Teknik analisis DNA

Teknik analisis DNA
Oleh :
dr.Syazili Mustofa
Departemen Biokimia dan Biologi
Molekuler
FK Universitas Lampung
Bahasan
• Isolasi DNA
• Analisis DNA
– PCR
– Sekuensing
– Hibridisasi
Isolasi DNA
• definisi: proses pemurnian DNA dari berbagai
sumber.
• Tujuan: memisahkan DNA dari komponen sel
lain
Aplikasi isolasi DNA
 1- scientific: mengintroduksikan DNA ke sel  gene
:
clonning
 2- kedokteran : memprediksi virulensi
mikroorganisme
 3- forensik : penggunaan DNA untuk identifikasi
individu dan paternity determination.
 Cara untuk mengisolasi DNA.
A. Menghancurkan materi lain yang ada disekitar
DNA
B. Menyingkirkan protein dan kontaminan lainnya
C. Recovery of the DNA
Sampel
Sumber : Sampel dapat diisolasi dari organisme hidup
atau mati
•
•
•
•
•
•
•
Darah
Buffy coat
Material tulang
Sel Buccal
Kultur sel
Cairan amnion
Sputum, urin, dll.
DNA Purification & Quantification
• Memisahkan DNA dari komponen seluler
lainnya (protein, lipid, RNA, dll.)
• Menghindari fragmentasi molekul DNA oleh
endogenous nucleases (DNase enzymes) 
membuat DNases tidak aktif menggunakan
pemanasan atau chelating agents.
Langkah langkah:
• Melisis sel
• Menyingkirkan kontaminan

Protein

RNA

makromolekul lain
• Menentukan konsentrasi
DNA yang sudah
dimurnikan
Menggunakan ditergen untuk melarutkan lipid membran.
2. Memisahkan DNA
• DNA harus dipisahkan dari protein dan debris
seluler.
Metode pemisahan
a) Organic extraction
b) Salting out
a) Pemisahan dengan ekstraksi organik
 phenol: chloroform digunakan untuk ekstraksi DNA.
b) Pemisahan dengan Salting Out
• Pada konsentrasi garam yang tinggi, protein
mengalami dehidrasi  kehilangan kelarutan
mengendap
• Biasanya digunakan : sodium chloride, potassium
acetate or ammonium acetate.
• Protein yang terpresipitasi disingkirkan dengan
sentrifugasi
• DNA terdapat dalam supernatan.
Pemisahan dengan Salting Out
Salting out method:
Cell lysis.
Protein digestion by proteinase enzyme.
Protein precipitation by high salt concentration.
Centrifugation will remove the precipitated
proteins.
The supernatant contains the DNA.
DNA is then precipitated by adding ethanol.
The precipitated DNA is resuspended in the
desired buffer.
Ethanol precipitation:
-Precipitation of DNA: Absolute Ethanol is layered on the top of
concentrated solution of DNA
- Fibers of DNA can be withdrawn with a glass rod
- Washing of DNA
- Desalt DNA: Most salts are soluble in 70% ethanol
Menggunakan kit komersial purifikasi DNA
 The common lysis solutions contain
A. sodium chloride
B. Trimethamine (also known as tris ) , which is a
buffer to retain constant pH
C. Ethylendiaminetetraacetic (EDTA) , which binds
metal ions
D. Sodium dodecyl sulfate (SDS) which is a detergent .
E. An enzyme used in DNA extraction is protienase K
3- Heat denaturation
Achieved by boiling samples.
Heating of a sample to 100 c releases DNA into the solution
but also denatures it by separating the two strand.
Drawbacks: There are remaining inhibitors in the form of
degraded proteins and other organic compound or ions .
4- Magnetic beads with DNA binding capacity
• Magnetic beads are coated with DNA antibodies or silica to
bind to DNA.
Samples are lyses & and then treated with proteinase K.
The lysates are then applied to the beads.
 Resin is subsequently washed & DNA is eluted of it at 65c
 Magnetic beads are separated from the sample on a
magnetic stand.
Kesimpulan isolasi DNA:
• There are three basic & two optional steps in a DNA
extraction :
1- lisis sel, untuk mendapatkan DNA.
2- menyingkirkan membran sel  menambahkan ditergen
atau surfaktan.
3- menyingkirkan protein dengan menambahkan protease .
4- menyingkirkan RNA by menambahkan Rnase.
5- mempresipitasikan DNA dengan alkohol biasanya ice cold
ethanol.  untai DNA akan beraggregasi  pellet pada
sentrifugasi .
Evaluasi DNA Extraction & Purification:
• Konsentrasi DNA  mengukur intensitas absorbansi
dengan spektrofotometer & membandingkannya
dengan kurva standar konsentrasi DNA yang sudah
diketahui.
• Mengukur intensitas absorbansi DNA pada 260nm &
280nm  kemurnian DNA
• Kemurnian DNA : A260/A280 ratio: 1.7 – 1.9
• konsentrasi DNA (μg/ml): A260 X 50
• DNA yang dihasilkan : konsentrasi DNA X volume total
larutan DNA.
Polymerase Chain Reaction (PCR)
• Polymerase chain reaction:
Dengan jumlah DNA yang sedikit  diamplifikasikan 
jumlah DNA yang cukup untuk dideteksi dengan
elektroforesis
5’
3’
3’
5’
Denaturation
5’
3’
3’
5’
Annealing
5’
3’
3’
5’
3’
5’
5’
5’
5’
5’
5’
5’
5’
3’
3’
3’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
Cycle 1
5’
3’
5’
3’
3’
Extension
5’
3’
5’
3’
Cycle 2
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
3’
Cycle 3
3’
3’
5’
• Rate of PCR
2n
Initial
DNA
1
2
4
Number of DNA molecules
8
DNA copy number
1
2
4
8
16
32
64
128
256
512
1,024
2,048
4,096
8,192
16,384
32,768
65,536
131,072
262,144
524,288
1,048,576
2,097,152
4,194,304
8,388,608
16,777,216
33,554,432
67,108,864
134,217,728
268,435,456
536,870,912
1,073,741,824
1,400,000,000
1,500,000,000
1,550,000,000
1,580,000,000
Copies of DNA=2N
1.8E+09
1.6E+09
1.4E+09
DNA copy number
CYCLE NUMBER
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
1.2E+09
1.0E+09
8.0E+08
6.0E+08
4.0E+08
2.0E+08
0.0E+00
0
5
10
15
20
PCR cycle
25
30
35
DNA sequencing
• Sequencing digunakan untuk menentukan urutan
nukleotida yang tepat pada suatu molekul DNA.
• metode di-deoxy Sanger dideoxy melibatkan sintesis DNA
oleh DNA polymerase.
• Sintesis DNA diterminasi pada
nukleotida spesifik yang di
inkorporasi oleh di-deoxy
nucleotida ( nukleotida yang
kehilangan OH pada C nomor
3)
Analisi Sequence
• Empat reaksi yang berbeda menghasilkan
fragmen DNA yang diterminasi secara random
di masing-masing empat nukleotida.
• Sampel ini selanjutnya di electrophoresis.
• Fragmen terpendek (yang diterminasi paling
dekat dari primer ) bergerak lebih cepat dari
pada fragme yang lebih panjang.
ACGT
• Reaksi DNA sequencing
dapat dilabel dengan
radioaktif.
• Pita diditeksi dengan Xray film exposure.
• Sekuen dapat dibaca dari
arah 5’ ke 3’ dari bawah
gambar menuju ke atas
A
A
T
C
T
A
A
C
G
Kekurangannya
Memakan tempat dan waktu
Solusi:
melabel ddNTP dengan flourosen 
masing masing ddNTP mempunyai
warna berbeda.
07_03.jpg
• Mesin DNA
sequencers otomatis
menggunakan
terminator dideoxy
yang dilabel dengan
empat fluorescent
berbeda.
• Keempat reaksi dapat
dilakukan secara
bersamaan dalam
reaksi tunggal.
• Fragmen yang ditandai flourosen diolah oleh
elektroforesis kapiler dan dideteksi oleh
sebuah flourometer
• DNA sequence dibaca secara otomatis.
Beckman CEQ 2000, 8 capillary
ABI Prism 3730, 96 capillary
Fluorescene In Situ Hybridization
• Hibridisasi pelacak dengan DNA/RNA di dalam
sel.
• Sumber DNA: sayatan jaringan, kultur mamalia,
kultur serangga, darah (sel darah putih).
• Pemanasan sampel DNA
• Hibridisasi dengan pelacak bertanda
(fluoresens)
Analisis FISH gen RUNX1 yang mengalami peningkatan jumlah
kopi pada penderita leukemia akut karena polisomi pada
kromosom 21.
RUNX1: Merah; TEL: Hijau
06_16.jpg