REGULASI KANKER OLEH GEN cWNT5A SECARA IN VITRO
advertisement
REGULASI KANKER OLEH GEN cWNT5A SECARA IN VITRO PADA SEL FIBROBLAS CHICKEN KIDNEY (CK) TERINDUKSI CADMIUM ARTIKEL OLEH SAHARD REO JUANTORO NIM 307342403692 The Learning University UNIVERSITAS NEGERI MALANG FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM JURUSAN BIOLOGI PROGRAM STUDI BIOLOGI 2015 REGULASI KANKER OLEH GEN CWNT5A SECARA IN VITRO PADA SEL FIBROBLAS CHICKEN KIDNEY (CK) TERINDUKSI CADMIUM Sahard Reo Juantoro*, Dwi Listyorini**, dan Abdul Gofur**) Abstract. Cancer is the leading cause of death in the world after heart disease. In 2008, there were approximately 7.6 million cancer deaths, or about 13% of the total world population mortality. Gene therapy is one type of cancer treatment that is increasingly studied today. Wnt proteins play an important role in some aspect of animal development and adult tissue homeostasis. Wnt signaling has two types of canonical plays an important role in the control of proliferation and differentiation of cells and is associated with the high frequency of tumor tissue and non-canonical role in maintaining cell shape and regulate apoptosis. Cadmium is a class 1 carcinogen that can cause carcinogenic effects through the canonical Wnt signaling pathway / βcatenin. This study aims to determine patterns of gene regulation cWnt5a morphology and viability in vitro on fibroblast cells Chicken Kidney (CK) induced cadmium. CK cells using cadmium-induced cancer, and then exposed to the virus genes cWnt5a Replication Competent ALV LRT with a Splice Acceptor (RCAs). This study uses four treatments and eight replications, normal CK is a negative control, cancer CK (CK + cadmium) and CK + cWnt5a gene as a positive control (1 and 2), while the treatment is CK + + gene cWnt5a cadmium. The treatment’s effect on morphology of cancer cells exposed to the gene cWnt5a shows the characteristics of cells undergoing apoptosis, whereas the ELISA test results showed that the gene cWnt5a can reduce cell viability (p> 0.05) were significantly in cancer cells induced CK cadmium. Keywords: cancer, regulation, morphology, viability, in vitro Kanker merupakan penyebab kematian kedua di dunia setelah penyakit jantung (Baratawidjaya & Rengganis, 2010). Pada tahun 2008 7,6 juta jiwa (13%) meninggal karena penyakit kanker dari total kematian dari jumlah tersebut. 70% kematian yang disebabkan kanker terjadi di negara-negara berkembang. Diperkirakan pada tahun 2030 kematian yang disebabkan oleh kanker akan meningkat hingga 13,1 juta jiwa (WHO, 2012). *) Sahard Reo Juantoro adalah mahasiswa Jurusan Biologi FMIPA UM **) Dwi Listyorini dan Abdul Gofur adalah Dosen Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Negeri Malang 2 Perubahan dari sel normal menjadi1sel kanker terjadi melalui proses bertahap, biasanya perubahan terjadi dari tahap pre-kanker ke tumor malignant. Perubahan ini adalah hasil dari interaksi antara faktor genetik seseorang dan tiga kategori agen eksternal yaitu: (a) karsinogen fisik (sinar UV, radiasi ion); (b) karsinogen kimia (asbestos, komponen yang terkandung dalam rokok); dan (c) karsinogen biologi (infeksi virus, bakteri, atau parasit tertentu) (WHO, 2012). Berdasarkan perubahan yang terjadi pada sel kanker, petanda kanker yang dapat diamati yaitu: (a) petanda serologi (ekstraseluler); (b) petanda seluler; serta (c) petanda molekuler (Kresno, 2001). Petanda serologi berkaitan dengan substansia yang diproduksi oleh sel kanker sebagai respon terhadap adanya kanker. Petanda serologi tersebut umumnya berupa makromolekul atau protein dengan komponen karbohidrat atau lipid dalam darah dan cairan tubuh lainnya. Pertanda seluler meliputi perubahan morfologi sel, fenotipe sel, kinetik sel (viabilitas) serta ploidi. Morfologi sel kanker sering ditunjukkan dengan ciri rasio antara volume nukleus dengan sitoplasma lebih besar dari normal, pola kromatin inti lebih halus dan maturasi sitoplasma terhambat. Karakter morfologi sel kanker lainnya yaitu hilangnya adhesi antar sel dan stroma di dalam jaringan (Buick & Tannock, 1992). Karsinogen merupakan substansia yang dapat menyebabkan kanker atau setidaknya menimbulkan terjadinya peningkatan insiden kanker pada hewan ataupun manusia. Ada beberapa kelompok jenis karsinogen (onkogen) antara lain: (a) onkogen kimia seperti hidrokarbon polisiklik, agen kemoterapi, logam berat, vinyl chloride, dll; (b) onkogen radiasi seperti radiasi UV, X-ray, radioisotope dan bom nuklir; (c) onkogen viral seperti retrovirus, ABV, hepatitis B, dll; (d) onkogen hormonal seperti estrogen, steroid, diaethylsilbestril; dan (e) onkogen genetik (Chandrasoma & Taylor, 2001). Masing- masing onkogen memiliki aktivitas yang berbeda-beda dalam proses karsinogenesis sel normal menjadi neoplasma. Karsinogen ini dikelompokkan menjadi 2 yaitu mutagen dan mitogen. Mutagen adalah agen yang langsung menyebabkan mutasi DNA, bisa berupa bahan kimia atau radiasi, sedangkan mitogen adalah agen yang secara tidak langsung dapat menyebabkan mutasi dengan merangsang pertumbuhan sel (Hoffman, 1999). Cadmium merupakan salah satu logam yang banyak digunakan pada industri di Indonesia, seperti industri baterai, plat logam, produk PVC dan industri lainnya. Cadmium bersifat karsinogen yang mampu menyebabkan beberapa kanker seperti kanker paru-paru (Zarros et al., 2008), kanker ginjal (Chakraborty, 2010) dan menyebabkan gangguan lain. Cadmium merupakan karsinogen kelas 1 berdasarkan standart IRAC (IARC, 1993). Cadmium dapat merusak kompleks Aderen Junction (AJs) epitel yaitu E-cadheirn dengan β-catenin. Deregulasi adhesi E-cadherin dan perubahan di dalam sinyal Wnt diketahui berkontribusi pada proses karsinogenesis (Chakraborty, 2010). 3 Cadmium dapat menyebabkan oksidasi DNA, sehingga secara tidak langsung mengakibatkan peningkatan viabilitas, inhibisi apoptosis dan kegagalan DNA repair (Hartwig, 1998). Cadmium juga mampu meningkatkan sinyal Wnt canonical/βcatenin dengan meningkatkan translokasi nuclear β-catenin sehingga proliferasi meningkat dan menyebabkan kerusakan ikatan E-cadherin (salah satu protein Junction yang menjaga integritas jaringan) dengan β-catenin (Chakraborty, 2010). Terapi gen merupakan salah satu jenis pengobatan kanker yang mulai banyak dipelajari saat ini sejak diketahui bahwa kanker merupakan penyakit akibat mutasi gen. Para ahli mulai berpikir bahwa terapi gen tentu efektif untuk mengobati penyakit kanker. Terapi gen merupakan teknik untuk mengoreksi gen-gen yang cacat yang bertanggung jawab terhadap suatu penyakit. Selama ini pendekatan terapi gen yang berkembang adalah dengan menambah gen-gen normal ke dalam sel yang mengalami ketidaknormalan. Pendekatan kedua yaitu dengan melenyapkan gen abnormal dengan gen normal melalui rekombinasi homolog. Sedangkan pendekatan ketiga yaitu dengan mereparasi gen abnormal dengan cara mutasi balik selektif sedemikian rupa sehingga akan mengembalikan fungsi normal gen tersebut. Selain pendekatan-pendekatan tersebut, ada pendekatan lain yaitu dengan mengendalikan regulasi ekspresi gen abnormal tersebut (Holmes, 2003). Wnt5A adalah salah satu jenis protein yang termasuk di dalam kelompok gen Wnt. Wnt signaling pathways adalah kelompok jalur sinyal transduksi yang terdiri dari protein yang menyalurkan sinyal dari luar sel melalui permukaan sel ke dalam inti sel. Tiga jalur telah berhasil dikarakterisasi, jalur kanonikal, jalur non-kanonikal polaritas sel planar, dan jalur non-kanonikal Wnt/kalsium (Nusse, 1992). β-katenin adalah protein yang memiliki dua fungsi, mengatur koordinasi adesi antar sel dan transkripsi gen (Krauss C, 1994). β-katenin adalah subunit dari kompleks protein cadherin dan bertindak sebagai perantara sinyal intraseluler dalam jalur sinyal Wnt (Peifer, 1991). Tujuan Penelitian ini adalah untuk: (a) mengetahui regulasi morfologi sel kanker oleh gen cWnt5a secara in vitro pada sel fibroblas Chicken Kidney (CK) terinduksi cadmium; dan (b) mengetahui regulasi viabilitas sel kanker oleh gen cWnt5a secara in vitro pada sel fibroblas Chicken Kidney (CK) terinduksi cadmium. Adapun kegunaan penelitian ini bagi mahasiswa adalah menjadi salah satu rujukan dalam mempelajari pola aktivitas regulasi genetik secara in vitro dari gen cWnt5a khususnya terhadap viabilitas dan apoptosis pada sel fibroblas CK dalam kondisi terinduksi kanker oleh bahan karsinogenik kimia CdSO4. Penelitian mengenai potensi gen Wnt5a ini menjadi salah satu literatur dalam mempelajari perkembangan kanker dan menjadi salah satu dasar bagi penelitian selanjutnya. Bagi Pemerintah penelitian ini menjadi wacana umum untuk mengembangkan teknik pengobatan kanker melalui terapi gen khususnya dengan aktivitas gen Wnt5a. Penelitian ini sekaligus menjadi rekomendasi dalam peningkatan kesehatan 4 masyarakat melalui aspek medis, utamanya yang terkait dengan pengobatan kanker yang merupakan salah satu ancaman global saat ini. Sedangkan bagi masyarakat, penelitian ini akan membuka cakrawala pengobatan terapi gen sebagai salah satu cara efektif untuk menyembuhkan kanker. METODE Jenis penelitian ini adalah penelitian eksperimental. Rancangan penelitian yang digunakan adalah Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan 4 perlakuan dan masing-masing perlakuan terdiri dari 8 ulangan. Keempat macam perlakuan tersebut adalah: (a) Kontrol negative (Sel fibroblas CK normal); (b) Kontrol positif 1 (Sel fibroblas CK + cadmium (CdSO4)); (c) Perlakuan (treatment)(Sel fibroblas CK + cadmium (CdSO4) + gen cWnt5a); dan (d) Kontrol positif 2 (Sel fibroblas CK + gen cWnt5a) Parameter yang diamati pada penelitian ini ada 2 yaitu: (a) morfologi sel dan (b) viabilitas sel. Pengamatan dibagi dalam 3 periode yaitu periode I, II dan III dengan interval waktu dari satu periode ke periode berikutnya yaitu selama 2 jam. Periode I: 12 jam setelah transfeksi gen, periode II: 14 jam setalah tranfeksi gen dan periode III: 16 jam setelah transfeksi gen. Tujuan dari pengambilan 3 periode pengamatan adalah untuk mengetahui kemungkinan terjadinya perubahan pengaruh selama periode tersebut, dan memberikan beberapa kemungkinan waktu yang dibutuhkan oleh gen cWnt5a untuk bekerja pada sel fibroblas CK. Penentuan pengambilan data pada interval waktu 2 jam disesuaikan dengan waktu inkubasi maksimal cadmium (penginduksi kanker) yaitu 9 jam, sehingga pengamatan harus dilakukan < 9 jam (interval 2 jam x 3 periode = 6 jam). Penelitian ini dilaksanakan di laboratorium Tissue Culture bidang Peningkatan Mutu dan Pengembangan Produk (PMPP) Pusat Veterinaria Farma (PUSVETMA) Surabaya sejak bulan Maret hingga Juni 2011. Adapun objek penelitian ini yaitu sel Chicken Kidney (CK) dari American Type Culture Collection (ATCC). Sel ini merupakan jenis fibroblastic cell line yang diambil dari ginjal ayam. Sel ini telah mengalami passase lebih dari 100 kali. Sel ini didapat dari stok sel di laboratorium Tissue Culture bidang Penyakit Mulut Kuku (PMK) PUSVETMA Surabaya. Alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain adalah: deep frezer, sentrifuge dan tabung sentrifuge, Laminar Air Flow (LAF), inkubator CO2, waterbath, lemari es, botol roux dispossable, botol medium dan serum, pipet dan balb, tabung uji sterilitas, indicator tape, mikropipet dan mikrotip, autoklaf, oven sterilisasi, mikroplate 96 well, mikroskop inverted phase contras, Spectrophotometer Microplate Reader atau Enzime Linkage Immunosorbance Assay (ELISA) reader, 5 mikroskop inverted flourescense, pH meter, neraca analitik, hand counter serta tabung eppendorf. Bahan utama yang digunakan dalam penelitian ini antara lain: sel CK (didapat dari Lab. PMK PUSVETMA Surabaya, dari stok dengan tanggal store 17 Juni 2010), virus Replication Competent ALV LTR with a Splice Acceptor (RCAS) pembawa gen cWnt5a (pemberian dari Listyorini, 2006), dan cadmium (CdSO4: Sigma). Bahan tambahan untuk kultur sel normal adalah Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), Fetal Bovine Serum (FBS) 10%, PBS, tripsin, hepes, aquades, tioglikolit. Bahan tambahan untuk kultur sel CK kanker adalah DMEM, Phosphat Buffers Solution (PBS), tripsin, hepes, aquades, tioglikolit. Bahan untuk uji proliferasi dengan MTT Proliferation Assay adalah larutan MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)2.5-diphenyltetrazolium bromide 0,5%), Dimethyl-Surfokcid (DMSO). Prosedur Kerja dalam penelitian ini adalah: (a) pembuatan kultur sel CK dan induksi kanker dengan Cadmium; (b) perlakuan dengan Gen cWnt5a; (c) pengamatan morfologi dan viabilitas sel; dan (d) pengukuran nilai absorbansi masing-masing sampel pada panjang gelombang 570 nm menggunakan Spectrophotometer Microplate Reader/ELISA reader. Data yang diambil untuk pengamatan morfologi berupa gambar foto pengamatan well melalui mikroskop, sedangkan untuk viabilitas sel berupa: 1) indeks proliferasi yang ditunjukkan dengan nilai absorbansi/Optical Density (O.D) dan 2) Indeks Stimulasi (I.S). O.D menunjukkan jumlah sel yang hidup/well, sedangkan I.S menunjukkan aktivitas stimulasi terhadap sel. I.S dicari dengan membagi O.D perlakuan dengan O.D kontrol negatif. Data yang telah diperoleh dari pengamatan kemudian dianalisis dengan analisis statistik dan deskriptif. Analisis statistik yang digunakan yaitu Analysis of varian (Anova) dengan taraf signifikansi 5%. Apabila pada uji anova menunjukkan hasil yang signifikan maka dilanjutkan dengan uji Duncan Multiple Range Test (DMRT). HASIL Aktivitas Gen cWnt5a Terhadap Morfologi Sel Fibroblas CK Berdasarkan hasil penelitian yang telah dilakukan, diketahui morfologi sel fibroblas CK yang ditunjukkan pada Gambar 3.1. berikut: 6 1 3 2 4 Gambar 3.1. Perbandingan Morfologi Sel Fibroblas CK : 1. Sel Fibroblas CK Normal, 2. Sel Fibroblas CK + Cadmium, 3. Sel Fibroblas CK + Cadmium + cWnt5a, 4. Sel Fibroblas CK Normal + cWnt5a; panah hitam menunjukkan sel Fibroblas CK normal; panah merah menunjukkan CK neoplastik (Perbesaran : 400x) Pada kontrol negatif (sel fibroblas CK normal) yang ditunjukkan dengan notasi nomor 1 pada Gambar 3.1. memiliki ciri berupa: 1) sel berbentuk bipolar dan multipolar, 2) sel memiliki panjang 4 kali lebarnya, tersusun satu sama lain dengan membentuk barisan yang kompak dan memusat seperti pusaran air, 3) nukleus tidak jelas, 4) ikatan antar sel kuat, 5) membran sel tampak jelas, 6) sel yang telah mencapai confluent berbentuk bipolar, 7) sel yang telah confluent membentuk selapis sel. Berbeda dengan kontrol negatif (sel fibroblas CK normal), kontrol positif 1 (sel fibroblas CK + cadmium) yang ditunjukkan dengan notasi nomor 2 pada gambar 3.1. menunjukkan ciri neoplastik berupa: 1) sel membesar (lebih besar dari normal), 2) nukleus membesar (lebih besar dari normal), terdapat 1 atau lebih dan terlihat lebih jelas, 3) membran sel tidak jelas, 4) sel cenderung multipolar, 5) ikatan antar sel berkurang, 6) kultur membentuk lebih dari selapis sel (beberapa lapis sel). Pada kelompok perlakuan (sel fibroblas CK + cadmium + gen cWnt5a), pemberian gen cWnt5a pada sel CK kanker menunjukkan karakter neoplastik seperti halnya CK kanker yaitu pada kontrol positif 1 (sel fibroblas CK + cadmium), namun perbedaan berupa nukleus lebih tidak jelas. Sedangkan pada kontrol positif 2 (sel CK 7 fibroblas + gen cWnt5a), pemberian gen cWnt5a pada sel CK normal menunjukkan karakter morfologi yang tidak berbeda dengan kontrol negatif (sel fibroblas CK normal). Aktivitas Gen cWnt5a Terhadap Viabilitas Sel Fibroblas CK Pengamatan viabilitas dapat dilihat dari 2 hal yaitu: 1) indek viabilitas yang ditunjukkan oleh nilai absorbansi/Opticle Density (O.D) dan 2) Indeks Stimulasi (I.S). Nilai absorbansi kultur sel menunjukkan banyaknya jumlah sel hidup. Indeks stimulasi menunjukkan efek stimulasi agensia terhadap viabilitas sel. Nilai absorbansi didapat dari hasil MTT proliferation assay dengan pembacaan menggunakan Spectrophotometer Microplate Reader/ELISA reader. Nilai absorbansi masing-masing kelompok perlakuan kemudian dibandingkan dalam grafik yang ditunjukkan pada Gambar 3.2. berikut. 1.4 CK 1.2 1 CK+Cadmium 0.8 0.6 CK+Cadmium +cWnt5a 0.4 CK+cWnt5a 0.2 0 12 jam Gambar 3.2. 14 jam 16 jam Grafik Profil Nilai Absorbansi Kultur Sel Fibroblas CK pada 4 Macam Perlakuan Selama 3 Periode (12 jam setelah transfeksi gen: periode ke-1,14 jam setelah transfeksi gen: periode ke-2, dan16 jam setelah transfeksi gen: periode ke-3) Berdasarkan grafik pada Gambar 3.2. diketahui bahwa nilai absorbansi kontrol negatif (sel fibroblas CK normal) yang ditunjukkan dengan garis kurva berwarna biru berkisar antara 0,8-1,1. Nilai absorbansi kontrol positif 1 (sel fibroblas CK + cadmium) yang ditunjukkan dengan garis kurva berwarna merah muda berada di atas garis kurva kontrol negatif (sel fibroblas CK normal), dengan nilai absorbansi berkisar antara 1,0-1,2. Nilai absorbansi kontrol positif 2 (sel fibroblas CK + gen cWnt5a) yang ditunjukkan dengan garis kurva berwarna biru muda berada di bawah garis kurva semua perlakuan, dengan nilai absorbansi berkisar antara 0,7-0,9. Sementara itu nilai absorbansi kelompok perlakuan (sel fibroblas CK + cadmium + gen cWnt5a) yang ditunjukkan dengan garis kurva berwarna kuning berada di atas garis kurva kontrol negatif (sel fibroblas CK normal), namun di bawah garis kurva 8 kontrol positif 1 (sel fibroblas CK + cadmium), dengan nilai absorbansi berkisar antara 0,9-1,1. Berdasarkan hasil Anova (lampiran 2) diketahui bahwa gen cWnt5a berpengaruh secara signifikan (p > 0,05) terhadap viabilitas sel fibroblas CK (ditunjukkan dengan nilai absorbansi). Untuk mengetahui beda pengaruh dari masing-masing perlakuan maka dilanjutkan dengan uji DMRT (lampiran 2). Hasil uji DMRT dapat dilihat pada Tabel 3.1. Tabel 3.1. Tabel Hasil Uji Duncan Multiple Range Test Indeks Viabilitas Sel Fibroblas CK Waktu setelah transfeksi 12 jam 14 jam 16 jam 1. CK normal 0.818ab 0.93a 1.1 ab 2. CK + cadmium 0.975c 1.093 a 1.157 c 3. CK + cadmium + gen cWnt5a 0.927bc 1.019 a 1.103 ab 4. CK + gen cWnt5a 0.777a 0.861 a 0.903 a Rerata O.D Keterangan: Uji anova dengan taraf signifikansi 5%, dilanjutkan dengan uji DMRT. Notasi yang berbeda pada kolom yang sama menunjukkan perbedaan yang signifikan. Berdasarkan uji anova diketahui bahwa gen cWnt5a secara signifikan dapat menurunkan indeks viabilitas sel fibroblas CK kanker dibuktikan dengan O.D perlakuan lebih rendah dari O.D CK kanker. Berdasarkan uji lanjut DMRT, diketahui bahwa pada periode 12 jam setelah transfeksi, CK + cadmium berbeda nyata dengan kontrol negatif CK normal. Perlakuan CK + cadmium + cWnt5a tidak berbeda nyata dengan kontrol positif 1 CK + cadmium maupun dengan kontrol negatif CK normal. CK + cWnt5a tidak berbeda nyata dengan kontrol negatif CK normal. Pada periode 14 jam setelah transfeksi, perlakuan CK + cadmium + cWnt5a tidak berbeda nyata dengan CK normal, kontrol positif 1 CK + cadmium, dan kontrol positif 2 CK + cWnt5a. Pada periode 16 jam setelah transfeksi, kontrol positif 1 CK + cadmium berbeda nyata dengan kontrol negatif CK normal. Perlakuan CK + cadmium + gen cWnt5 berbeda nyata dengan kontrol positif 1 CK + cadmium, namun tidak berbeda nyata dengan kontrol positif 2 CK + gen cWnt5a dan kontrol negatif CK normal. 9 Pengamatan indeks viabilitas kemudian dilanjutkan dengan mencari nilai I.S (Indeks Stimulasi) untuk mengetahui aktivitas stimulasi gen cWnt5a pada sel fibroblas CK (lampiran 3). Untuk mengetahui perbandingan nilai indeks stimulasi pada keempat kelompok perlakuan maka dapat diamati grafik pada Gambar 3.3. berikut. 1.4 CK 1.2 1 CK+Cadmium 0.8 CK+Cadmium +cWnt5a 0.6 0.4 CK+cWnt5a 0.2 0 12 jam 14 jam 16 jam Gambar 3.3. Grafik Nilai Indeks Stimulasi Kultur Sel Fibroblas CK pada 4 Macam Perlakuan Selama 3 Periode (12 jam setelah transfeksi gen: periode ke-1, 14 jam setelah transfeksi gen: periode ke-2, dan 16 jam setelah transfeksi gen: periode ke-3) Nilai I.S kontrol positif 1 (sel fibroblas CK terinduksi kanker dengan cadmium) yang ditunjukkan dengan garis kurva berwarna merah muda berada di atas garis kurva kontrol negatif (sel fibroblas CK normal) yang ditunjukkan dengan warna biru (> 1.00) dari periode 12 jam sampai periode 16 jam, namun pengaruhnya menurun walaupun masih di atas kontrol negatif. Nilai I.S perlakuan (sel fibroblas CK + cadmium + gen cWnt5a) yang ditunjukkan dengan garis kurva berwarna kuning pada grafik berada di bawah garis kurva kontrol negatif (< 1.00) dan menurun dari periode 12 jam hingga periode 16 jam setelah transfeksi. Sedangkan nilai I.S kontrol positif 2 (sel fibroblas CK + gen cWnt5a) yang ditunjukkan dengan garis kurva berwarna biru muda berada di bawah garis kurva kontrol negatif (< 1.00) dan di bawah garis kurva perlakuan. PEMBAHASAN Regulasi Morfologi Sel Fibroblas CK oleh Gen cWnt5a Morfologi sel menunjukkan adanya berbagai aktivitas seluler yang terjadi pada sel tersebut. Adanya perubahan karakter morfologi oleh suatu agensia tertentu 10 2 dari karakter normalnya menunjukkan terjadinya perubahan aktivitas seluler yang abnormal. Berdasarkan hasil penelitian ini dapat diketahui karakter morfologi sel fibroblas CK normal berupa: 1) sel berbentuk bipolar atau multipolar, 2) sel memiliki panjang 4 kali lebarnya, tersusun satu sama lain dengan membentuk barisan yang kompak dan memusat seperti pusaran air, 3) nukleus tidak jelas, 4) ikatan antar sel kuat, 5) membran sel tampak jelas, 6) sel yang telah mencapai confluent berbentuk bipolar, 7) sel yang telah confluent membentuk selapis sel (Weissmanshomer, 1975). Induksi cadmium dapat mengubah karakter morfologi dari sel fibroblas CK normal menjadi kanker. Berdasarkan hasil penelitian ini diketahui karakter morfologi sel CK kanker terinduksi cadmium berupa: 1) sel membesar, 2) nukleus membesar, terdapat 1 atau lebih nukleus dalam 1 sel, dan nukleus terlihat lebih jelas, 3) membran sel tidak jelas, 4) sel cenderung multipolar, 5) ikatan sel dengan sel lainnya berkurang, 6) kultur membentuk lebih dari selapis sel. Hal yang menarik terjadi pada kultur sel kanker yang dipapar dengan gen cWnt5a. Pada sel CK kanker (CK + cadmium), gen cWnt5a menimbulkan ciri berupa nukleus sel tampak tidak jelas dibandingkan dengan sel CK kanker, sel tampak lebih kecil dibandingkan dengan sel kanker, dan tampak lapisan tipis di pinggiran sel.Sel kanker tersebut dalam pengamatan sedang mengalami proses apoptosis atau kematian, lapisan tipis merupakan hasil buangan dari degradasi sitoskeleton(Bohm, 2003) dan tanda awal pembentukan bleb atau biasa disebut blebbing (Fackler, 2008). Cadmium memiliki afinitas yang tinggi terhadap komponen sel sehingga dapat mengubah struktur dan fungsi sel (Takiguchi et al, 2003). Membesarnya sel dan nukleus, terdapat 1 atau lebih nukleus dalam 1 sel serta nampak lebih jelasnya membran nukleus diduga merupakan akibat dari cadmium yang memiliki sifat tersebut, yang menggambarkan kegagalan pembelahan sel sehingga sel menjadi bentukan giant cell. Karakter neoplastik pada sel fibroblas CK lainnya yaitu adanya juluran sitoplasma yang lebih dari 2 (multipolar) yang menunjukkan peningkatan viabilitas. Cadmium dapat menyebabkan oksidasi DNA sehingga secara tidak langsung mengakibatkan peningkatan viabilitas, inhibisi apoptosis dan kegagalan DNA repair (Hartwig, 1998). Selain itu cadmium mampu meningkatkan sinyal Wnt canonical/β-catenin dengan meningkatkan translokasi nuclear β-catenin sehingga proliferasi meningkat (Chakraborty, 2010). Ciri neoplastik CK kanker terinduksi cadmium lainnya yaitu membran sel tidak jelas dan ikatan sel satu dengan yang lain menjadi berkurang, hal ini diduga disebabkan karena cadmium menyebabkan kerusakan ikatan E-cadherin (salah satu protein Junction yang menjaga integritas jaringan) dengan β-catenin (Chakraborty, 2010). Ciri yang terakhir berupa terbentuknya beberapa lapis sel yang tidak sesuai dengan pertumbuhan sel CK yang diduga dikarenakan meningkatnya variasi sel akibat transformasi neoplastik oleh aktivitas cadmium. Menurut Hatwell & Weinert (1989), variasi sel yang muncul 11 dalam frekuensi yang tinggi terjadi karena adanya perubahan kromosom dan organisasi genetik. Cadmium dapat mengakibatkan degenerasi berupa transmutasi sel (Waalkes, 2003). Variasi sel kemudian dapat menyebabkan motilitas sel karena adanya produk enzim tertentu sehingga menimbulkan invasi jaringan atau metastasis. Dengan demikian, maka terbentuklah beberapa lapis sel pada sel CK kanker terinduksi cadmium (Hatwell & Weinert, 1989). SEL KADERIN CADMIUM BETA-KATENIN SEL NUKLEUS Gambar 4.1. Bagan ini menunjukkan bagaimana pengaruh cadmium pada sel yaitu dengan merusak ikatan antar sel melalui kaderin, kerusakan pada kaderin membuat beta-katenin tidak dapat mengikat pada permukaan sel sehingga beta-katenin ter-overekspresi kedalam nukleus dan menyebabkan berlebihnya sinyal pada sel untuk melakukan proliferasi. Transfeksi gen cWnt5a pada sel CK normal hingga 16 jam tidak memberikan pengaruh perubahan morfologi apapun. Hal ini disebabkan karena pada kondisi normal, gen Wnt5a meregulasi pengaturan sitoskeletal (Jonsson et al., 1998). Dari hasil ini, diketahui bahwa gen cWnt5a menunjukkan pengaruh yang berbeda terhadap perubahan morfologi sel CK normal dan sel CK kanker. Nukleus CK kanker yang diberi gen cWnt5a tidak jelas dibandingkan dengan Nukleus CK kanker. Ketidakjelasan nukleus sel CK kanker + gen cWnt5a dibanding CK kanker diduga karena menurunnya aktivitas nukleus sel CK sebagai akibat ekspresi gen cWnt5a. Dari penelitian ini diketahui bahwa, pada periode 16 jam setelah transfeksi gen cWnt5a belum mampu memperbaiki kerusakan morfologi sel kanker akibat induksi cadmium. Regulasi Viabilitas Sel Fibroblas CK oleh gen cWnt5a Berdasarkan uji anova dengan taraf signifikansi 5%, gen cWnt5a berpengaruh secara signifikan (p > 0,05) terhadap viabilitas sel fibroblas CK. Sedangkan berdasarkan uji DMRT diketahui bahwa indeks viabilitas kontrol positif 1 (sel fibroblas CK + cadmium) dibandingkan dengan kontrol negatif (sel fibroblas CK normal) berbeda signifikan. Hal ini membuktikan bahwa cadmium bersifat 12 karsinogenik pada sel. Berdasarkan hasil analisis indeks stimulasi, diketahui bahwa nilai I.S CK kanker (> 1.00). Hal ini berarti bahwa cadmium menyebabkan naiknya tingkat viabilitas sel CK terinduksi cadmium (CK kanker) lebih tinggi dibandingkan dengan CK normal. Perlakuan gen cWnt5a pada sel fibroblas CK normal menimbulkan perbedaan indeks viabilitas sel antara kontrol positif 2 (CK + gen cWnt5a) dengan kontrol negatif (sel fibroblas CK normal) yang tidak signifikan. Perbedaan indeks viabilitas sel yang tidak signifikan antara kontrol positif 2 dengan kontrol negatif terjadi pada periode 12 jam setelah transfeksi hingga 16 jam setelah transfeksi. Perlakuan gen cWnt5a pada sel fibroblas CK normal menunjukkan nilai I.S (< 1.00). Hal ini berarti bahwa gen cWnt5a indeks viabilitas sel CK normal namun penurunannya tidak terjadi secara signifikan. Hal ini diduga terjadi karena perlakuan gen cWnt5a pada sel fibroblas CK normal merupakan perlakuan yang dapat menimbulkan overexpress gen Wnt5a pada sel CK. Menurut Topol (2003), Wnt5a mampu meregulasi stabilitas protein β-catenin melalui ekspresi Siah2 pada perkembangan organ anggota pada mencit. β-catenin merupakan protein yang terlibat dalam jalur Wnt canonical, berfungsi untuk mengikat faktor transkripsi LEF/TCF dan mengubahnya dari repressor menjadi aktivator pertumbuhan (Polakis, 2000). Dengan demikian Wnt5a dapat meregulasi stabilitas β-catenin sehingga viabilitas sel berjalan normal. Adanya perlakuan yang menimbulkan overexpress gen cWnt5a terhadap sel fibroblas CK pada penelitian ini diduga dapat menyebabkan penurunan viabilitas sel. Akibat dari peningkatan ini diduga menyebabkan regulasi Wnt5a terhadap β-catenin juga meningkat dan viabilitas sel menurun, meskipun indeks viabilitas sel fibroblas CK + gen cWnt5a tidak terbukti berbeda signifikan dengan CK normal. Pada perlakuan gen cWnt5a terhadap sel fibroblas CK kanker terinduksi cadmium menimbulkan perbedaan indeks viabilitas sel antara kelompok perlakuan (sel fibroblas CK + cadmium + gen cWnt5a) dengan kontrol negatif (sel fibroblas CK normal) dan kontrol positif 1 (sel fibroblas CK + cadmium). Perbedaan indeks viabilitas sel pada kelompok perlakuan (sel fibroblas CK + cadmium + gen cWnt5a) dengan kontrol negatif (sel fibroblas CK + cadmium) tidak signifikan pada periode 12 jam setelah transfeksi hingga 16 jam setelah transfeksi. Sedangkan perbedaan indeks viabilitas sel pada kelompok perlakuan (sel fibroblas CK + cadmium + gen cWnt5a) dengan kontrol positif 1 (sel fibroblas CK + cadmium) adalah tidak signifikan pada 12 jam dan 14 jam setelah transfeksi, namun signifikan pada 16 jam setelah transfeksi. Perlakuan gen cWnt5a pada sel CK kanker terinduksi cadmium menunjukkan nilai I.S (> 1.00) dengan nilai yang mendekati 1.00, namun lebih rendah dari I.S CK kanker. Hasil ini membuktikan bahwa gen cWnt5a menurunkan viabilitas sel CK kanker terinduksi cadmium setelah 16 jam transfeksi, dengan penurunan hingga mendekati normal. 13 Induksi cadmium telah dapat dipastikan terjadi pada penelitian ini dibuktikan dengan perbedaan morfologi dan perbedaan indeks viabilitas yang signifikan antara sel fibroblas CK kanker terinduksi cadmium dengan sel fibroblas CK normal. Menurut Chakraborty (2010), cadmium mampu meningkatkan aktivitas sinyal Wnt canonical/β-catenin pada kultur sub confluent Kidney PTC (Proximal Tubule Cell) sehingga dapat menimbulkan kanker dengan meningkatkan translokasi β-catenin ke nukleus dan meningkatkan ekspresi gen pengontrol pertumbuhan. Dengan adanya hasil penelitian yang membuktikan bahwa gen cWnt5a dapat menurunkan indeks viabilitas pada sel fibroblas CK kanker terinduksi cadmium ini, maka telah dibuktikan bahwa gen cWnt5a dapat meregulasi kanker (down regulate) pada sel fibroblas CK terinduksi cadmium melalui sinyal Wnt canonical/β-catenin yang sebelumnya telah ditingkatkan aktivitasnya oleh cadmium. Namun dari penelitian ini belum dapat diketahui interaksi seluler antara gen cWnt5a dengan cadmium sehingga gen cWnt5a mampu menurunkan indeks viabilitas sel secara signifikan. PENUTUP Berdasarkan penelitian ini dapat disimpulkan bahwa pada periode 16 jam setelah transfeksi gen cWnt5a dapat meregulasi kanker pada sel fibroblas Chicken Kidney (CK) terinduksi cadmium dengan merangsang peningkatan apoptosis yang tampak pada penanda morfologi sel kanker dan menurunkan viabilitas sel fibroblas CK kanker. Dari hasil penelitian ini, maka disarankan untuk dilakukan penelitian lebih lanjut mengenai pola regulasi gen cWnt5a pada sel CK terinduksi kanker dengan cadmium berdasarkan aktivitas seluler melalui petanda molekular sehingga dapat diketahui interaksi gen cWnt5a dengan cadmium sehingga dapat menyebabkan penurunan viabilitas sel fibroblas CK kanker. DAFTAR RUJUKAN Böhm, I. 2003. Disruption of the cytoskeleton after apoptosis induction by autoantibodies. Autoimmunity 2003;36. Buick, R. N. & Tannock, I. F. 1992. Properties of Malignant Cell: The Basic Science of Oncology. New York: McGraw Hill. Chakraborty, P. K., Lee, W. K., Molitor, M., Wolff, N. A. & Thevenod, F. 2010. Cadmium Induces Wnt Signaling To Upregulate Proliferation And Survival Genes In Sub-Confluent Kidney Proximal Tubule Cells. Molecular Cancer, 9 (102): 2-16. Fackler, OT. Grosse, R. 2008. Cell motility through plasma membrane blebbing. J Cell Biol. Hartwig, A., Asmuss, M., Ehleben, I., Herzer, U., Kostelac, D., Pelzer, A., Schwedtle, T. & Burkle, A. 2002. Interference by Toxic Metal Ions with 14 DNA Repair Processes and Cell Cycle Control: Molecular Mecanisms. Environmental Health Perspectives, 110 (5): 797-799. Holmes, B. 2003. Gene Therapy May Switch off Huntington’s. New Scientist, 10 (35) : 13. IARC. 1997. Beryllium, Cadmium, Mercury and Exposures in the Glass Manufacturing Industry. International Agency for Research on Cancer: World Health Organization, 58: 8-13. Jonsson, M., Smith, K. & Harris, A. L. 1998. Regulation Of Wnt5a Expression in Human Mammary Cells by Protein Kinase C Activity and The Cytoskeleton. British Journal of Cancer, 78 (4): 430-438. Kresno, S. B. 2001. Imunologi: Diagnosis dan Prosedur Laboratorium. Jakarta: Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia. Liang, H., Coles, A. H., Zhu, Z., Zayas, J., Jurecic, R., Kang, J., Jones, Stephen H.J. 2007. Noncanonical Wnt Signaling Promotes Apoptosis in Thymocyte Development. The Journal of Experimental Medicine, 204 (13): 3077-3084. Listyorini, D. & Yasugi, S. 2006. Expression and Function of Wnt5a in the Development of the Glandular Stomach in the Chicken Embryo. Develop. Growth Differ, 48: 243-252. Pandoyo, A. S. 2000. Pengaruh Aktivitas Ekstrak Tanaman Cincau Hijau (Cyclen Barbata L. Miers) Terhadap Proliferasi Sel Limfosit Darah Tepi Manusia Secara In Vitro. Skripsi tidak diterbitkan. Bogor: Institut Pertanian Bogor. Nusse, Roel. Varmus, Harold E. 1992. Wnt genes. Cell 69 (7): 1073–1087. Peifer, M., Rauskolb, C., Williams, M., Riggleman, B. & Wieschaus, E. 1991. The segment polarity gene armadillo interacts with the wingless signaling pathway in both embryonic and adult pattern formation. Development III (4): 1029–1043. Polakis, P. 2000. Wnt Signaling and Cancer. Genes Development, 14: 1837-1851. TACS. Tanpa tahun. TACSTM MTT Assay. Trevigen Inc. Takiguchi, M., Achanzar, W. E., Qu, Wei., Li, G. & Waalkes, M. P. 2003. Effects of Cadmium on DNA-(Cytosine-5) Methyltransferase Activity and DNA Methylation Status During Cadmium-Induced Cellular Transformation. Experimental Cell Research, 286: 355-365. Weissmanshomer, P. & Fry, M. 1975. Chick embryo fibroblasts senescence in vitro: Pattern of cell division and life span as a function of cell density. Mechanisms of Ageing and Development 4 (2): 159–166 Wodarz, A. & Nusse, R. 1998. Mechanism of Wnt Signaling in Development. Annu. Rev. Cell Developmental Biology, 14: 59-88. WHO. 2012. Cancer. Fact Sheet World Health Organization, 297. Yulia, E. 2011. Dokumentase Terkomunikasikan Berdasarkan Pengalaman. PMPP PUSVETMA. Zarros, A., Skandali, N., Al-Humadi, H. & Liapi, C. 2008. Cadmium (Cd) as a carcinogenetic factor and its participation in the induction of lung cancer. Pneumon, 21 (2): 172-177.
