MDA - Digilib ITS

PELACAKAN AKTIVITAS ANTIKANKER TERHADAP TIGA SENYAWA
SANTON TERPRENILASI DARI SPESIES GARCINIA
Oleh:
Dwi Oktaviani Jamil
(1406 100 062)
Dosen Pembimbing:
Prof.Dr.Taslim Ersam,MS.
Jurusan Kimia
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
ITS Surabaya 2010
PAKTI
LATAR BELAKANG
Pengobatan
KANKER
Bahan bioaktif sintetis
Kemoterapi
Bahan bioaktif dari
Isolasi Bahan Alam
Sel kanker
TUMBUHAN
Sel kanker
Garcinia sp.
Senyawa Metabolit
Sekunder
Santon
ANTIKANKER
Hutan Tropika
Indonesia
O
A
B
O
PAKTI
•
PERMASALAHAN
Santon
Terprenilasi
ANTIKANKER
?
TUJUAN
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas senyawa-senyawa santon terprenilasi
yang diisolasi dari spesies Garcinia sebagai antikanker baru.
PAKTI
METODOLOGI
Alat:
bak pemeliharaan hewan coba, gavage, seperangkat alat bedah, seperangkat alat gelas (labu
takar, pipet tetes, mikro pipet, gelas ukur, gelas beaker, gelas arloji, tabung reaksi, corong gelas),
mortar, mikropipet, rak tabung reaksi, penangas air, stirrer, botol semprot, waterbath, tabung
mikro (Ependorf), lemari pendingin, digital pH meter (Inolab-WTW), neraca analitik (Sartorius
basic P-160), tabung sentrifugasi, alat sentrifugasi (Denley tipe BR 401), inkubator (memmert),
spektrofotometer UV-Vis (Shimadzu), mikroskop cahaya (Nicon), hot plate, dan autoklaf
(Gnatus).
Bahan:
Bahan-bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah senyawa terapi (1), senyawa terapi (2),
senyawa terapi (3), tikus putih (Rattus norvegicus) jantan galur Wistar, PBS (Phospat Buffer
Saline), balok es, NaCl 0,9%, larutan stok MDA (malondialdehid), aquades, TCA 5%, HCl 1N, Natiobarbiturat, benzopiren, formaldehid 10%, etanol (80%, 90%, 95%, dan absolut), larutan xilol,
parafin cair, antibodi primer anti-Rat-PCNA, p53 wild-type, dan Ras, antibodi sekunder AntiRabbit IgG Biotin labeled, kromogen DAB (diamino benzidine), H2O2, serum 2% BSA, pelarut SAHRP (Strep Avidin-Horseradish Peroxidase), dan aquades steril.
PAKTI
METODOLOGI
Isolasi Senyawa*
G. Tetranda & G. dulcis
-dikeringkan
-ekstraksi
-fraksinasi
-pemisahan/Pemurniaan
-penentuan struktur
Santon terprenilasi
*telah dilakukan pada penelitian sebelumnya
PAKTI
Uji In vivo
Tikus Wistar
(berat badan 200-250 g)
-diadaptasi selama 7 hari
-dikelompokkan menjadi 5 kelompok
K0
K2
K3
K4
K1
-Diinjeksi 4x (berselang sehari) secara intraperitorial dengan larutan benzopiren
dosis 200mg/kg BB) dan diinkubasi selama 30 hari
Kelompok
tikus kanker B
-Diobati 7x
dengan
senyawa (1)
(dosis
100mg/kgBB)
-Diinkubasi 7
hari.
Kelompok
tikus kanker C
-Diobati 7x
dengan
senyawa (2)
(dosis
100mg/kgBB)
-Diinkubasi 7
hari.
Kelompok
tikus kanker D
Kelompok
tikus kanker A
-Diobati 7x
dengan
senyawa (3)
(dosis
100mg/kgBB)
- Diinkubasi 7
hari.
 Dibedah dan diambil organ paru
Dikonfirmasi jumlah radikal bebas (MDA)
Ekspresi PCNA, Ras, dan p53
PAKTI
1. Uji Malon dialdehida (MDA)
a. Pembuatan homogenate paru
Tikus
- dibedah,
diambil parunya
Paru
- diperfusi dengan PBS pH 7,4
- diambil, dipotong kecil-kecil, direndam dalam PBS pH 7,4
- ditimbang 0,45 g
- digerus dalam mortal yang diletakkan diatas balok es
Homogenat
- ditambah
0,5 mL 0,9% NaCl dingin
- dimasukkan dalam ependorf 1,5 mL
- disentrifugasi pada kecepatan 8000 rpm selama 20 menit
Supernatan
Uji MDA
PAKTI
b. Pembuatan kurva standar MDA
100 L larutan stok MDA dengan
konsentrasi 0,1,2,3,4,5,6,7, dan 8 g/mL
- dimasukkan
dalam tabung reaksi kecil
- ditambah 550 L aquades
-ditambah 100 L 20% TCA
- dihomogenkan ditambah 250 L HCl 1N
- dihomogenkan
- ditambah 100 L 1% Na-tiobarbiturat
- dihomogenkan
- disentrifugasi 500 rpm selama 10 menit
Supernatan
- diinkubasi pada water bath 100oC selama 30 menit
- dibiarkan dalam suhu ruangan
- diukur absorbansinya dengan spektrofotometer (maks = 533 nm)
Absorbansi larutan standart + kurva standart MDA
PAKTI
c. Preparasi sampel untuk pengukuran MDA
100 L supernatan paru
- dimasukkan dalam tabung reaksi kecil
- ditambah 550 L aquades
-ditambah 100 L 20% TCA
- dihomogenkan ditambah 250 L HCl 1N
- dihomogenkan
- ditambah 100 L 1% Na-tiobarbiturat
- dihomogenkan
- disentrifugasi 500 rpm selama 10 menit
Supernatan
- diinkubasi pada water bath 100oC selama 30 menit
- dibiarkan dalam suhu ruangan
- diukur absorbansinya dengan spektrofotometer (maks = 533 nm)
Absorbansi Sampel
PAKTI
2.Pembuatan Gambaran Histologi Paru
a.Embedding Paru
Paru dalam formaldehid 10%
-diambil dan direndam dalam etanol 70% selama 24 jam
-dimasukkan dalam etanol 80% selama 2 jam
-dimasukkan dalam etanol 90% selama 20 menit
-dimasukkan dalam etanol 95% selama 20 menit
-dimasukkan dalam etanol absolut selama 20 menit dan
diulangi sebanyak 3 kali
Paru hasil dehidrasi dengan etanol
-dimasukkan dalam larutan silol selama 20 menit, sebanyak 2 kali
pada suhu ruang
-dimasukkan dalam larutan silol selama 30 menit pada suhu 60-63°C
-dicelupkan dalam parafin cair
-embedding blok parafin
-didinginkan pada suhu 4°C
Paru dalam blok parafin
PAKTI
b. Pembuatan Preparat Paru
Paru dalam blok parafin
- diiris dengan ukuran 5 μm
-didinginkan pada suhu ruang (dimasukkan air)
-dimasukkan dalam air hangat dengan suhu 38-40°C
-diambil dengan objek glass
-dikeringkan di atas hot plate dengan suhu 38-40°C sampai kering
-diinkubasi pada suhu 38-40°C selama 24 jam
Preparat paru disimpan pada suhu ruang
PAKTI
c. Imunohistokimia Preparat Paru
Preparat paru
-dicelupkan dalam larutan silol 2x5 menit
-dicelupkan dalam etanol bertingkat dimulai dari absolut, 95%, 90%, 80% dan 70% masing-masing 5 menit.
-dicuci dengan aquades
-dicuci dengan PBS pH 7,4
-diaplikasi dengan 3% H2O2 selama 10 menit
- dicuci dengan PBS pH 7,4 selama 3x5 menit
-dibloking menggunakan serum 2% BSA selama 60 menit
-diinkubasi dengan antibodi primer anti-Rat-p53; anti-Rat-PCNA; dan Ras semalam pada 4°C
-dicuci dengan PBS pH 7,4 selama 3x5 menit
-ditetesi dengan antibodi sekunder berlabel biotin
-diinkubasi selama 1 jam
-dicuci dengan PBS pH 7,4 selama 3x5 menit
-ditambah dengan SA-HRP selama 40 menit
-dicuci dengan PBS pH 7,4 selama 3x5 menit
-ditambah kromogen DAB
-dibilas dengan aquades
-dicuci dengan PBS pH 7,4 selama 3x5 menit
-dilakukan counterstaining dengan Mayer hematoxilen selama 10 menit
-dicuci dengan air kran
-dikering anginkan
-diamati di bawah mikroskop cahaya dengan perbesaran 1000x
Aktivitas proliferasi sel ( skor
p53; PCNA; dan Ras)
PAKTI
Hasil dan Pembahasan
 Senyawa santon terprenilsai diisolasi dari dua tumbuhan Garcinia, yaitu G.
tetranda dan G.dulcis.
 Tiga senyawa santon terprenilasi terbagi menjadi 3 golongan yaitu:
santon monoprenilasi, santon diprenilasi, dan santon triprenilasi.
PAKTI
Struktur tiga senyawa santon terprenilasi
O
OH
HO
O
OH
OH
1,4,5,7-tetrahidroksi-2(1,1 dimetil alil) santon
(1)
O
O
OH
MeO
MeO
HO
OH
O
OH
HO
O
OH
α-mangostin
(2)
1,3,6-trihidroksi-7-metoksi-8-(prenil)-4-(geranil) santon
(3)
PAKTI
Persiapan Hewan Uji
 Hewan uji diinjeksi dengan senyawa terapi, kemudian dibedah
dan diambill organ parunya.
Gambar.1 Proses Pembedahan Hewan Coba
PAKTI
Uji MDA (malondialdehid)
 MDA dihasilkan akibat adanya stress oksidatif sel. Stress oksidasi sel sendiri
merupakan ketidak seimbangan antara antioksidan dengan radikal bebas
yang ada dalam tubuh.
hv
+
H
Gambar.2 Reaksi Pembentukan Radikal benzopiren
 Pengukuran kadar MDA pada penelitian ini dilakukan dengan menggunakan
modifikasi metode tes thiobarbituric acid (TBA) yang dikembangkan oleh
Alvarez dan Storey (1995).
PAKTI
Kromogen MDA-TBA
Gambar.3 Reaksi Pembentukan Kromogen MDA-TBA (merah muda)
 Pengukuran MDA dilakukan dengan mengukur absorbansi supernatan
paru menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada λ= 533 nm
PAKTI
Pada penelitian ini digunakan kurva standar MDA untuk mengukur
konsentrasi MDA pada hewan uji.
Tabel.1 Data Absorbansi MDA Kurva standar
0.8
0.7
Absorbansi
0
0.168
0.224
0.278
0.382
0.445
0.533
0.642
0.711
0.6
absorbansi
konsentrasi
MDA
(µ g/mL)
0
1
2
3
4
5
6
7
8
0.5
0.4
y = 0.084x + 0.039R² = 0.992
0.3
0.2
0.1
0
0
2
4
6
8
10
konsentrasi (μg/mL)
Gambar. 4 Kurva Standar MDA
PAKTI
Uji MDA (malondialdehid)
Tabel .2 Data absorbansi MDA hewan uji yang telah diobati dengan senyawa terapi
Absorbansi
[MDA]
Kode
Kelompok
Kode
Senyawa
Terapi
1
2
3
1
2
3
Biru 1
1
0,27
0,3
0,3
2,75
2,51
2,75
2,67
merah 1
1
0,27
0,3
0,3
2,75
2,87
2,99
2,87
merah biru 1
1
0,29
0,3
0,3
2,99
2,63
2,75
2,79
Biru 2
2
0,38
0,4
0,4
4,06
3,70
3,94
3,90
merah 2
2
0,36
0,4
0,4
3,82
3,82
3,70
3,78
merah biru 2
2
0,35
0,4
0,4
3,70
3,94
4,06
3,90
Biru 3
3
0,41
0,4
0,4
4,42
4,77
4,54
4,58
merah 3
3
0,45
0,5
0,5
4,89
5,25
5,01
5,05
merah biru 3
3
0,45
0,5
0,4
4,89
5,01
4,77
4,89
Kontrol negatif
0,2
0,2
0,2
1,92
2,04
2,27
2,08
Kontrol positif
0,52
0,5
0,6
5,73
5,85
6,20
5,92
Keterangan
Kontrol negatif : Tikus sehat
Kontrol positif : Tikus sakit
Rerata
[MDA]
2,78
3,86
4,84
PAKTI
Paru Tikus Sehat dan Sakit
 Histologi paru tikus sehat dan tikus sakit (kanker).
(a)
(b)
Gambar .5 Histologi paru (a) tikus sehat dan (b) tikus sakit
Sel terlihat kompak
Sel terlihat banyak
kerusakan
PAKTI
Imunohistokimia
p53, PCNA, dan Ras
diamati menggunakan mikroskop cahaya
aktivitas prolifersi akan ditunjukkan oleh inti
yang berwarna kecoklatan.
PAKTI
Histologi paru yang mengekspresikan p53
(tikus sakit)
(1)
(tikus sehat)
(3)
(2)
Gambar.6 histologi paru yang mengekspresikan p53
PAKTI
Histologi paru yang mengekspresikan PCNA
(tikus sakit)
(1)
(tikus sehat)
(2)
(3)
Gambar.7 histologi paru yang mengekspresikan PCNA
PAKTI
Histologi paru yang mengekspresikan Ras
(tikus sehat)
(tikus sakit)
(1)
(2)
(3)
Gambar.8 histologi paru yang mengekspresikan Ras
PAKTI
Imunohistokimia
Gambar.9 Data p53, PCNA, dan Ras untuk masing-masing senyawa terapi, kontrol
negatif dan kontrol positif
PAKTI
Mekanisme Antikanker
X-B-DNA
B-X
B
DNA
B-DNA
(kanker)
1
2
X
B-X + DNA
Gamabr.10 Skema interaksi obat dan penyakit. Keterangan
X: santon; B: benzopiren; DNA: DNA di dalam tubuh
PAKTI
KESIMPULAN
Berdasarkan hasil penelitian terhadap tiga senyawa santon
terprenilasi yang berasal dari dua spesies Garcinia
menunjukkan bahwa ketiga senyawa yang telah diuji kadar
MDA dan ekspresi p53, PCNA, dan Ras poten sebagai
antikanker, dimana senyawa (1) lebih aktif dibandingkan
senyawa lainnya. Hal ini ditunjukkan oleh nilai MDA senyawa
(1) yang hampir sama dengan kontrol negatif dan data ekspresi
p53 menunjukkan nilai tertinggi pada uji imunohistokimia.
PAKTI
SARAN
 Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk sifat toksisitas
 Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut mengenai hubungan
struktur dan aktivitas senyawa.
PAKTI
Ucapan Terimakasih
• Hibah Program Penelitian Guru Besar LPPM-ITS
• Lab. Kimia Organik ITS dan Lab. Biokimia Universitas Brawijaya
Malang
• Kelompok PAKTI
• Seluruh pihak yang berperan demi kelancaran seminar ini.
PAKTI
TERIMAKASIH
…….
PAKTI
PAKTI