5). Langkahlangkah elektroforesis yaitu sebanyak 5 µl
dicampur dengan 1 µl 6x loading dye,
dimasukan ke dalam gel agarosa 1 % (b/v)
dan dimigrasikan menggunakan buffer TAE
1x selama 30 menit dengan tegangan 100 volt.
Selanjutnya gel direndam dalam larutan
ethidium bromida 0,5 μg/ml selama 10 menit,
dibilas dengan akuades, kemudian pita DNA
dilihat menggunakan UV transluminator dan
dikuantifikasi dengan spektrofotometer UVVIS pada panjang gelombang 260 nm dan 280
nm.
Isolasi Gen Gα dari Plasmid pSL16
Isolasi gen Gα
dari plasmid pSL16
dilakukan dengan PCR. PCR dilakukan
dengan mencampur 100 ng plasmid sebanyak
1 μl sebagai cetakan, 1 μl buffer Taq 10x, 0,2
μl dNTP 10 mM, 10 pmol primer SL-F , 10
pmol primer SL-R, 1 unit enzim Taq
Polymerase dan ddH2O sampai volume akhir
10 μl. Kondisi PCR yang digunakan adalah
pra-PCR 95ºC selama 5 menit, denaturasi
94ºC selama 30 detik, penempelan primer 54
ºC selama 45 detik, pemanjangan 72ºC selama
1 menit dengan 34 siklus, pasca PCR 72 ºC
selama 5 menit, dan pendinginan pada suhu
20 ºC selama 15 menit. Hasil PCR diperiksa
dengan elektroforesis untuk itu sebanyak 5 µl
hasil PCR dicampur dengan 1 µl 6x loading
dye, dimasukkan ke dalam gel agarosa 1 %
(b/v) dan dimigrasikan menggunakan buffer
TAE 1x selama 30 menit dengan tegangan
100 volt. Selanjutnya gel direndam dalam
larutan ethidium bromida 0,5 μg/ml selama 10
menit, dibilas dengan akuades, kemudian pita
dilihat menggunakan UV transluminator dan
dielusi menggunakan Gel/PCR DNA fragment
Extraction kit (Geneaid).
Persiapan Vektor Ekspresi
Tahapan isolasi DNA vektor ekspresi
pMSH1 sama seperti isolasi plasmid pSL16.
Plasmid yang sudah berhasil diisolasi
kemudian diverifikasi dengan elektroforesis
dan dikuantifikasi dengan spektrofotometer
UV-VIS pada panjang gelombang 260 nm dan
280 nm seperti pada plasmid pSL16. DNA
plasmid pMSH1 hasil isolasi kemudian
dipotong menggunakan enzim restriksi XbaI
dan SpeI. Sebanyak 5 μl (33,5 ng) plasmid
pMSH1 ditambahkan 12 μl ddH2O, 2 μl buffer
restriksi, enzim restriksi XbaI 0,5 μl (7,5 U)
sebanyak, dan SpeI 0,5 μl (7,5 U) dan
3 diinkubasi pada suhu 37 ºC selama satu
malam (Sambrook 1989).
Ligasi Sisipan dan Vektor Ekpresi
DNA gen Gα hasil PCR diligasikan pada
vektor ekspresi pMSH1. Proses ligasi
menggunakan enzim ligase yaitu T4 DNA
ligase. Proses ligasi dilakukan selama satu
malam pada suhu 4 ºC mengikuti metode
Promega 1999 (Frackman & Kephart 1999)
untuk itu sebanyak 2 μl (11, 866 ng) gen Gα
dicampur dengan 5 μl (33, 565 ng) vektor
pMSH1, 1,5 μl ddH2O, 5 μl buffer ligasi (5x)
dan 0,5 μl (1,5 U) enzim ligasi T4 DNA
ligase.
Hasil ligasi diverifikasi keberhasilannya
dengan PCR mengunakan primer spesifik 35S
dan L4. PCR dilakukan dengan mencampur
1μl plasmid rekombinan sebagai cetakan, 1 μl
buffer Taq 10x, 0,2 μl dNTP 10 mM, 0,25 μl
primer 35S 10 pmol, 0,25 μl primer L4 10
pmol, 1 unit enzim Taq Polymerase dan 7,2 μl
ddH2O dengan volume akhir mencapai 10 μl.
Kondisi PCR yang digunakan adalah pra-PCR
95ºC selama 5 menit, denaturasi 94ºC selama
30 detik, penempelan primer 54 ºC selama 45
detik, pemanjangan 72ºC selama 1 menit
dengan 34 siklus, pasca PCR 72 ºC selama 5
menit, dan pendinginan pada suhu 20 ºC
selama 15 menit. Hasil PCR sebanyak 5 µl
dicampur dengan1 µl 6x loading dye,
dimasukan ke dalam gel agarosa 1 % (b/v)
dan dimigrasikan menggunakan buffer TAE
selama 30 menit dengan tegangan 100 volt.
Selanjutnya gel direndam dalam larutan
ethidium bromida 0,5 μg/ml selama 10 menit,
dibilas dengan akuades, kemudian pita DNA
dilihat menggunakan UV transluminator
Introduksi Hasil Ligasi ke dalam Bakteri
E.coli
Hasil ligasi antara plasmid pMSH1 dan
gen Gα diintroduksikan ke dalam bakteri
E.coli galur DH5α. Bakteri tersebut terlebih
dahulu dibuat kompeten mengikuti metode
Suharsono et al. (2002). Bakteri DH5α
diambil dari koloni tunggal, dibiakkan di
dalam media LB cair sebanyak 2 ml selama
satu malam pada suhu 37 ºC dengan
kecepatan 250 rpm dalam inkubator
bergoyang.
Sebanyak100
μl
bakteri
disubkultur di dalam media LB cair 10 ml
selama 2,5 jam sampai OD 0,4-0,6 yang
diukur pada panjang gelombang 660 nm.
Selanjutnya bakteri diinkubasi dalam es
selama 5 menit, kemudian dipindahkan ke
tabung mikro dan disentrifugasi pada
kecepatan 5000 rpm selama 10 menit pada
suhu 4 ºC. Endapan ditambah dengan 495 μl
larutan TFB (Lampiran 6) dan dilarutkan
kembali. Suspensi bakteri diinkubasi di dalam
es selama 10 menit kemudian disentrifugasi
pada kecepatan 5000 rpm selama 10 menit
pada suhu 4 ºC. Endapan ditambah dengan
125 μl larutan buffer transformasi (TFB) dan
8,8 μl DMSO (dimetil sulfoksida) kemudian
diinkubasi di dalam es dan sel kompeten siap
digunakan.
Bakteri kompeten sebanyak 50 μl
ditambah dengan 10 μl hasil ligasi kemudian
diinkubasi selama 30 menit di dalam es.
Campuran diberi perlakuan kejut panas
selama 45 detik pada suhu 42 ºC kemudian
diinkubasi di dalam es selama 5 menit.
Sebanyak 100 μl media 2YT (Lampiran 7)
ditambahkan pada campuran lalu diinkubasi
selama 30 menit pada suhu 37 ºC pada
kecepatan 250 rpm dalam inkubator
bergoyang. Selanjutnya bakteri tersebut
disebar pada media LB padat yang
mengandung antibiotik 50 mg/L higromisin
dan 50 mg/L kanamisin (Lampiran 8) sebagai
verifikasi hasil transformasi E.coli DH5α.
HASIL
Isolasi Plasmid pSL 16 dan Isolasi gen Gα
dari Plasmid pSL16
Proses
isolasi
mengikuti
metode
Suharsono et al. (2002) dengan cara lisis
alkalin. Plasmid pSL16 berhasil diisolasi dari
bakteri E.coli. Elektroforesis DNA plasmid
pSL16 menghasilkan 3 pita yang bervariasi
berdasarkan topologi plasmid (Gambar 1A2).
Berdasarkan hasil kuantifikasi menggunakan
spektrofotometer UV-VIS, konsentrasi DNA
plasmid yang diperoleh adalah 5,933 ng/μl.
Berdasarkan spektrofotometri kualitas DNA
yang diisolasi adalah baik yang ditunjukkan
dengan perbandingan nilai absorbansi pada
panjang gelombang 260 nm dan 280 nm
adalah 1,8.
Hasil isolasi berupa plasmid yang
mengandung gen Gα dijadikan cetakan untuk
mengisolasi gen Gα menggunakan PCR yang
sudah ditambahkan situs pemotongan enzim
XbaI dan SpeI. Primer yang didesain dengan
penambahan situs pemotongan enzim XbaI
bertindak sebagai primer forward. Primer
yang bertindak sebagai primer reverse adalah
primer yang sudah ditambahkan situs
pemotongan enzim SpeI. Hasil PCR
menghasilkan 1 fragmen yang berukuran 1380
pb yang kemudian dielusi menggunakan
Gel/PCR DNA fragment Extraction kit
(Geneaid) (Gambar 1B)
4 amplifikasi menghasilkaan satu
berukuran 1295pb (Gambaar 3).
1
fragmen
2
1650 pb
1380 pb
1000 pb
1
1295
pb
b
2 B
A
Hasil isolasi plasmid pSL
L16 dan
Gambar 1 H
Gen Gα. (A)) Plasmid SL16 hasil
isolasi, (1) penanda
p
λ 50 ng, (2)
plasmid pSL16, (B) Fragm
men Gα
m
hasil PCR menggunakan
primer
SL-F dann SL
L-R
V
Eksprresi
Persiapan Vektor
Vektor berupa plassmid pMSH11 telah
berhasil diiisolasi dari bakteri
b
E.colii. Hasil
elekroforesis menunjukkkan adanya dua
d
pita
plasmid
p
pMSH1.
yang
meerupakan
Berdasarkann hasil spektrrofotometer UV-VIS
U
DNA yangg diisolasi berkualitas dengan
konsentrasi 6,713 ng/μl. Vektor pMSH
H1 hasil
mudian dipootong mengggunakan
isolasi kem
enzim restrikksi XbaI dan SpeI
S
(Gambaar 2).
1
2
3
CR dari hasil ligasi pMSH
H1 dan
Gambar 3 PC
Gα
α. (1) DNA m
marker (2) Fragmen
Gα
α dengan prim
mer 35S-F dan
n L4
H
Ligasi ke dalam Bakteri
B
Introduksi Hasil
E.coli
Hasil ligasi telah diintrooduksikan ke dalam
bakteri E.colii galur DH5α dan E. Coli teersebut
telah dibiakkkan di mediia LB padatt yang
mengandung antibiotik 500 mg/L higro
omisin
L kanamisin uuntuk menyeleeksi E.
dan 50 mg/L
Coli yang mengandung
m
plasmid. Beb
berapa
koloni bakterri E. coli tumbbuh di media seleksi
s
ini. Bakteri kompeten yyang ditransfo
formasi
juga
j
tumbuhh pada mediia tanpa anttibiotik
sedangkan bakteri
b
komp
mpeten yang tidak
ditransformassi tidak tumbuuh pada mediaa yang
mengandung antibiotik (Gaambar 4).
12000 pb
p
b
a
Gambar
2
pMSH1 hasil isolassi dan
pemotongann dengan enzim
restriksi SpeI
S
& XbaaI. (1)
pMSH1
utuh,
(2)
pMSH1dipootong dengaan SpeI
dan XbaI , (3) DNA marrker 1kb
l
Plus DNA ladder
Ligasi Sisip
pan dan Vektor Ekspresi
Proses liigasi antara sisipan gen Gα dengan
vektor eksprresi pMSH1 menggunakann enzim
T4 DNA liggase dan diinnkubasi selam
ma satu
malam. Hassil ligasi kemuudian di PCR dengan
menggunakaan primer sppesifik 35S-F
F yang
merupakan bagian dari promotor
p
pMSH dan
α. Hasil
L4 merupakkan bagian teengah gen Gα
c
kkan di
Gambar 4 Baakteri E. Colii yang dibiak
media LB. (a) bakteri yang
ksi ( b)
ditransformasi ddi media selek
baakteri yang ditransformaasi ke
media yang ttidak mengaandung
n yang
anntibiotik (c) ssel kompeten
mengandung anntibiotik
5 PEMBAH
HASAN
d
Fragmenn gen Gα tellah berhasil diisolasi
dengan penaambahan situus pemotongann enzim
restriksi XbaaI dan SpeI pada
p
kedua ujjungnya
melalui PCR
R. Penambahan situs pemootongan
enzim ini dilakukan
d
agar fragmen gen
g
Gα
dapat disisiipkan ke dallam vektor ekspresi
e
pMSH1 padda posisi dan orientasi yanng benar
untuk ekspreesi.
DNA veektor adalah molekul DNA yang
dan
dipergunakaan
untuk
membawa
memperbanyyak
fragm
men
DNA
yang
dibawanya (Lehninger 1994). Vektoor yang
sering digunnakan adalah plasmid bakteeri yang
merupakan materi genettik ekstra kroomosom
yang diwarriskan secara tetap (Saambrook
1989). Karakteristik utaama plasmid adalah
memiliki orrigin of repliication, adanyya situs
pengklonan dan penanda seleksi (Dalee 1995).
MSH1 membaawa gen hppt yang
Vektor pM
menyandikaan enzim ketahanan
k
t
terhadap
antibiotik
higromisin
dan
genn
npt
k
t
terhadap
menyandikaan enzim ketahanan
antibiotik kanamisin.
k
K
Kedua
gen tersebut
digunakan sebagai marrker seleksi (Brown
1996).
dari amplifikkasi ujung proomoter 35S CaMV
C
(Cauliflower mosaic viruus) yang beru
ukuran
t
pada pMSH1 dan daerah
363 pb yang terdapat
L4 yang terlletak pada ekkson ke 10 bagian
b
tengah gen Gα yang bberukuran 93
32 pb,
sehingga seccara keseluruuhan fragmeen ini
berukuran 1295 pb.
Adanya fragmen terssebut menunjjukkan
bahwa vekttor ekspresii pMSH1 sudah
mengandung gen Gα pada situs Xba
aI dan
n Gα
SpeI. Ligassi pMSH1 dan gen
menghasilkann plasmid rekkombinan pM
MSH1Gα yang beruukuran 15380 pb yang meru
upakan
penjumlahan ukuran darri vektor pM
MSH1
d
fragmen gen Gα 1380 pb
14000 pb dan
(Gambar 5).
mudian
Plasmid rekombinan haasil ligasi kem
diintroduksikkan ke dalam bakteri E.colii galur
DH5α. Bakteeri tersebut tuumbuh pada media
seleksi beruupa media LB padat yang
mengandung antibiotik 500 mg/L higro
omisin
k
dan 50 mg//L kanamisinn. Adanya kolonikoloni bakteeri yang tum
mbuh pada media
seleksi
menunjukkan
bahwa
proses
b
transformasi telah berhhasil dan bakteri
1 yang
tersebut menngandung plassmid pMSH1
mengandung gen hpt dann npt II baik
k yang
G
Gambar
5 Petaa fisik daerah T-DNA dari plasmid
p
rekom
mbinan pMSH
H1-Gα
p
yangg telah diisollasi dan
Vektor pMSH1
dipotong dengan
d
enzim
m XbaI dann SpeI
menghasilkaan satu pita saja yang beerukuran
kurang lebihh 14000 pb lebbih kecil dari pMSH1
p
utuh yang tidak dipotonng. Plasmid menjadi
m
linier karenna pemotongann pada daeraah MCS
(multiple clloning site) terjadi penguurangan
beberapa paasang basa sajaa.
Vektor pMSH1 yanng telah teerpotong
m
proress ligasi.
disisipi olehh gen Gα melalui
Proses ligassi menggunakkan suatu ligase yaitu
T4 DNA liigase. Pembuuktian bahwaa vektor
sudah tersisiipi adalah denngan mengisoolasi gen
dan daerah vektor yangg berdekatan dengan
gen tersebutt. Amplifikassi DNA dengaan PCR
menggunakaan primer speesifik 35S-F dan L4
yang didesaain dari sekuuen vektor ekspresi
e
pMSH1 daan Gα mennghasilkan fragmen
f
berukuran 1295
1
pb. Fraggmen tersebut berasal
maupun yang tidak
mengandung gen Gα m
mengandung gen Gα.
menyaandikan
neomisin
Gen
npptII
phosphotransf
p
sferase yang ddapat mendeg
gradasi
antibiotik kannamisin sehinngga menjadii tidak
beracun.
E
Ekspresi
ggen
ini
akan
mendetoksifikkasi senyaw
wa aminoglu
ukosida
melalui fosfo
forilasi (Chrisstou et al. 1991).
Bakteri yang tidak menganndung pMSH1
1 tidak
k
dapat tumbuuh pada meddia tersebut karena
tidak memilikki gen nptII. G
Gen hpt meru
upakan
gen
yang
menyandikan
hygromisin
phosfotransfe
p
erase
yang
dapat
mendetoksifikkasi antibiotikk higromisin.
Bakteri diitransformasi dengan pMSH
H1-Gα
tumbuh denggan baik di media tanpaa agen
seleksi (Gam
mbar 4). Hall ini menunjjukkan
bahwa selam
ma proses trannsformasi bak
kteri E.
Coli tidak mengalami kerusakan atau
kematian, selain itu bakteri ini digunakan
untuk melihat kondisi sel kompeten. Adanya
koloni yang tumbuh menunjukkan bakteri
kompeten tersebut tidak mengalami kematian.
Sedangkan bakteri kompeten tidak dapat
hidup di media yang mengandung agen
seleksi (Gambar 4c), menunjukkan bahwa
agen seleksi berfungsi dengan baik. Gen hpt
dan npt II selain untuk seleksi E. coli yang
mengandung plasmid pMSH1 juga digunakan
untuk seleksi di dalam sel tanaman. Gen
penanda seleksi ini digunakan untuk
memudahkan seleksi sel atau jaringan yang
tertransformasi (Stisklen 1991).
SIMPULAN
Vektor ekspresi rekombinan telah berhasil
dikonstruksi dan dintroduksikan ke dalam
bakteri E.coli galur DH5α. Bakteri yang
diduga mengandung plasmid rekombinan
pMSH1-Gα berhasil ditumbuhkan pada media
seleksi
yang
mengandung
antibiotik
kanamisin dan higromisin.
SARAN
Koloni yang tumbuh di media seleksi perlu
dianalisis dengan PCR, dengan menggunakan
primer 35S dan L4 untuk mendapatkan bakteri
yang mengandung plasmid rekombinan
pMSH1-Gα.
DAFTAR PUSTAKA
Alberst et al. 2002. Molecular Biology of The
Cell. New York: Garlan Science.
Anwar S. 1999. Pengklonan gen-gen yang
diinduksi oleh aluminium pada kedelai
(Glycine max (L). Merril) [disertasi].
Bogor: Program Pascasarjana, Institut
Pertanian Bogor.
Brown TA. 1996. Genetic a Molecular
Approach. India: Routledge Chapman &
Hall.
Christou P, Ford TL, Kofron M. 1991.
Production of transgenic rice (Oryza sativa
L) plants from agronomically important
indica and japonica into immature zygotic
embryos. Biotechnol 9: 957-966.
Dale JW.1995. Application of in Vitro
Genetics. Di dalam: Willey, Sons, editor.
nd
Molecular Genetic of Bactreia. 2 edition.
Jhon Willey & Sons. New York, hlm 229232.
Frackman S, Kephart. 1999. Rapid Ligation
for the pGEM®-T and pGEM®-T Easy
Vector Systems. Promega notes 71: 1-8.
Fujisawa Y et al.1999. Suppression of the
heterotrimeric G protein causes abnormal
morphology, including dwarfism, in rice.
Proc Natl Acad Sci 96: 7575-7580.
Giok G. 2010. Studi anatomi dan histokimia
pada akar kedelai (Glycine max (L).
Merril) kandidat mutan protein Gα
terhadap cekaman alumunium [skripsi].
Bogor: Fakultas Ilmu Pengetahuan Alam
dan Matematika, Institut Pertanian Bogor.
Hartini S. 2008. Induksi mutasi dengan
irradiasi sinar gamma pada kedelai
(Glycine max (L). Merril) kultivar Slamet
dan Lumut [tesis]. Bogor: Program
Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor.
Kolle RM. 1997. A new family of G-protein
regulator-the RGS proteins. Cell Biol
9:143-147.
Lehninger. 1994. Dasar-Dasar Biokimia.
Maggy Thenawijaya, penerjemah. Jakarta:
Erlangga. Terjemahan dari: Fundamental
of Biochemstry.
Sambrook J, Fritsch EK, Maniatis T. 1989.
Molecular Cloning: A laboratory Manual.
New York:
Cold Spring Harbor
Laboratory Pr.
Sticklen MB. 1991. Direct somatic
embryogenesis and fertile plants from rice
root cultures. Plant Physiol 138:557-580
Srimulyati T. 2007. Keterlibatan protein
heterotrimerik Gα terhadap cekaman
aluminium pada kedelai (Glycine max (L).
Merril) melalui studi histokimia [skripsi].
Bogor: Fakultas Ilmu Pengetahuan Alam
dan Matematika, Institut Pertanian Bogor.
Suharsono et al. 2002. The heterotrimeric G
protein α subunit act upstream of the small
GTPase Rac in disease resistance of rice.
Proc Natl Acad Sci 99 20: 13307-13312.
Suharsono UW, Suharsono S. 2004. Analisis
gen penyandi protein heterotrimetrik G
subunit α yang terlibat dalam sistem
toleransi tanaman kedelai terhadap
cekaman alumunium. Laporan Penelitian
Hibah Bersaing tahun ke-I. Bogor: Institut
Pertanian Bogor.
Suharsono UW, Suharsono S. 2006. Analisis
gen penyandi protein heterotrimerik G
subunit α yang terlibat dalam sistem
toleransi tanaman kedelai terhadap
cekaman aluminium. Laporan Akhir
Penelitian Hibah Bersaing XII. Bogor:
Institut Pertanian Bogor.
Yamamoto Y, Kobayashi Y, Matsumoto H.
2001. Lipid peroxidation is an early
symptom triggered by alumunium, but not
the primary cause of elongations inhibition
in pea roots. Plant Physiol 125:199-208.
LAMPIRAN
8 Lampiran 1 Komposisi media LB cair ditambah antibiotik
Media LB:
Bacto Trypton
: 10 g/L
Bacto Yeast
: 5 g/L
NaCl
: 10 g/L
Antibiotik:
Antibiotik higromisin
: 50 mg/L
Antibiotik kanamisin
: 50 mg/L
atau
Ampisilin
: 100 mg/L
9 Lampiran 2 Komposisi larutan solution 1
Tris/HCL pH 7,4 25 mM
EDTA 10 mM
Sukrosa 15 %
10 Lampiran 3 Komposisi larutan solution 2
NaOH 200mM
SDS 1%
11 Lampiran 4 Komposisi larutan solution 3
Natrium asetat pH 4,7 3 M
12 Lampiran 5 Komposisi larutan buffer TAE 1x
Larutan TAE 50x
: 980 ml
Akuades steril
: 20 ml
13 Lampiran 6 Komposisi larutan TFB
MES pH 6,3
: 10 mM
: 10 mM
CaCl2. 2H2O
[Co(NH3)6]Cl3
: 3 mM
KCL
: 100 mM
Gliserol
: 10 %
Pada pH 7,4
14 Lampiran 7 Komposisi media 2YT
Bacto Trypton
: 16 g/L
Yeast ekstrak
: 5 g/L
NaCl
: 5 g/L
Akuades steril
:1L
15 Lampiran 8 Komposisi media LB padat ditambah antibiotik
Media LB:
Bacto Trypton
: 10 g/L
Bacto Yeast
: 5 g/L
NaCl
: 10 g/L
Bacto Agar
: 25 g/L
Akuades steril
: 1L
Antibiotik:
Antibiotik higromisin
: 50 mg/L
Antibiotik kanamisin
: 50 mg/L