Metodologi : Topik penelitian dibagi menjadi 6 subtopik, tiap

Hibah Tim Penelitian Pasca Sarjana (HTPP)
Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi
Departemen Pendidikan Nasional
No : APHT/2003/0011/018
Polimorfisme dan Isoform Gen Reseptor FSH
Wanita Indonesia : Implikasinya Pada Penanganan
Infertilitas dan Kesehatan Reproduksi
Purnomo Soeharso1, Nukman H. Moeloek1 dan Farid A. Moeloek2
1) Departemen Biologi Kedokteran, Fakultas Kedokteran
Universitas Indonesia, Jakarta.
2) Bagian Obstetri dan Ginekologi, Rumah Sakit Umum Pusat Negri
Cipto Mangun Kusumo (RSUPN CM), Jakarta.
Pendahuluan
1. Infertilitas pada wanita meliputi 45% dari semua
kasus infertilitas.
2. Mempunyai implikasi pada masalah kependudukan,
distribusi kemakmuran dan kesejahteraan pada
tingkat keluarga dan negara.
3. Penanganan infertilitas adalah penting dalam
pengelolaan kesehatan reproduksi di Indonesia.
4. Program reproduksi berbantuan merupakan salah
satu upaya mengatasi masalah infertilitas untuk
mendapatkan keturunan bagi pasangan infertil.
5. Stimulasi ovarium oleh gonadotropin (FSH & LH)
adalah mekanisme sentral dalam pengaturan siklus
reproduksi wanita.
6. Respon ovarium terhadap stimulasi FSH eksogen
pada wanita usia reproduksi yang mengikuti
program reproduksi berbantuan (IVF/ICSI)
bervariasi pada beberapa individu.
- Stimulasi FSH pada ovarium berlangsung melalui
interaksi antara FSH dengan reseptor spesifiknya
(reseptor FSH) pada sel-sel granulosa ovarium.
- Variasi reseptor FSH menyebabkan perbedaan
afinitas FSH terhadap reseptornya pada sel
target sehingga menghasilkan respon bervariasi
pada beberapa individu : tidak ada respon, respon
lemah, respon baik atau sindrom hiperstimulasi.
- Varian reseptor FSH dapat dihasilkan oleh
isoform yang ditentukan oleh genotip dan
polimorfisme pada promoter gen reseptor FSH
 Isoform reseptor FSH adalah varian genotip yang
ditentukan oleh polimorfisme pada exon 10 gen
struktur reseptor FSH.
 Polimorfisme pada exon 10 posisi :
307 menghasilkan kode Ala atau Thre
680 menghasilkan kode Asn atau Ser
Pada wanita Kaukasia menghasilkan 3 isoform
Asn/Asn, Asn/Ser, Ser/Ser.
 Skrining polimorfisme promoter gen reseptor
FSH menghasilkan 5 polimorfisme pada promoter
inti pada posisi –138, - 114, - 91, - 37 dan – 29.
Peta gen struktur reseptor FSH
Model skematis daerah 5’ flanking gen
RFSH manusia
core promoter
Transcriptional start sites
Exon 1
-184
-1486 bp
-114 -99 -83 -79
repressor
polymorphic sites
Intron A
Permasalahan
1. Distribusi isoform dan polimorfisme promoter gen
reseptor FSH pada wanita Indonesia belum
diketahui.
2. Perlu dibuktikan adanya hubungan antara isoform
reseptor FSH dengan sensitifitas ovarium
terhadap stimulasi FSH eksogen.
3. Perlu dibuktikan adanya hubungan antara
polimorfisme promoter gen reseptor FSH dengan
ekspresi reseptor FSH pada sel-sel granulosa
ovarium.
4. Pengaruh isoform dan polimorfisme promoter gen
reseptor FSH pada kelainan atau penyakit hormonal
seperti amenorhoea primer dan endometriosis
belum diketahui.
5. Pengaruh isoform dan polimorfisme promoter gen
reseptor FSH pada kelainan fungsi ovarium seperti
ovarium polikistik dan sindroma resistensi ovarium
belum diketahui.
Tujuan umum :
Mengetahui isoform reseptor FSH dan polimorfisme
promoter gen reseptor FSH sehingga dapat
menentukan efektifitas stimulasi FSH terhadap
ovarium.
Meluluskan 2 peserta program S3 dan 4 peserta
program S2 Biomedik pada akhir 2005.
Tujuan khusus :
1. Mengetahui hubungan antara isoform dan
polimorfisme promoter gen reseptor FSH dengan
level FSH basal.
2. Mengetahui efektifitas stimulasi FSH pada
reseptor FSH yang mempunyai isoform dan
polimorfisme gen promoter berbeda secara in vitro.
3. Membuat prediksi dosis FSH yang efektif untuk
induksi ovarium pada wanita yang mengikuti
program reproduksi berbantuan IVF/ICSI
berdasarkan data isoform reseptor FSH dan
polimorfisme promoter gen reseptor FSH.
4. Membuat kesimpulan tentang perlunya mendeter
minasi isoform reseptor FSH dan polimorfisme
gen promoternya sebagai faktor predisposisi pada
kasus-kasus endometriosis, ovarium polikistik dan
menopouse prematur atau late menopouse.
5. Menentukan teknik yang sensitif untuk mendeterminasi isoform atau genotip reseptor FSH.
Metodologi :
Topik penelitian dibagi menjadi 6 subtopik, tiap
subtopik dikerjakan oleh seorang mahasiswa.
Subtopik I :
Polimorfisme gen reseptor FSH (isoform reseptor
FSH) pada wanita Indonesia yang mengikuti program
reproduksi berbantuan IVF/ICSI.
oleh
: Dwi Anita Suryandari, S.Si.,
M.Biomed
Mahasiswa S3 Biomedik FKUI
lama penelitian : 3 tahun
Subtopik II :
Polimorfisme pada promoter gen reseptor FSH wanita
Indonesia usia reproduktif dan pengaruhnya terhadap
expresi reseptor FSH.
oleh
: Yuni Ahda, S.Si., M. Biomed
Mahasiswa S3 Biomedik FKUI
lama penelitian : 3 tahun.
Subtopik III :
Pengaruh isoform FSH pada kelainan hormonal
endometriosis
oleh
: Monica Dwi Hartanti, dr.
Mahasiswa S2 Biomedik FKUI
lama penelitian : 1 tahun.
Subtopik IV :
Determinasi polimorfisme gen reseptor FSH (isoform
reseptor FSH) dengan teknik PCR-SSCP dan
PCR-RFLP.
oleh
: Daniel Joko Wahyono, Drs.
Mahasiswa S2 Biomedik FKUI.
lama penelitian : 1 tahun.
Subtopik V :
Pengaruh isoform reseptor FSH pada kelainan
ovarium polikistik.
oleh
: Laksmi Wingit Ciptaning, S.Si.
Mahasiswa S2 Biomedik FKUI
lama penelitian : 1 tahun.
Subtopik VI :
Pengaruh isoform FSH dan polimorfisme promoter
gen reseptor FSH pada usia rata-rata menopause
wanita Indonesia dengan riwayat siklus reproduksi
normal.
oleh
: ditentukan kemudian
Mahasiswa S2 biomedik FKUI
lama penelitian
: 1 tahun
Cara Kerja :
isolasi DNA dari sampel darah
Amplifikasi exon 10
PCR-SSCP & PCR- RFLP
Uji sensitifitas
isoform in vitro
Deteksi cAMP
level pada sel
granulosa
Amplifikasi promoter inti
PCR-SSCP & DNA sequencing
Uji aktifitas promoter
untuk melihat kapasitas
expresi in vitro
Mengukur aktifitas
reporter gen luciferase
yang ditransfeksi ke
sertoli cell line
Hasil penelitian tahun II
1. Koleksi sampel
Sampel darah dikumpulkan dari pasien & volunteer
oleh mahasiswa peneliti sesuai dengan keperluannya
masing-masing.
2. Optimasi teknik mendeterminasi isoform &
polimorfisme promoter gen reseptor FSH
 Amplifikasi exon 10 gen reseptor FSH untuk
determinasi isoform reseptor FSH dengan PCR.
Primer D dan G1 untuk amplifikasi exon 10 yang
mengcover situs polimorfik posisi 680 :
5’ GAG CAA GTG TGG CTG CTA TG 3’
Primer kedua untuk amplifikasi DNA exon 10 yang
mengcover situs polimorfik posisi 307 :
5’ GCT ATA CTG GAT CTG AGA TG 3’
5’ ACC ACT TCA TTG CAT AAG TC 3’
 Amplifikasi DNA promoter inti gen reseptor FSH
pada rentang antara –231 dan –1 dengan PCR
menggunakan primer :
5’ TAT TCC AGA CAT GCC TAA TGG 3’
5’ CCA GCA AAG AGA CCA GGA GC 3’
 Teknik SSCP & RFLP amplikon exon 10 gen
reseptor FSH dan promoter inti gen reseptor
FSH.
 Sikuensing DNA untuk konfirmasi hasil SSCP.
Amplifikasi exon 10 gen reseptor FSH dengan
primer mengcover posisi situs polimorfik 680
258 bp
Analisa SSCP exon 10 gen reseptor FSH posisi
680 menghasilkan 3 genotip (isoform) FSH
Asn/Ser Ser/Ser
Asn/Asn
Amplifikasi exon 10 gen reseptor FSH dengan
primer mengcover posisi situs polimorfik 307
222 pb
Analisis SSCP exon 10 gen reseptor FSH posisi
307 menghasilkan 3 genotip (isoform) FSH

Ala/Ala

Thr/Thr

Ala/Thr
PCR-RFLP gen reseptor FSH exon 10 posisi
680 dengan enzim restriksi Bsr1.
Hasil amplifikasi daerah promoter
inti reseptor FSH manusia (231 bp)
ekson 1
-1486
(pb)
-231
M
1
2
intron A
-1
3
4
5
6
7
8
9
10
310
231 pb
234
Analisis SSCP promoter inti gen reseptor
FSH
wt
-29
-114
-138
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
Distribusi isoform dan genotip reseptor FSH pada
wanita Indonesia berbeda dengan yang terjadi pada
wanita Kaukasia (Jerman)
Tabel 2. Frekuensi genotip pada posisi 307 dan 680
exon 10 gen FSHR
Posisi 680
Asn/Asn
(%)
Asn/ser
(%)
Ser/Ser
(%)
Thre/Thre
21
9
10
Thre/Ala
12
30
6
Ala/Ala
3
6
10
Posisi 307
70
60
60
50
50
40
kontrol
WHO-2
30
persentase
Persentase
40
kontrol
30
WHO-2
20
20
10
10
0
0
AA
AT
TT
genotip gen FSHR(posisi307)
SS
AS
AA
genotip FSHR (posisi 680)
Perbandingan distribusi genotip antara kelompok kontrol dan kelompok
wanita infertile anovulatory normogonadotropik (WHO-2) berdasarkan
polimorfisme gen FSHR posisi 307 dan 680.
Tabel 3. Hubungan isoform reseptor FSH
dengan level FSH basal
Genotip
Rata-rata konsentrasi
Reseptor FSH FSH serum hari 3
postmenstruasi
Thre/Thre
6,74 ± 2,4
Thre/Ala
6,48 ± 2,5
Ala/Ala
7,88 ± 2,7
Asn/Asn
6,67 ± 3,05
Asn/Ser
6,73 ± 2,3
Ser/Ser
6,86 ± 2,1
Posisi polimorfisme yang ditemukan pada promotor inti
reseptor FSH manusia
Persentase polimorfisme
Frekuensi polimorfisme promoter inti gen
FSHR pada wanita Jerman dan Indonesia
Posisi polimorfisme
Produk PCR promoter inti yang
telah diidentifikasi
Klon ke dalam vektor TOPO
Keluarkan fragmen DNA
promoter dari vektor TOPO
Subklon ke vektor expresi pGL3
yang membawa reporter luciferase
Transfeksikan ke certoli cell line
Assay luciferase activity
Ekspresi relatif (rata-rataSEM)
konstruksi pGL3/promotor inti RFSH
Rata-rata hari penyuntikan FSH
Grafik hubungan polimorfisme dengan ratarata hari penyuntikan FSH sampai OPU
Promotor
Tabel 4. Frekuensi isoform reseptor FSH pada
penderita endometriosis dibanding kontrol
Isoform
680
Isoform
307
Asn/Asn Asn/Ser Ser/Ser Ala/Ala Ala/Thr Thr/Thr
Kontrol (normal)
N = 50
0,38
0,14
0,48
0,204
0,367
0,429
Endometriosis
N = 42
0,30
0,45
0,25
0,167
0,50
0,333
Tabel 1. Perbandingan efektifitas PCR-SSCP dan PCR-RFLP
untuk mendeterminasi polimorfisme exon 10 posisi 680 gen
FSHR.
Jumlah
Sampel
(N)
Sampel yang Sampel tidak
teridentifikasi teridentifikasi
Sensitifitas
pemeriksaan
PCR-SSCP
148
146
2
0,986
PCR-RFLP
135
81
54
0,612
2 = 4,66
P  0,05
Rencana kerja tahun ke III
Subtopik I
Uji sensitifitas isoform FSH terhadap stimulasi FSH
in vitro.
- Sel granulosa diisolasi dari ovarium wanita yang
telah dideterminasi isoform reseptor FSHnya,
peserta program reproduksi berbantuan pada waktu
ovum pick up.
- Sel granulosa dikultur pada medium standart dan
distimulasi FSH eksogen beberapa menit.
- Respon sel granulosa terhadap stimulasi FSH diukur
dari perubahan level cAMP sel granulosa sebelum
distimulasi FSH dan sesudah distimulasi FSH
dengan khromatografi pertukaran ion.
Sel granulosa ovarium
(dicuci dengan Hank’s basic salt solution)
Dikultur pada media standart
RPMI + serum, 24 jam
Stimulasi FSH, 15 menit
Freeze -20C, 30 menit
Lisis sel dengan deterjen
Triton X-100
Pisahkan & ukur cAMP dengan
khromatografi pertukaran ion
Subtopik III
Uji PCR-SSCP gen reseptor FSH pada wanita dengan
endometriosis dan hubungannya dengan level FSH
basal
Subtopik IV
Membandingkan efektifitas uji PCR-SSCP dan PCRRFLP untuk mendeterminasi isoform reseptor FSH.
Subtopik V
Uji PCR-SSCP gen reseptor FSH pada wanita
dengan ovarium polikistik.
Subtopik VI
Uji PCR-SSCP gen reseptor FSH pada wanita
dengan usia menopouse berbeda & riwayat
siklus reproduksi normal.
Kesimpulan :
 Pola distribusi genotip dan polimorfisme promoter gen
reseptor FSH pada populasi wanita Indonesia berbeda
dengan pola distribusinya pada populasi wanita kaukasia
(Jerman).
 Genotip Ala/Thre dan Ser/Ser pada wanita Indonesia
berimplikasi pada sensitivitas ovarium yang rendah
terhadap stimulasi FSH eksogen.
 Polimorfisme promoter inti gen reseptor FSH pada -129
menurunkan aktivitas promoter secara signifikan.
 PCR-SSCP adalah teknik yang sensitif dan reliabel untuk
mendeterminasi isoform reseptor FSH dan polimorfisme
promoternya.
Publikasi Ilmiah Hasil Penelitian
Ahda, Y., Soeharso, P., The expression of follicle-stimulating
hormone receptor in ovary and testis. Med. J.
Indones. 12 : 187 – 193, 2003.
Joop Laven, S.E., Annemarie, G.M., Mulders, G.J., Suryandari,
D.A., Gromoll, J., Nieschlag, E., Fauser, J.M, Simoni,
M. Follicle-stimulating hormone receptor polymor
phisms in women with normogonadotropic anovulatory
infertility. Fertil. Steril. 80 : 986 – 992, 2003.
Ahda, Y., Gromoll, J., Soeharso, P., Inawati, S, Moeloek, N.
Single nucleotide polymorphisms of folliclestimulating hormone receptor promoter and their
impacts to the promoter activities. Med. J. Indones.
13 : 2005 – 214.
Presentasi dalam seminar
Soeharso, P., Ahda, Y., Moeloek, N. The variation of
luciferace reporter gene expression driven by
the core promoter of human FSH receptor gene
with different point mutation, 2nd Conference on
Medical Sciences, 18 – 21 August 2002, Medan.
Suryandari, D.A., Moeloek, N., Soeharso, P., Gromoll, J.,
Simoni, M. Analisis polimorfisme gen FSHR pada
51 wanita Indonesia dan 187 wanita Rotterdam,
PIT XIV Perkumpulan Andrologi Indonesia, 18 –
19 Juli 2002, Sanur, Bali.
Soeharso, P., Ahda, Y., Moeloek, N. Uji ekspresi gen
reporter luciferase untuk mengukur aktivitas gen
promoter reseptor FSH dan bentuk polimorfik
nya. PIT XIV Perkumpulan Andrologi Indonesia,
18 – 19 Juli 2002, Sanur, Bali.
Laven, J., Mulder, A., Suryandari, D.A., Gromoll, J., Nieschlag, E, Fauser, B.,
Simoni, M., Soeharso. P., Moeloek, N. Polimorfisme gen FSHR
pada wanita infertil anovulatory gonadotropik (WHO-2). Seminar
Nasional PBBMI, 2 Oktober 2004, Yogyakarta.
Ahda, Y., Gromoll, J., Soeharso, P., Inawati, S., Moeloek, N. Single
nucleotide Polymorphisms (SNPs) promoter gen reseptor FSH
dan pengaruhnya terhadap aktivitas promoter. Seminar Nasional
PBBMI, 2 Oktober 2004, Yogyakarta.
Wahyono, D.J., Suryandari, D.A., Moeloek, N., Soeharso, P. Perbandingan
sensitivitasmetoda PCR-SSCP dengan PCR-RFLP untuk deteksi
polimorfisme kodon680 ekson 10 gen FSHR. Seminar Nasional
PBBMI, 2 Oktober 2004, Yogyakarta.
Terima kasih