Pemotongan Molekul DNA Menggunakan Enzim

Pemotongan Molekul DNA Menggunakan Enzim Restriksi
Endonuklease dan Pengukuran Besarnya Pasangan Basa dari Fragmen
yang Terpotong
RATNA DWI HIRMA W (B1J006019)
HARIYATI (B1J006021)
AFRINA YUNIATI (B1J006023)
K04-TD-04
Teknik manipulasi DNA melibatkan beberapa enzim, diantaranya DNA
polimerase, ligase, enzim yang memodifikasi ujung akhir nukleotida dan nuklease.
Nuklease merupakan enzim yang memotong molekul DNA dengan memutuskan
ikatan fosfodiester antara nukleotida satu dengan nukleotida berikutnya. Jenis
nuklease ada dua yaitu eksonuklease dan endonuklease. Endonuklease merupakan
nuklease yang memotong bagian internal DNA tepat pada ikatan fosfodiester. Hasil
pemotongan molekul DNA oleh enzim restriksi endonuklease tepat pada urutan
tertentu dan menghasilkan sekuens yang double-stranded, dengan demikian sekuens
yang akan dipotong dapat diprediksi urutan basa nitrogennya.
Ada tiga tipe enzim restriksi endonuklease yaitu tipe I, II dan III. Enzim
restriksi endonuklease tipe I dan III jarang digunakan, karena hasil pemotongannya
tidak tepat pada sekuens yang diinginkan, sedangkan enzim restriksi endonuklease
tipe II dapat memotong tepat atau dekat dengan sekuens yang diinginkan (gambar 1).
Gambar 1. Pemotongan molekul DNA dengan enzim restriksi endonuklease
tipe I, II, dan III.
Contoh enzim restriksi endonuklease tipe II adalah EcoRI. Enzim EcoRI
diisolasi dari E. coli dan memotong molekul DNA pada urutan heksanukleotida 5’GAATTC-3’. Selain EcoRI, enzim restriksi endonuklease lainnya dapat dilihat pada
tabel di bawah ini.
Hasil pemotongan enzim restriksi endonuklease ada dua macam yaitu unjung
blunt atau flush dan ujung sticky atau cohesive (gambar 2).
Gambar 2. Hasil pemotongan molekul DNA dengan enzim restriksi
endonuklease berbeda. (A) ujung blunt dan ujung sticky. (B) Tipe ujung sticky
berbeda. (C) Tipe ujung sticky sama dihasilkan oleh dua enzim restriksi endonuklease
berbeda.
Ujung blunt atau flush menghasilkan fragmen yang double-stranded,
sedangkan ujung sticky atau cohesive menunjukkan enzim restriksi endonuklease pada
posisi yang berbeda dari dua untai DNA yang komplementer. Beberapa pemotong
ujung sticky menghasilkan ujung 5’ atau ujung 3’ yang menggantung.
Fragmen DNA yang dipotong dengan enzim restriksi endonuklease dapat
ditentukan berapa besar ukurannya dengan menggunakan teknik elektroforesis gel
agarosa. Teknik ini tergantung oleh konsentrasi agarosa dalam gel. Fragmen yang
berukuran kurang dari 150 pasang basa dapat dipisahkan dengan cara elektroforesis
yang konsentrasi agarosanya 4% atau 5%.
Apabila ukuran dari sekuens DNA tidak diketahui maka fragmen yang
mengandung gen atau segmen DNA tersebut dapat diidentifikasi dengan Southern
hybridization. Adapun tahapannya yaitu:
1. Mentransfer fragmen restriksi dari gel agarosa ke nitroselulosa atau membran
nilon.
2. Menyediakan hybrization probe. Sekuens molekul DNA yang komplementer
dengan DNA target dilabeli. Pelabelan ini dapat menggunakan oligonukleotida
sintetik.
Pelabelan
kemudian
dideteksi
dengan
menggunakan
autoradiography.
Daftar Pustaka
Brown, T.A (2002) DNA in Genomes, 2nd ed.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?rid=genomes.figgrp.6026
diakses tanggal 16 Oktober 2008
Situs Terkait
http://regeni.wordpress.com/bahan-ajar/laporan-praktikum/fitri/
http://lib.atmajaya.ac.id/default.aspx?tabID=61&src=k&id=135557
diakses tanggal 22 Oktober
http://bima.ipb.ac.id/~tpb-ipb/materi/genetika/dnarekombinan/enzimrestriksipdf.pdf
diakses tanggal 28 Oktober
http://users.sch.gr/ppoulio/Flash_animation/animation_biology/anasindiasmeno_DNA
%20Gkatefthinsis.swf
http://users.sch.gr/ppoulio/Flash_animation/animation_biology/endonukleases%20per
iorismou%20Gkatefthinsis.swf
http://www.dnalc.org/ddnalc/resources/restriction.html
diakses tanggal 29 Oktober 2008