LEMBAGA PENELITIAN PENGOBATAN TRADISIONAL CINA RRC

LEMBAGA PENELITIAN PENGOBATAN TRADISIONAL CINA RRC
RUMAH SAKIT GUANG AN MEN - Beijing
BALAI PENELITIAN ILMU PENGOBATAN DASAR
Peneliti: Wang Lei Lu Xin Xia Chen Yu Ying Wu Zhi Kui
PENELITIAN DAYA ANTI PERTUMBUHAN DAN PENYEBARAN KANKER
PADA JAMU No. 2 DAN No. 3
Dampak Pada Aktivitas Kegiatan Pembentukan Pembuluh Darah (Angiogenesis)
Pada Selaput Alantoik Embrio Telur Ayam (CAM / Chick Allantoic Membrane)
Pembentukan pembuluh darah (angiogenesis) adalah salah satu masalah hangat dewasa ini
di dunia internasional. Angiogenesis mengacu pada tingkat kemajuan pertumbuhan
penyebaran persemaian pembuluh darah kapiler dari pembuluh darah asal. Munculnya,
penyebarannya, dan infiltrasi kanker adalah tergantung pada pembentukan pembuluh darah
baru (neogenesis), oleh karena itu, penemuan obat yang mempunyai fungsi penghambatan
angiogenesis telah menjadi titik berat penelitian anti kanker / tumor. Tugas penelitian ini
menggunakan Selaput Alantoik Telur Ayam (CAM) yang sudah dikeram sehingga berbentuk
embrio, untuk meneliti dampak pengaruh anti kanker dari Jamu No. 2 dan Jamu No. 3
terhadap pembentukan pembuluh darah baru, dan mendalami model mekanisme daya anti
kanker / tumornya.
BAHAN DAN CARA
I. Bahan Obat
1. Jamu No. 2 dan Jamu No.3, masing-masing sebagai sediaan tunggal (ramuan asal
Indonesia) berbentuk cairan pekat hasil penyarian / ekstraksi secara tradisional, yakni
menggunakan cara penggodogan. Godogan Jamu No. 2 mengandung 0,645 gram bahan
baku obat per ml, sedangkan Godogan Jamu No. 3 mengandung 0,467 gram bahan baku
obat per ml.
2. Sebagai bahan pembanding (kontrol) dipergunakan serbuk tulang rawan ikan hiu dalam
kapsul yang berasal dari produksi perusahaan Cadylad Amerika. Ketiga macam obat
tersebut diencerkan dengan cairan destilasi saline normal sebanyak 4 mg/ml, 2 mg/ml,
dan 1 mg/ml untuk setiap macam obat, dan yang masing-masing telah ditambahkan obat
yang diteliti sebanyak 4 ug/20 ml, 2 ug/20ml, 1 ug/20 ml.
II. Cara Pengujian
1. Penyiapan Media
Model pembentukan Pembuluh Darah (Vasoaktif) pada CAM dari 60 butir bibit telur
ayam Lai Hang yang telah dikeram lebih dari 90 % jadi, disuci-hamakan dengan 0,1 %
bromogeramine selama 3 menit, setelah itu telur tersebut diletakkan di atas nampan telur
dengan sudut kemiringan 45° (bagian telur yang berongga udara menghadap ke atas), lalu
diperam pada suhu 37 °C + 0,2 °C dengan kelembaban 60 % dalam inkubator kedap air
dan bersuhu tetap/konstan. Selama 7 hari, setiap pagi dan malam hari, telur-telur tersebut
dibalik satu kali (setiap hari adalah 24 jam penuh).
Dengan menggunakan lampu teropong pada telur tersebut, pada selaput chorio-allantoik
telur ayam, dipilih luasan sebesar 1 X 1 Cm yang berjarak 1 Cm dari bayangan kepala
embrio ayam, lalu kulit telur pada bagian berongga udara dilubangi dengan jarum, setelah
itu dalam keadaan suci hama, dengan mempergunakan cogwheel alat kedokteran gigi, ke
dalam rongga telur tersebut dimasukkan udara untuk membuat rongga udara buatan, lalu
ditutup dengan plester bening (selotip). Akhirnya, telur-telur tersebut dimasukkan
kembali ke dalam kotak pengeram yang kedap air dan bersuhu tetap tersebut untuk
melanjuti pengeraman.
2. Pengelompokan dan Penataan
Ke 60 telur berbenih tersebut dibagi ke dalam 4 kelompok. Setiap kelompok mengandung
12 butir, yaitu kelompok Kontrol Normal, kelompok Obat Jamu No. 2, kelompok Obat
Jamu No. 3, kelompok Serbuk Tulang Rawan Ikan Hiu.
3. Cara Pemberian Obat
Setelah 11 hari pengeraman sejak telur dilubangi tersebut, dalam keadaan suci hama, ke
dalam rongga udara buatan dalam telur dimasukan lempengan (yang telah dipersiapkan
terlebih dahulu). Ke tengah lempengan pada telur kontrol diberikan 20 ml saline normal
yang suci hama, lalu 20 ml cairan obat (yang masing-masing mengandung bahan obat
sebanyak 4 ug, 2 ug, I ug) diberikan kepada masing-masing piring lempeng kelompok
penelitian. Setiap dosis untuk 4 telur berbenih. Dengan plester bening, rongga udara
buatan pada telur ditutup. Telur diletakkan kembali ke dalam kotak pengeram untuk
dikeram sampai diperoleh sediaan / sampel.
4. Fiksasi Contohan
Setelah dikeram selama beberapa hari, plester bening yang dipergunakan untuk menutupi
lubang pada rongga udara telur berbenih, dibuka, lalu cairan pemantap yakni aseton
dalam metanol dengan perbandingan 1 : 1 disuntikkan ke dalam rongga udara, 20 menit
kemudian, pada suhu kamar, kulit telur beserta rongga udara dikupas, lalu CAM
dikeluarkan dengan forceps dan digelar di atas kertas saring.
HASIL PERCOBAAN PADA PEMBENTUKAN PEMBULUH DARAH
SELAPUT ALANTOIK TELUR AYAM
Jamu No. 2 secara signifikan dapat menghambat pembentukan pembuluh darah pada
selaput allantoik telur ayam. Ini menunjukkan / mengindikasikan Jamu No. 2 dapat mencegah
munculnya / kambuhnya dan penyebaran tumor. Daya Jamu No. 3 tidak terlalu berarti.
HASIL
Pada mikroskop anatomik, diamati perubahan bentuk dari pembuluh darah. Hasilnya
terlihat pada gambar berikut:
Gambar 1
CAM Normal
Gambar 2
Kontrol Normal CAM (Pembuluh Darah Kapiler tersebar secara luas / lebat)
Gambar 3
Tulang rawan ikan hiu mempunyai daya hambat tertentu pada proses pembentukan pembuluh
darah baru. (tampak pembentukan pembuluh darah baru terhambat pada daerah di mana
cairan obat diberikan)
Gambar 4
Jamu No. 3 tidak berpengaruh besar pada pembentukan pembuluh darah baru CAM.
Gambar 5
Jamu No. 2 mempunyai daya hambat yang signifikan pada pembentukan pembuluh darah
baru CAM (pada daerah yang diberi cairan Jamu, pembentukan pembuluh darah terhambat,
dan secara jelas tampak penyebaran pembuluh darah berkurang).
Gambar 6
Control CAM
Jamu No. 2 pada CAM mempunyai daya penghambat yang jelas (signifikan)
PENELITIAN PERCOBAAN DAYA ANTI TUMOR
DARI GODOGAN JAMU ANTI KANKER No. 2 DAN No. 3
Godogan Jamu Antikanker No. 2 dan No. 3 disarikan dari tumbuh-tumbuhan alamiah
untuk bahan pengobatan kanker. Hasil percobaan ini menunjukkan bahwa kedua obat tersebut,
terutama Jamu No. 2, mempunyai daya membunuh sel kanker ascites.
BAHAN DAN CARA
1. Binatang Percobaan:
Tikus jantan dan betina jenis Kun Ming dengan berat masing-masing 18 - 20 gram, yang
disediakan oleh Pusat Hewan Percobaan Lembaga Penelitian Pengobatan Tradisional
Cina RRC.
2. Bahan Obat
- Godogan Jamu Antikanker No. 2 mengandung 262 gram bahan obat per 100 ml.
- Godogan Jamu Antikanker No. 3 mengandung 187 gram bahan obat per 100 ml.
- Obat suntik Cyclophosphamide / CTX (Chemotherapi) yang diproduksi oleh Pabrik
Obat No. 2 Shanghai. Sebelum percobaan dilakukan, digunakan cairan saline normal
untuk melarutkan/ mengencerkannya.
3. Jenis Tumor
Jenis sel karsinoma Ascites S 180, yang disediakau oleh Balai Materia Medica Cina
Lembaga Penelitian Pengobatan Tradisional Cina RRC.
4. Peralatan Percobaan
Mikroskop sederhana.
FACS - 420 Flow Cytometer, produksi perasahaan BD Amerika Serikat.
Mikroskop Konfokal Pemindai Laser (Laser Scanning Confocal) produksi perusahaan
MERIDIAN, Amerika Serikat.
5. Pembuatan Model Kanker Ascites S 180
Ascites (cairan busung perut) diperoleh dari hewan yang 7 hari sebelumnya ditanami sel
kanker. Setelah dicampur dengan saline normal, konsentrasinya menjadi 2,5 X 107 sel
kanker hidup per ml, lalu sebanyak 0,2 ml yang mengandung kurang lebih 5 X 106 sel
kanker hidup, ditanamkan ke dalam rongga perut setiap tikus percobaan.
6. Pengelompokan dan Pemberian Obat
Tikus yang telah ditanami sel kanker, secara acak dibagi menjadi 8 kelompok:
a. Kelompok Kontrol (diberikan jumlah saline normal yang sama seperti yang
diberikan pada kelompok dosis tinggi);
b. Kelompok Jamu No. 2 digabung dengan Cyclophosphamide (68,0 g bahan Jamu / Kg
BB diberikan secara oral dan 10 mg CTX / Kg BB diberikan secara suntikan);
c. Kelompok Jamu No. 2 dosis besar (136,0 gram bahan obat / Kg BB);
d. Kelompok Jamu No. 2 dosis kecil (68,0 g bahan obat / Kg BB);
e. Kelompok Jamu No. 3 digabung dengan Cyclophosphamide (48,6 g bahan Jamu / Kg
BB diberikan secara oral dan 10 mg CTX / Kg BB disuntikkan);
f. Kelompok Jamu No.3 dosis besar (97,1 g bahan obat / Kg BB);
g. Kelompok Jamu No. 3 dosis kecil (48,6 g bahan obat / Kg BB);
h. Kelompok Cyclophosphamide saja (10 mg / Kg BB).
Kelompok Jamu diberikan secara oral, dan Cyclophosphamide disuntikkan secara
subkutan. Selurahnya berlangsung 7 hari.
7. Pembuatan Contohan
1. Penentuan Derajat Penghambatan
Setelah percobaan selesai, dan diperoleh cairan ascites hewan, lalu cairan itu diencerkan
100 kali dengan saline normal dan diwarnai dengan trypan blue, kemudian dihitung
jumlah set kanker dan dihitung derajat penghambatannya.
2. Penentuan Siklus Pembelahan Diri (Mitosis) Sel Tumor
Setelah percobaan selesai, diperoleh larutan sel karsinoma Ascites S 180 yang berisi 2
X 106 sel kanker per tabung pengujian, lalu diputare-ndapkan (di-centrifuge), dibilas 2
kali dengan PBS, dan ditambahkan alkohol 70 % pada suhu 4 °C selama lebih dari 30
menit, dan setelah disentrifuge lagi lalu dibilas 3 kali, kemudian diambil endapannya
tanpa cairan bening di atasnya. Ditambahkan 500 g/ml RNasc 0,5 ml, dan setelah
direndam selama lebih dari 30 menit pada suhu 37 °C, ditambahkan 50 ug/ml PI 1,5 ml,
lalu disaring dengan saringan nilon 400 mata, dan akhirnya dianalisis dengan FACS.
3. Pengamatan dengan mikroskop Confokal Pemindaian Laser
Setelah dicuci sebanyak 2 kali dengan PBS, sel yang akan ditentukan, diwarnai dengan
PI, lalu terhadap sel kanker Ascites S 180 dari tikus, dilakukan pembayangan
pemindaian irisan konfokal dengan mikroskop konfokal pemindaian laser, setelah
pengumpulan bayangan konfokal dilakukan oleh papan image profesional, dibuat
rekonstruksi 3 dimensi dengan perangkat lunak komputer.
HASIL
1. Pengaruh Godogan Obat Jamu Antikanker Terhadap Jumlah Sel Kanker
Ascites S 180 Pada Tikus.
Dari pengamatan atas jumlah sel kanker pada tikus yang mengandung kanker Ascites S 180,
setelah pengobatan, hasilnya menunjukkan bahwa pada kelompok dosis besar Jamu No. 2,
kelompok dosis kecil Jamu No. 2, kelompok Jamu No. 2 ditambah cyclophosphamide,
kelompok jamu No. 3 ditambah cyclophosphamide, dan kelompok cyclophosphamide saja,
terayata jumlah sel kankernya lebih sedikit daripada kelompok kontrol, Ini menunjukkan
Jamu No. 2 dan cyclophosphamide mempunyai daya tertentu penghambatan terhadap sel
tumor. Daya penghambatan masing-masing adalah sebagai berikut: 36,8 %, 31,2 %, 99,1 %,
98,4 %, 98,5 %.
2. Pengaruh Godogan Obat Jamu Antikanker Terhadap Siklus Pembelahan Sel
Kanker (Mitosis) S 180 Pada Tikus
Dengan menggunakan teknik FACS, diamati pengaruh godogan Jamu No. 2 dan No. 3
terhadap siklus pembelahan sel kanker Ascites S 180 pada tikus. Hasilnya menunjukkan
bahwa godogan Jamu Antikanker No. 2 dapat menghalangi siklus mitosis sel kanker,
membuat sel kanker S 180 berhenti membelah diri pada stadium / tahap Gl dan G2+M;
cyclophosphamide membuat pembelahan sel kanker berhenti pada mitosis stadium/tahap Gl
dan S (Tabel 2, Gambar 1). Hasilnya menunjukkan godogan Jamu Antikanker No. 2 dapat
menghalangi / memblokir / menghambat siklus pembelahan sel kanker (Gambar 4).
Tabel 1. Pengaruh Godogan Jamu Antikanker Terhadap Jumlah Sel Kanker Ascites
S 180 Pada Tikus
Kelomp ok
Jumlah
Dosis (Godogan Binatang
Obat / kg BB)
(n)
Jumlah Sel Kanker
X±SD
Daya
Hambat
10
1,41 X 10s + 2,69 X107
10
1,25 X106 + 9,36 X105 **
99,1
Jamu No. 2 Dosis Besar 136,0
10
8,90 X 107 + 2,65 X106 *
36,8
Jamu No. 2 Dosis Kecil
68,0
10
9,70 X 107 + 8,96 X106 *
31,2
JamuNo.3 + CTX
48,6 + 0,01
10
2,12 X 106 + 8,14X 104 **
98,4
Jamu No. 3 Dosis Besar 97,1
10
1,39 X 108 + 7,70X 107
0,01
Jamu No. 3 Dosis Keeil
48,6
10
1,37 X108 + 2,14 X 107
0,02
CTX
0,01
10
2,11 X106±3,76X 105 **
98,5
Kontrol
JamuNo.2 + CTX
68,0+ 0,01
Catalan: Tanda (*) mengacu pada hasil Pengujian T dibanding Kontrol: P < 0,05
Tanda (**) P < 0,001 dibanding Kontrol
Tabel 2. Pengaruh Godogan Jamu Antikanker Terhadap Jumlah Sel Kanker
Ascites S 180 Pada Tikus
Jumlah
Binatang
(n)
Gl
10
41,67 + 4,93
40,33 + 4,04
16,07 + 3,06
10
43,67 + 7,37
51,67 + 9,24
4,67 ±2,52**
Jamu No. 2 Dosis Besar 136,0
10
45,00 + 6,56
35,67 + 8,96
19,33+4,16
Jamu No. 2 Dosis Kecil 68,0
10
33,37 + 1,15
45,00 + 6,08
21,33 ±5,51
Jamu No.3 + CTX
10
43 ,67 + 7,02 44,33 ±7,51
1 2,00 ± 7,00
JamuNo.3 Dosis Besar 97.1
10
42,00 + 4,58
42,33 ± 8,02
1 5,67 + 6,43
Jamu No. 3 Dosis Kecil 48,6
10
43,00 + 6,08
42,33 + 3,05
14,67 + 3,21
Kelompok
Dosis
(Godogan
Obat / kg BB)
Kontrol
Jamu No. 2 + CTX
68,0 + 0,01
48,6 + 0,01
S i k 1 u s Mitosis (%)
X + SD
S
G2+M
CTX
0,01
10
25,00 ±11,27 63,67 ±11,72* 11,00 ±2,00
Catalan: Tanda (*) mengacu pada hasil Pengujian T dibanding Kontrol: P < 0,05
Tanda (**) P < 0,001 dibanding Kontrol
3. Perubahan Sel Kanker Ascites S 180 Pada Tikus Setelah Dicekoki Jamu
Sel tumor pada kelompok Kontrol mempunyai bentuk yang relatif utuh / intact, dan kekuatan
sinar flouresensi yang lebih kuat, sedangkan pada kelompok Jamu, bentuknya mempunyai
kecenderangan merusak / terluka, dan mempunyai kekuatan sinar flouresensi yang lemah
(Gambar 1-9).
Gambar 1: Kelompok Kontrol yang mengandung kanker
Gambar 2: Kelompok Cyclophospamide
Gambar 3: Kelompok Jamu No. 2 Dosis Besar
Gambar 4: Kelompok Jamu No.2 Dosis Kecil
Gambar 5: Kelompok Jamu No. 2 + CTX
Gambar 6: Kelompok Kontrol yang mengandung kanker
Gambar 7: Kelompok Jamu No. 2 Dosis Besar
Gambar 8: Kelompok Jamu No. 2 Dosis Kecil
Gambar 9: Kelompok CTX saja
KESIMPULAN
Hasil percobaan menunjukkan bahwa godogan Jamu Antikanker mempunyai daya hambat
tertentu terhadap kanker Ascites S 180, terutama Jamu No. 2 yang signifikan. Dari keadaan
hewan percobaan, kelompok yang diberi jamu saja dan kelompok yang diberi Jamu ditambah
Cyclophosphamide, keadaan umum mereka lebih baik dari kelompok yang diberi
Cyclophosphamide saja, dalam hal keadaan kelebatan dan kilapan warna bulunya, hal ini
memperlihatkan bahwa godogan Jamu tidak hanya mempunyai daya peluruhan racun
Chemotherapi (attenuation) dan kemampuan bersinergi, tetapi juga mempunyai daya tertentu
penghambatan terhadap kanker. Hal ini terutama pada Jamu antikanker No .2.
Sifat utama dari sel kanker adalah pembelahan sel (mitosis) yang berkesinambungan /
terus-meneras, dan senantiasa bergerak maju pesat pada siklus mitosis. Dengan memblokir
siklus pembelahaa sel, maka pertumbuhan sel terhambat, dan tercapailah sasaran / tujuan
dalam mengatasi tumor. Jamu antikanker No. 2 mempunyai pengaruh penghambatan tumor
melalui dampak terhadap siklus mitosis, dan menghentikan pertumbuhan sel kanker pada
tahap Gl dan G2+M. sementara cyclophosphamide berpengaruh pada tahap S sampai G2+M.
Ini menunjukkan bahwa obat yang berbeda mempunyai fungsi penghambatan yang berbeda
terhadap siklus mitosis sel kanker.
Ditinjau dari morfologi, sel tumor mempunyai sinar flourensensi yang melemah pada
kelompok Jamu dibanding kelompok Kontrol, dan membran sel mempunyai tanda-tanda
merusak, ini memperlihatkan bahwa Jamu Antikanker dapat membuat perubahan morfologi /
bentuk pada sel kanker. Untuk mengidentifikasi daya penyembuhan dari kedua Jamu, jika
mungkin disarankan untuk melakukan pembuatan indeks kekebalan (imunitas).
PENGUJIAN TOKSISITAS AKUT
GODOGAN JAMU ANTIKANKER No. 2 DAN No. 3
Penelitian ini menggunakan 20 ekor tikus sehat jenis Kun Ming yang berasal dari Pusat
Hewan Percobaan Lembaga Penelitian Pengobatan Tradisional Cina, RRC, yang berbobot
antara 18 — 22 gram, separuh jantan dan separuh lagi betina. Godogan Jamu Antikanker No.
2 dipekatkan sampai 262 g % (bobot bahan obat). Godogan Jamu Antikanker No.3
dipekatkan sampai 187 g % (bobot bahan obat). Jamu-jamu ini diberikan pada tikus melaui
pencekokan secara oral, dosisnya adalah 1,31 g / Kg BB, 93,4 g / Kg BB (setara dengan 1 ml
/ 20 g BB), 3 kali sehari. Dosis ini adalah dosis minum yang terbesar yang dapat diterima /
ditolerir oleh tikus. Pengamatan dilakukan selama 7 hari. Hasilnya menunjukkan: pola makan
dan minum maupun tingkah lakunya adalah normal, tidak ada gejala keracunan dan tidak ada
satu pun tikus yang mati. Dosis itu adalah sebesar 150 kali dosis klinik.
Percobaan toksisitas ini menunjukkan bahwa tidak ada gejala keracunan apapun pada
pemberian jangka pendek (7 hari) bagi godogan Jamu Antikanker No. 2 dan No. 3 dengan
dosis besar yang berlebihan, jadi terbukti aman dan tidak beracun.
Catatan: Orang dewasa diberikan sehari 130,8 g bahan obat (200 ml) Jamu No. 2, dan
sehari 93,4 g bahan obat (200 ml) Jamu No. 3.