DESAIN DNA PENDETEKSI MUTASI P Mycobacterium tuberculos
advertisement
DESAIN DNA PROBE SECARA IN SILICO SEBAGAI PENDETEKSI MUTASI PADA KODON 315 GEN katG Mycobacterium tuberculosis UNTUK METODE REALTIME POLYMERASE CHAIN REACTION Skripsi KADEK WIDYA YULIHARTATI 1208505010 JURUSAN FARMASI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS UDAYANA 2016 52 DESAIN DNA PROBE SECARA IN SILICO SEBAGAI PENDETEKSI MUTASI PADA KODON 315 GEN katG Mycobacterium tuberculosis UNTUK METODE REALTIME POLYMERASE CHAIN REACTION Skripsi KADEK WIDYA YULIHARTATI 1208505010 JURUSAN FARMASI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS UDAYANA 2016 53 54 KATA PENGANTAR Puji syukur penulis panjatkan kehadapan Tuhan Yang Maha Esa, Ida Sang Hyang Widhi Wasa, karena berkat rahmat-Nya penulis dapat menyelesaikan Skripsi yang berjudul “DESAIN DNA PROBE SECARA IN SILICO SEBAGAI PENDETEKSI katGMycobacterium MUTASI tuberculosis PADA UNTUK KODON METODE 315 GEN REAL-TIME POLYMERASE CHAIN REACTION”. Skripsi ini diajukan sebagai syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) di Jurusan Farmasi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Udayana. Penulisan Skripsi ini tidak terlepas dari dukungan dan bantuan berbagai pihak secara langsung dan tidak langsung. Oleh karena itu, penulis ingin menyampaikan rasa terima kasih kepada: 1. Bapak Drs. Ida Bagus Made Suaskara, M.Si, selaku Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Udayana. 2. Dr. rer. nat. I Made Agus Gelgel Wirasuta, M.Si., Apt., selaku Ketua Jurusan Farmasi, Fakultas MIPA, Universitas Udayana. 3. Putu Sana Yustiantara, S.Farm., M.Si., Apt., selaku dosen pembimbing I yang telah membimbing hingga akhir penyusunan Skripsi ini. 4. Dr. Sagung Chandra Yowani, S.Si., Apt., M.Si., selaku dosen pembimbing II yang membimbing dan memotivasi demi kelancaran penyusunan Skripsi ini. 5. Rasmaya Niruri, S.Si., M.Farm.Klin., Apt., Luh Putu Mirah Kusuma Dewi, SF. M.Sc., Apt., dan Putu Oka Samirana, S.Farm., M.Sc. Apt., selaku dosen penguji yang telah memberikan saran-saran untuk penyusunan Skripsi ini. 55 6. Seluruh dosen pengajar beserta pegawai di Jurusan Farmasi, Fakultas MIPA, Universitas Udayana yang telah membina penulis dan membantu memenuhi kelengkapan administratif. 7. Kedua orang tua penulis, I Nyoman Wardana dan Ni Ketut Mariani yang tidak berhenti memberikan dukungan moral, materiil, doa dan semangat. 8. Saudara penulis Rida Ari Anggraeni (Mida) yang selalu mendukung dan memberikan semangat dan nasihat bagi penulis. 9. Mtb team (Dek tri, Rai, Linda, Ratih, Ebi) dan kakak kelas dari Mtb team yang telah menjadi teman diskusi, memberi saran untuk kelancaran penyusunan Skripsi ini. 10. Teman-teman TANPO (Tantri, Novi, Anggi, Lina, Linda, Sarah, dan Meci) yang selalu menghibur dan memotivasi penulis. 11. Teman Dioscury Hygeia dan pihak-pihak lain yang tidak dapat penulis sebutkan satu per satu. Penulis sepenuhnya menyadari bahwa penulisan Skripsi ini masih jauh dari kesempurnaan. Oleh karena itu, penulis mengharapkan kritik dan saran dari semua pihak demi karya yang lebih baik di masa yang akan datang. Semoga Skripsi ini dapat bermanfaat bagi semua pihak. Bukit Jimbaran, 8 Juni 2016 Penulis 56 DAFTAR ISI Halaman HALAMAN JUDUL ............................................................................................ i LEMBAR PENGESAHAN ................................................................................. ii KATA PENGANTAR ........................................................................................ iii DAFTAR ISI ........................................................................................................ v DAFTAR SINGKATAN .................................................................................. viii DAFTAR SINGKATAN ASAM AMINO .......................................................... x DAFTAR ISTILAH ............................................................................................ xi DAFTAR TABEL ............................................................................................. xiii DAFTAR GAMBAR ........................................................................................ xiv DAFTAR LAMPIRAN ...................................................................................... xv ABSTRAK ....................................................................................................... xvi ABSTRACT .................................................................................................... xvii BAB I PENDAHULUAN ................................................................................ 1 1.1 Latar Belakang ............................................................................. 1 1.2 Rumusan Masalah ........................................................................ 5 1.3 Tujuan Penelitian ......................................................................... 6 1.4 Manfaat Penelitian ....................................................................... 6 BAB II TINJAUAN PUSTAKA ....................................................................... 7 2.1 Tuberkulosis (TB) ........................................................................ 7 2.2 Genom Mycobacterium tuberculosis ........................................... 8 2.3 Gen KatG Mycobacterium tuberculosis....................................... 9 57 2.4 Mutasi Gen ................................................................................. 11 2.5 Resistensi Isoniazid (INH) ......................................................... 12 2.6 Real-Time Polymerase Chain Reaction (Real-Time PCR) ........ 14 2.7 DNA Probe ................................................................................ 15 BAB III METODE PENELITIAN.................................................................... 20 3.1 Rancangan Penelitian ................................................................. 20 3.2 Batasan Operasional Penelitian ................................................. 21 3.3 Lokasi dan Waktu Penelitian ..................................................... 21 3.4 Bahan Penelitian ........................................................................ 22 3.5 Alat Penelitian ............................................................................ 23 3.6 Prosedur Penelitian .................................................................... 23 3.6.1 Urutan Nukleotida Target Perancangan DNA Probe Mutan ................................................................................ 23 3.6.2 Perancangan DNA Probe .................................................. 25 3.6.3 Analisis Hasil Perancangan DNA Probe .......................... 25 3.7 Penyimpulan Hasil Penelitian ................................................... 27 BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ........................................................... 28 4.1 Urutan Nukleotida Target Perancangan DNA Probe Mutan ..... 28 4.2 Hasil Perancangan DNA Probe ................................................. 30 4.3 Hasil Analisis Rancangan Probe Mutan .................................... 33 4.3.1 Hasil Analisis Kriteria Umum Probe Mutan ................... 33 4.3.2 Hasil Analisis Pelabelan Probe Mutan ............................ 43 58 BAB V KESIMPULAN DAN SARAN .......................................................... 51 5.1 Kesimpulan ............................................................................... 51 5.2 Saran ......................................................................................... 51 DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................ 52 LAMPIRAN ....................................................................................................... 59 59 DAFTAR SINGKATAN Cy3 : Cyanine-3 Cy5 : Cyanine-5 DNA : Deoxyribonucleic acid DNA : Deoxyribonucleic acid dNTP : Deoxynucleotide triphosphates FAM : 6-carboxyfluorescein FRET : Fluorescence Resonance Energy Transfer GC : Guanin-Sitosin HIV : Human Immunodeficiency Virus INH : Isoniazid MDR : Multi-drug resistant MIC : Minimum Inhibitory Concentration NADH : Nicotinamide Adenine Dinucleotide OAT : Obat Anti Tuberkulosis pb : pasang basa PCR : Polymerase Chain Reaction PE : Prolin Glutamat PGRS : Polymorphic GC-rich repetitive sequences PPE : Prolin Prolin Glutamat ROX : 6-Carboxyl-X-Rhodamine TAMRA : 6-carboxytetramethyl-rhodamine 60 Taq : Thermus aquaticus TB : Tuberkulosis Tm : Melting temperature tRNA : Transfer Ribonucleic Acid WHO : World Health Organization VIC : 4,7,2’-trichloro-7’-phenyl-6-carboxyfluorescein XDR : Extensively-drug resistant 61 DAFTAR SINGKATAN ASAM AMINO C : Sistein F : Fenilalanin G : Glisin N : Asparagin P : Prolin Q : Glutamin R : Arginin S : Serin T : Treonin V : Valin 62 DAFTAR ISTILAH Amplifikasi DNA : Perbanyakan DNA Asam amino : Unit monomer penyusun protein yang dihubungkan melalui ikatan peptida Dimer : Primer mengalami hibridisasi secara bersama-sama DNA polimerase : Enzim yang diperlukan dalam proses sintesis DNA Fluoresensi : Pemancaran sinar oleh suatu zat yang telah menyerap sinar atau radiasi elektromagnetik lain Fluorophore : Komponen kimia yang dapat mengemisikan kembali cahaya pada proses eksitasi Gen : Urutan DNA yang menyandi suatu protein H37Rv : Galur standar yang dijadikan wild type M. tuberculosis Hairpin : Struktur lengkungan yang dibentuk oleh DNA tunggal akibat adanya suatu bagian tertentu dari DNA yang terhibridisasi pada bagian komplemen di dalam untai DNA yang sama Hibridisasi : Proses pemasangan antara DNA yang menjadi sasaran dan DNA pelacak. In silico : Menggunakan komputerisasi Kodon : Deret nukleotida pada mRNA yang terdiri atas kombinasi tiga nukleotida berurutan yang menyandi suatu asam amino tertentu Mutan : Agen yang mengalami mutasi 63 Mutasi DNA : Perubahan basa dari urutan nukleotida yang lazim dari suatu sekuen DNA organisme yang dapat menyebabkan perubahan sifat fenotip Nukleotida : Unit monomer pembentuk DNA PCR (Polymerase : Teknik amplifikasi sekuens DNA dengan menggunakan Chain Reaction) Primer reaksi enzimatis : Oligonukleotida pendek yang komplementer dengan urutan nukleotida template DNA DNA Probe : Molekul asam nukleat berupa rantai tunggal DNA yang memiliki afinitas kuat dengan target spesifik yang berupa urutan DNA atau RNA. Prodrug : Senyawa yang tidak aktif namun di dalam tubuh dapat menjadi aktif karena proses enzimatik Repeat : Pengulangan dinukleotida secara berurutan Resistensi : Hilangnya sensitivitas bakteri terhadap obat yang sebelumnya dapat membunuh bakteri Runs : Pengulangan basa tunggal sama secara berurutan Template DNA : DNA untai ganda yang membawa urutan basa fragmen atau gen yang akan digandakan Tetraplex : Struktur DNA yang dibentuk dari urutan kaya G yang terjadi antara empat basa guanin melalui ikatan hidrogen Wild type : Bakteri yang tidak mengalami mutasi dan digunakan sebagai sekuen pembanding terjadinya mutasi 64 DAFTAR TABEL Halaman Tabel 2.1 Perubahan Asam Amino Akibat Mutasi Pada Kodon 315............ 11 Tabel 3.1 Hasil Kriteria Primer Yang Telah Didesain Secara In Silico dengan Clone Manager Suite 6 ..................................................... 22 Tabel 3.2 Perubahan Nukleotida Kodon 315 Gen katG Mycobaterium tuberculosis Untuk Perancangan DNA Probe Mutan ................... 24 Tabel 3.3 Format Tampilan Hasil Analisis Awal Probe Mutan ................... 26 Tabel 3.4 Analisis Tahap Akhir Probe Mutan .............................................. 27 Tabel 4.1 Hasil Analisis Tahap Awal Probe Mutan Untuk Kodon 315 ....... 35 Tabel 4.2 Hasil Analisis Tahap Akhir Probe Mutan ................................... 46 65 DAFTAR GAMBAR Halaman Gambar 2.1 Genom Mycobacterium tuberculosis H37Rv secara sirkuler ........ 9 Gambar 2.2 Skema Daerah furA-katG M. tuberculosis................................... 10 Gambar 2.3 Struktur Kimia Isoniazid ............................................................. 13 Gambar 2.4 Mekanisme Kerja TaqMan Probe ............................................... 19 Gambar 3.1 Skema Alur Penelitian Desain DNA Probe Secara In Silico ...... 20 Gambar 3.2 Urutan Nukleotida Gen katG Mycobacterium tuberculosis Yang Dijadikan Target Perancangan DNA Probe ...................... 24 Gambar 4.1 Pengaruh Posisi Mutasi Terhadap Hibridisasi Probe .................. 32 Gambar 4.2 Contoh Tampilan Hasil Analisis Tahap Awal Pada Software ..... 34 Gambar 4.3 Runs Pada Desain Probe Mutan K315MR8 ................................ 40 Gambar 4.4 Hasil Analisis Dimer Pada Desain Probe Mutan K315MN23 .... 41 Gambar 4.5 Penggambaran struktur hairpin yang dibentuk oleh probe mutan K315MT1 dengan Clone Manager Suite 6 ...................... 42 Gambar 4.6 Posisi Basa G Pada Probe K315MT4, K315MV4, dan K315MN3 .................................................................................... 44 Gambar 4.7 Pelabelan Desain Probe K315MT1 ............................................. 47 Gambar 4.8 Pelabelan Desain Probe Mutan Untuk Deteksi Mutasi S315N .. 49 66 DAFTAR LAMPIRAN Halaman Lampiran 1 Peta Urutan Nukleotida Gen katG Mycobacterium tuberculosis ... 59 Lampiran 2 Hasil Perancangan In Silico Probe Mutan Spesifik Mutasi S315T Dengan Clone Manager Suite 6 ......................................... 61 Lampiran 3 Hasil Perancangan In Silico Probe Mutan Spesifik Mutasi S315N Dengan Clone Manager Suite 6 ........................................ 62 Lampiran 4 Hasil Perancangan In Silico Probe Mutan Spesifik Mutasi S315R Dengan Clone Manager Suite 6 ......................................... 63 Lampiran 5 Hasil Perancangan In Silico Probe Mutan Spesifik Mutasi S315G Dengan Clone Manager Suite 6 ........................................ 64 Lampiran 6 Hasil Perancangan In Silico Probe Mutan Spesifik Mutasi S315V Dengan Clone Manager Suite 6 ........................................ 65 Lampiran 7 Hasil Analisis Probe Mutan K315MT1 Dengan Software Clone Manager Suite 6 .................................................................. 66 Lampiran 8 Hasil Analisis Probe Mutan K315MN5 Dengan Software Clone Manager Suite 6 .................................................................. 67 Lampiran 9 Hasil Analisis Probe Mutan K315MN23 Dengan Software Clone Manager Suite 6 .................................................................. 68 Lampiran 10 Analisis Tahap Akhir Probe Mutan ............................................ 69 67 ABSTRAK Resistensi tingkat tinggi terhadap isoniazid sebagai salah satu obat lini pertama tuberkulosis dapat disebabkan oleh mutasi kodon 315 gen katG Mycobacterium tuberculosis. Mutasi pada kodon 315 adalah mutasi yang paling sering terjadi dengan variasi asam amino paling tinggi, dibandingkan kodon lain pada gen katG Mycobacterium tuberculosis. Oleh karena itu, probe yang spesifik diperlukan untuk deteksi cepat dan tepat adanya mutasi pada kodon 315. Pada penelitian ini, perancangan urutan nukleotida probe dengan pelabelan TaqMan dilakukan menggunakan software Clone Manager Suite 6. Probe mutan yang diperoleh, dianalisis dua tahap. Analisis tahap awal didasarkan pada panjang probe (22-30 basa), Tm (70ºC), %GC (35-65%), tidak terbentuk hairpin, dimer (< 5 basa), runs dan repeat (≤ 4 untuk basa A, T, C, dan < 3 untuk basa G). Selanjutnya dilakukan analisis tahap akhir dengan kriteria, yaitu tidak terdapat basa G pada 2 basa di ujung 5’ probe dan jumlah basa C ≥ G. Penelitian menghasilkan 260 probe mutan. Setelah analisis tahap awal diperoleh 11 probe mutan yang mampu mengenali mutasi pada kodon 315 gen katG Mycobacterioum tuberculosis. Probe tersebut terdiri dari 2 probe untuk mutasi S315T, 6 probe untuk mutasi S315N, dan 3 probe untuk mutasi S315V. Kriteria yang dimiliki 11 probe mutan adalah panjang 22-23 basa, Tm 70ºC, % GC 56-63%, 4 dimer, 2 runs, dan tidak memiliki repeats dan tidak membentuk hairpin pada suhu 56ºC. Berdasarkan analisis tahap akhir, diperoleh 3 probe mutan memenuhi kriteria pelabelan TaqMan probe, yaitu K315MT1 untuk deteksi spesifik mutasi S→T serta K315MN5 dan K315MN23 untuk deteksi spesifik mutasi S→N. Kesimpulan dari penelitian ini adalah urutan nukleotida probe mutan terbaik untuk deteksi adanya mutasi pada kodon 315 gen katG Mycobacterium tuberculosis, yaitu 5’-FAM-CC ACC GGC ATC GAG GTC GTA TG-TAMRA3’; 5’FAM-ATC ACC AAC GGC ATC GAG GTC G-TAMRA-3’; dan 5’FAM-C ACC AAC GGC ATC GAG GTC GTA T-TAMRA-3’. Rancangan probe mutan yang telah sesuai dengan kriteria TaqMan probe untuk real-time PCR diperoleh sebanyak 3 probe dari 11 probe mutan terpilih pada analisis tahap awal. Kata kunci: Tuberkulosis, mutasi gen katG, in silico, TaqMan probe, real-time PCR. 68 ABSTRACT High level resistance of isoniazid as one of first-line tuberculosis drugs can be caused by mutations at codon 315th in katG gene of Mycobacterium tuberculosis. Mutation at codon 315 is the most often case and has the highest amino acid variations, compared to the other codons in the katG gene of Mycobacterium tuberculosis. Therefore, specific probes required for rapid and precisely detection of mutations at codon 315. In this study,the nucleotide sequence with TaqMan probe was designed by using Clone Manager Suite 6 Software. Probe mutants were analyzed in two stages. Analysis of the initial stages of the probe based on length of the probe (22-30 bases), Tm (70ºC), %GC (35-65%), non-hairpin formed, dimer (<5 bases), runs and repeats (≤ 4 for bases A, T, C, and < 3 to the base G). The analysis of final stage is based on no G at two first bases in the 5’ position of probe and amount of C ≥ G. The result has 260 mutant probes. After the initial stage of analysis, obtained 11 mutant probe that capable of recognize a mutation at codon 315th in katG gene of Mycobacterioum tuberculosis. Those probe consists of 2 probes for mutation S315T, 6 probes for mutation S315N, and 3 probes for mutation S315V. Criteria of 11 mutant probe were 22-23 bases long, Tm 70ºC,% GC 56-63%, 4 dimers, 2 runs, and does not have repeats and does not form a hairpin at a temperature of 56ºC. Based on the analysis of the final stage, gained 3 mutant probes meet the labeling criteria of TaqMan probe, namely K315MT1 for the specific detection of mutation S→T, K315MN5 and K315MN23 for the specific detection of mutation S→N. The conclusion of this study was nucleotide sequence of best mutant probes for the detection of mutation at codon 315th in katG gene of Mycobacterium tuberculosis, that are 5’-FAM-CC ACC GGC ATC GAG GTC GTA TG-TAMRA-3’; 5’FAM-ATC ACC AAC GGC ATC GAG GTC GTAMRA-3’; and 5’FAM-C ACC AAC GGC ATC GAG GTC GTA T-TAMRA3’. Design of mutant probes which were accordanced with the criteria of TaqMan probe for real-time PCR obtained as many as 3 of 11 mutant probes selected at initial stage of analysis. Key word: Tuberculosis, katG gene mutations, in silico, TaqMan probe, real-time PCR.
