PLEA 2008 Paper Title - Jurnal UNTAN

Prosiding SEMIRATA 2015 bidang MIPA BKS-PTN Barat
Universitas Tanjungpura, Pontianak
Hal. 322 - 329
ISOLASI, ELUSIDASI STRUKTUR, DAN UJI BIOAKTIVITAS SENYAWA STEROID
DARI BUAH MAHKOTA DEWA (Phaleria macrocarpa)
Tati Suhartati*, Astri Rahayu dan Heryanto
Jurusan Kimia FMIPA, Universitas Lampung
Jl. S. Brojonegoro No. 1, Bandar Lampung 35145
*E-mail : [email protected]
ABSTRACT
From the fruit of Mahkota Dewa (Phaleria macrocarpa) which is grown in Bandar
Lampung, β-sitosterol has been isolated as much as 140 mg (5.6 x 10-2 %). Isolation was
done by maceration method and fractionated by vacuum liquid chromatography (VLC) ,
chromatotron, and column chromatography. Purity of the compounds was determined by
thin layer chromatography (TLC) and measurement of the melting point, whereas the
structure elucidation was done by IR, NMR, and MS spectrometry. β-sitosterol was
obtained in the form of white crystalline needles with a melting point of 135o - 137oC, and
the bioactivity against E. coli test using agar diffusion method, showed positive results
with inhibition area diameter of 21 mm with a weight of 0.017 gram sample .
Keywords : isolation, structure elucidation, β - sitosterol, Phaleria macrocarpa, E. coli
ABSTRAK
Dari daging buah Mahkota Dewa (Phaleria macrocarpa) yang berasal dari Bandar
Lampung, telah diisolasi β-sitosterol sebanyak 140 mg ( 5,6 x 10-2 %). Isolasi dilakukan
dengan metode maserasi dan fraksinasi dengan kromatografi cair vakum (KCV),
kromatotron, dan kromatografi kolom. Kemurnian senyawa ditentukan dengan cara
kromatografi lapis tipis (KLT) dan pengukuran titik leleh, sedangkan elusidasi struktur
dilakukan dengan cara spektrometri IR, NMR, dan MS. β-sitosterol yang diperoleh
berupa kristal jarum berwarna putih dengan titik leleh 135o-137oC, dan pada uji
bioaktivitas terhadap E. coli menggunakan metode difusi agar, menunjukkan hasil positif
dengan diameter daerah hambat sebesar 21 mm dengan berat sampel 0,017 gram.
Kata kunci: isolasi, elusidasi struktur, β-sitosterol, Phaleria macrocarpa, E. coli
1. PENDAHULUAN
Buah mahkota dewa secara konvensional banyak digunakan oleh masyarakat
Indonesia untuk mengobati asam urat, diabetes melitus, hipertensi, dan penyakit ginjal [1],
antihistamin, antioksidan, obat asam urat, lever, rematik, kencing manis, ginjal, tekanan
darah tinggi sampai kanker [2].
Di dalam buah mahkota dewa terkandung senyawa
alkaloid, saponin, flavonoid, dan terpenoid [3].
322
Prosiding SEMIRATA 2015 bidang MIPA BKS-PTN Barat
Universitas Tanjungpura, Pontianak
Hal. 322 - 329
Pada makalah ini dilaporkan isolasi senyawa steroid yang dilakukan dengan cara
maserasi menggunakan etil asetat terhadap buah mahkota dewa dari tumbuhan yang
tumbuh di daerah Bandar Lampung.
Pemisahan selanjutnya dilakukan dengan cara
kromatografi cair vakum (KCV), kromatotron, dan kromatografi kolom (KK). Identifikasi
kemurnian dilakukan menggunakan kromatografi lapis tipis (KLT) dan uji titik leleh.
Identifikasi struktur molekul dilakukan menggunakan berbagai spektroskopi, meliputi UVVIS, IR, NMR, dan MS. Berdasarkan analisis data spektroskopi dan membandingkannya
dengan literatur, senyawa hasil isolasi merupakan senyawa β-sitosterol. Uji bioaktivitas
senyawa ini terhadap E. coli menunjukan hasil positif.
2. BAHAN DAN METODE PENELITIAN
2.1 Bahan
Bahan yang digunakan adalah buah mahkota dewa yang diperoleh dari Bandar
Lampung, etil asetat, metanol, n-heksana, aseton, akuades, serium sulfat 1,5% dalam
asam sulfat (H2SO4) 2 N, benzena, kloroform (CHCl3), diklorometana, silika gel Merck G
60, silika gel Merck 60 (35-70 Mesh), plat KLT silika gel Merck kiesegal 60 F254 0,25 mm,
silika gel 60 PF254.
2.2 Alat
Alat-alat yang digunakan meliputi alat-alat gelas laboratorium, penguap putar
vakum, kolom kromatografi cair vakum (KCV), kromatotron, alat kromatografi kolom (KK),
pengukur titik leleh, lampu UV, pipet kapiler, penguap putar vakum, spektrofotometer FTIR merk Scimitar 2000, spektrofotometer ultraungu-tampak (UV-VIS) merk Cary 50,
spektrofotometer NMR, spektrofotometer GC-massa (MS) merk Shimadzu QP-2010, dan
spektofotometer massa (MS) merk Shimadzu QP-2010.
2.3 Prosedur Penelitian
2.3.1 Ekstraksi
Ekstraksi dilakukan dua kali. Pertama, menggunakan 1500 gram buah mahkota
dewa yang telah dihaluskan,dimaserasi 3 kali dengan menggunakan etil asetat (EtOAc)
masing-masing selama 1x24 jam. Ekstrak etil asetat yang diperoleh disaring kemudian
dipekatkan dengan menggunakan penguap putar vakum pada suhu 45o-50oC dengan laju
putaran 120-150 rpm. Ekstraksi kedua menggunakan 1000 gr buah mahkota dewa.
2.3.2 Kromatografi Cair Vakum (KCV)
Ekstrak kasar kemudian difraksinasi dengan KCV. Terlebih dahulu fasa diam silika
gel halus sebanyak 3 kali berat sampel dimasukkan ke dalam kolom. Kemudian kolom
323
Prosiding SEMIRATA 2015 bidang MIPA BKS-PTN Barat
Universitas Tanjungpura, Pontianak
Hal. 322 - 329
dikemas kering dalam keadaan vakum menggunakan alat vakum.
Eluen yang
kepolarannya rendah, dimasukkan ke permukaan silikagel halus terlebih dahulu kemudian
divakum kembali. Kolom dihisap sampai kering dengan alat vakum dan siap digunakan.
Ekstrak kasar yang telah dilarutkan dalam aseton dan diimpregnasikan kepada
silika gel kasar, kemudian dimasukkan pada bagian atas kolom yang telah berisi fasa
diam dan kemudian dihisap secara perlahan-lahan ke dalam kemasan dengan cara
memvakumkannya. Setelah itu kolom dielusi dengan etil asetat/n-heksan 0% sampai
dengan etil asetat 100%.
Kolom dihisap dengan vakum sampai kering pada setiap
penambahan eluen, kemudian fraksi-fraksi yang diperoleh dikumpulkan berdasarkan pola
fraksinasinya.
Fraksinasi sampel dengan teknik KCV dilakukan berulang kali dengan
perlakuan yang sama seperti tahapan KCV awal di atas.
Setelah fraksi-fraksi
diidentifikasi dengan menggunakan Kromatografi Lapis Tipis, hasil KCV diperoleh 2
kelompok fraksi.
2.3.3 Kromatotron
Fraksi kedua (1,29 gr) difraksinasi lebih lanjut menggunakan kromatotron,
menggunakan plat silika ketebalan 2 mm. Elusi menggunakan n-heksana dilanjutkan
dengan diklorometana/n-heksana 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, dan 100% masing-masing
sebanyak 100 m, volume hasil fraksinasi masing-masing sekitar10 mL, diperoleh 76
fraksi, dan fraksi 46-50 diperoleh endapan putih. Fraksi ini selanjutnya dimurnikan secara
KK dengan adsorben silika gel dan eluen benzena, diperoleh senyawa kristal murni 10
mg, berwarna putih, titik leleh 135-137 ºC (literatur 135-137 ºC, [4]), dan memberikan
warna merah pada uji steroid menggunakan pereaksi Libermann-Buchard.
Hasil dari
ekstrak yang kedua, setelah difraksinasi dan dimurnikan diperoleh kristal 130 mg.
2.3.4 Analisis
Penentuan struktur senyawa hasil isolasi dilakukan dengan menggunakan
spektroskopi UV-Vis, Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FTIR), NMR-13C, DEPT,
GS-massa (MS), dan massa (MS).
2.3.5 Uji aktivitas
Sampel Kristal murni yang telah dianalisis selanjutnya diuji bioaktivitasnya terhadap
bakteri E. colit menggunakan metode difusi agar [5]. Kristal murni diimpregnasi ke dalam
kertas saring Whattman berbentuk cakram, juga sampel kasar, kontrol positif
(Chloramphenicol) dan kontrol negative (aseton). Media pertumbuhan digunakan Nutrien
Agar (NA).
324
Prosiding SEMIRATA 2015 bidang MIPA BKS-PTN Barat
Universitas Tanjungpura, Pontianak
Hal. 322 - 329
3. HASIL DAN PEMBAHASAN
Spektrum IR senyawa yang diperoleh menunjukkan serapan melebar pada daerah
bilangan gelombang ν 3427,84 cm-1 yang berasal dari vibrasi uluran (stretching) dari
gugus O-H (3200-3500 cm-1). Vibrasi OH ini diperkuat oleh adanya serapan pada daerah
bilangan gelombang ν 1333,56 cm-1 yang menunjukkan adanya serapan tekukan
(bending) gugus O-H (1330-1420 cm-1) dan bilangan gelombang ν 1053,97 cm-1 yang
menunjukkan adanya uluran C-OH siklik (990-1060 cm-1). Pita serapan pada daerah
bilangan gelombang ini memberikan gambaran bahwa senyawa merupakan senyawa
siklik yang mengandung gugus OH.
Adanya pita tajam dengan intensitas kuat pada
bilangan gelombang ν 2936,54 cm-1 adalah merupakan vibrasi uluran C-H dari CH3 dan
pita serapan pada bilangan gelombang ν 2868,27 cm-1 merupakan uluran C-H pada CH2
(alkana, 2850-3000 cm-1).
Hal ini diperkuat dengan adanya serapan pada daerah
bilangan gelombang γ 1377,05 cm-1 yang menunjukkan adanya tekukan C-H dari CH3
(rocking, 1350-1370 cm-1) dan pita serapan pada bilangan gelombang γ 1465,29 cm-1
yang menunjukkan adanya tekukan C-H dari CH2 (scissoring, 1450-1470 cm-1).
serapan pada bilangan gelombang 958,57 cm
-1
Pita
yang menunjukkan adanya vibrasi
tekukan (bending) gugus alkena =C-H (650-1000 cm-1), spektrum IR dari senyawa hasil
isolasi dapat dilihat pada Gambar 1.
.
Gambar 1. Spektrum IR senyawa hasil isolasi
Spektrum NMR-13C menunjukkan bahwa terdapat 28 karbon penyusun senyawa
hasil isolasi. Spektrum NMR-13C menyatakan adanya gugus hidroksi (δC 71,7) dan gugus
325
Prosiding SEMIRATA 2015 bidang MIPA BKS-PTN Barat
Universitas Tanjungpura, Pontianak
Hal. 322 - 329
alkena (δC 121,6 dan δC 142,4).
Perbandingan data NMR-13C senyawa hasil isolasi
dengan data literatur ditunjukkan dalam Tabel 1.
Spektrum NMR karbon DEPT dari senyawa hasil isolasi dan perbandingan dengan
literatur ditunjukkan dalam Tabel 2.
Tabel 1. Perbandingan data NMR-13C hasil isolasi dan data literatur.
Hasil
Literatur
Dugaan
Hasil
Literatur
Dugaan
38,3
37,6
C-1
25,0
26,3
C-15
32,6
32,1
C-2
23,8
28,5
C-16
71,7
72,1
C- 3
56,9
56,3
C-17
43,1
42,5
C-13
12,2
12,0
C-18
142,4
140,9
C- 5
19,2
19,0
C-19
121,6
121,9
C- 6
37,0
36,3
C-20
32,7
32,1
C- 7
19,3
19,2
C-21
32,8
32,1
C- 8
34,7
34,2
C-22
51,2
50,3
C- 9
26,7
26,3
C-23
37,3
36,7
C-10
46,7
46,1
C-24
21,8
21,3
C-11
29,0
29,4
C-25
40,7
39,9
C-12
19,9
20,1
C-26
43,4
42,6
C-4
20,1
19,6
C-27
57,7
56,9
C-14
12,3
12,2
C-28
-
12,0
C-29
Literatur : [6].
Spektrum DEPT menunjukkan adanya enam karbon metil, sebelas karbon metilen,
delapan karbon metin dan tiga karbon kuarterner (Tabel 2).
13
hubungan spektrum NMR- C dan DEPT.
326
Tabel 3 menunjukkan
Prosiding SEMIRATA 2015 bidang MIPA BKS-PTN Barat
Universitas Tanjungpura, Pontianak
Hal. 322 - 329
Tabel 2. Data hubungan dari spektrum 13C-NMR dan DEPT.
13
C
DEPT
Gugus
Posisi
12,2
12,2
CH3
C-18
12,3
12,3
CH3
19,2
19,8
19,3
13
C
DEPT
Gugus
Posisi
34,7
34,7
CH2
C-22
C-28
37,0
37,0
CH
C-20
CH3
C-19
37,3
-
C
C-10
19,3
CH3
C-21
38,3
38,3
CH2
C-1
19,9
19,8
CH3
C-26
40,7
40,7
CH2
C-12
20,1
20,1
CH3
C-27
43,1
-
C
C-13
21,8
21,8
CH2
C-11
43,4
43,4
CH2
C-4
23,8
23,8
CH2
C-16
46,7
46,7
CH
C-24
25,0
25,0
CH2
C-15
51,2
51,2
CH
C-9
26,7
26,7
CH2
C-23
56,9
56,9
CH
C-17
29,0
29,0
CH2
C-25
57,7
57,7
CH
C-14
32,6
32,6
CH
C-2
71,7
71,7
CH-OH
C-3
32,7
32,7
CH2
C-7
121,6
121,6
-C=CH
C-6
32,8
32,8
CH
C-8
142,4
-
C
C-5
Spektrum massa dari senyawa hasil isolasi memberikan puncak pada m/z 414 yang
sesuai dengan -sitosterol. Berdasarkan analisis dari spektroskopi senyawa hasil isolasi
dan perbandingan terhadap literatur, diambil kesimpulan senyawa hasil isolasi merupakan
-sitosterol dengan struktur seperti yang terdapat pada Gambar 1.
Gambar 1. Struktur senyawa hasil isolasi (-sitosterol)
327
Prosiding SEMIRATA 2015 bidang MIPA BKS-PTN Barat
Universitas Tanjungpura, Pontianak
Hal. 322 - 329
3.
Uji Bioaktivitas terhadap bakteri E. coli
Hasil uji bioaktivitas senyawa hasil isolasi ditunjukan pada Gambar 2..
Gambar 2. Uji bioaktivitas terhadap bakteri E. coli, (A) kontrol positif (chloramphenicol),
(B) kontrol negatif, (C) senyawa hasil isolasi dan (D) ekstrak kasar
Pada kuadran A menunjukkan bahwa kontrol positif (chloramphenicol, 8 mg/disk)
menghambat laju pertumbuhan dari bakteri E. coli dengan zona bening berdiameter 45
mm sedangkan kuadran B (kontrol negatif) menunjukan tidak ada penghambatan
terhadap laju pertumbuhan bakteri E. coli. Pada kuadran C (senyawa hasil isolasi, 17
mg/disk) menunjukkan adanya penghambatan terhadap bakteri E. coli dengan zona
hambat berdiameter 21 mm dan ekstrak kasar pada kuadran D juga menunjukkan adanya
zona penghambatan. Data ini menunjukkan bahwa -sitosterol hasil isolasi menunjukkan
aktivitas positif terhadap pertumbuhan E. coli yang kemungkinan disebabkan adanya
gugus hidroksi pada senyawa hasil isolasi. Daya hambat senyawa -sitosterol adalah
lemah terhadap pertumbuhan E. coli dibandingkan chloramphenicol, sedangkan data
literatur [7] menyatakan bahwa -sitosterol tidak aktif terhadap E. coli.
Berdasarkan
perbedaan aktivitas ini, diperkirakan konfigurasi mutlak dari -sitosterol hasil isolasi tidak
sama dengan literatur.
4. KESIMPULAN DAN PROSPEK
KESIMPULAN
Berdasarkan pembahasan hasil penelitian yang telah dilakukan, maka diperoleh
simpulan sebagai berikut: telah berhasil diisolasi dan diidentifikasi senyawa -sitosterol
dari buah mahkota dewa (Phaleria macrocarpa) yang berasal dari Bandar Lampung, dan
hasil uji bioaktivitas dari senyawa hasil isolasi terhadap E. coli menunjukkan aktivitas yang
lemah.
328
Prosiding SEMIRATA 2015 bidang MIPA BKS-PTN Barat
Universitas Tanjungpura, Pontianak
Hal. 322 - 329
PROSPEK
Adanya -sitosterol pada buah mahkota dewa, memungkinkan penelitian lebih lanjut
untuk uji aktivitas senyawa tersebut terhadap antikanker, rheumatik, asthma, sakit
jantung, atau migrain, selain itu perlu ditentukan putaran optik dan konfigurasi mutlak dari
-sitosterol.
DAFTAR PUSTAKA
[1] Wiryowidagdo, S. Kimia dan Farmakologi Bahan Alam. Dirjen Dikti-Universitas
Indonesia, Jakarta. 2000; Hlm 339.
[2] Harmanto, N. Sehat dengan Ramuan Tradisional Mahkota Dewa. Cetakan empat,
PT. Agromedia Pustaka, Tangerang. 2003; Hlm 5.
[3] Gotawa, I. B. I. , S. Sugiarto, M. Nurhadi, Y. Widiyastuti, S, Wahyono, I.J. Prapti
Inventaris Tanaman Obat Indonesia. Jilid V, Departemen Kes. Badan Penelitian dan
Pengembangan Kesehatan, Jakarta, 2009; Hal. 147-148.
[4] Saleh, Chairul. Isolasi dan Penentuan Struktur Senyawa Steroid Dari Akar
Tumbuhan Cendana (Santalum Album Linn), USU e-Reposetory; 2008.
[5] Lay, B. W. Analisis Mikroba di Laboratorium, PT. Rajagrafindo Persada, Jakarta,
1994; 168 hlm.
[6] Chaturvedula, V.S.P. and I. Prakash. Isolation of Stigmasterol and β-Sitosterol from
the dichloromethane extract of Rubus suavissimus.
International Current
Pharmaceutical Journal. 2012; 1(9):239 -242.
[7] Chemicalland 21 http://chemicalland21.com/lifescience/phar/beta-SITOSTEROL.htm
diakses 4 Mei 2015 jam 5.49 www.chemicalland21.com
329