ISOLASI DAN UJI AKTIVITAS SITOTOKSIK SENYAWA MURNI DARI

SCIENTIA VOL. 6 NO. 2, AGUSTUS 2016
ISOLASI DAN UJI AKTIVITAS SITOTOKSIK SENYAWA MURNI
DARI EKSTRAK ETIL ASETAT DAUN TUMBUHAN
AKAR KAIK-KAIK Uncaria cordata (Lour.) Merr
Noveri Rahmawati, Rahayu Utami, Azwendah
Sekolah Tinggi Ilmu Farmasi Riau
Email : [email protected]
ABSTRAK
Uncaria cordata (Lour.)Merr merupakan salah satu tumbuhan dari genus Uncaria yang
tumbuh di Indonesia. Ekstrak etil asetat dari tumbuhan ini mempunyai aktivitas sitotoksik yang
sangat kuat sehingga perlu dilakukan isolasi dan uji aktivitas sitotoksik senyawa murninya.
Ekstrak etil asetat diiisolasi dengan menggunakan kromatografi kolom dan uji aktivitas
sitotoksik menggunakan metoda Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) . Diperoleh senyawa
murni Uc7 berupa amorf, bewarna putih sebanyak 65 mg dengan titik leleh 232-2340C serta
memberikan warna merah muda pada uji pereaksi warna dengan Liebermann-Burchard.
Berdasarkan hasil karakterisasi dengan spektroskopi UV dan IR serta perbandingan data dari
literatur, senyawa Uc7 yang diperoleh kemungkinan berasal dari golongan terpenoid. Senyawa
Uc7 memiliki nilai LC50 sebesar 2,75µg/mL dan nilai ini menunjukkan bahwa senyawa ini
mempunyai aktivitas sitotoksik yang sangat kuat.
Kata kunci: Isolasi, Sitotoksik, Terpenoid, Uncaria cordata
ABSTRACT
Uncaria cordata (Lour.) Merr is one of the genus Uncaria plant that native to
Indonesia. The ethyl acetate extract of this plant has a very strong cytotoxic activity so it is
necessary to isolate and evaluate the cytotoxic activity of pure substance. Ethyl acetate extract
was isolated by using
column chromatography and cytotoxic activity was done by Brine
Shrimp Lethality Test (BSLT) method. Uc7 pure compound was obtained in the form of
amorphous, white coloured as much as 65 mg with a melting point of 232-2340C and give pink
in color reagent test with the Liebermann-Burchard. Based on the results of characterization by
UV and IR spectroscopy as well as a comparison of data from the literature, the Uc7 compound
was suggested the group of terpenoids. Compounds Uc7 have LC50
this value indicated that compound has a very strong cytotoxic activity.
Keywords: Isolation, Cytotoxic, Terpenoid, Uncaria cordata
PENDAHULUAN
Kekayaan flora yang dimiliki oleh
Indonesia berpotensi untuk dikembangkan
dalam pencarian obat baru. Diduga dari
sekitar 30.000 jenis flora yang ada di dalam
hutan tropis Indonesia sekitar 9.600 spesies
telah diketahui berkhasiat obat, dari jumlah
tersebut tercatat 283 spesies merupakan
ISSN : 2087-5045
tumbuhan obat penting bagi industri obat
tradisional (Kusuma dan Zaky, 2005).
Salah satu tumbuhan obat yang
digunakan masyarakat di beberapa negara
tropis ialah tumbuhan genus Uncaria.
Beberapa penelitian
terdahulu yang
dilakukan
terhadap
genus
Uncaria
diantaranya Uncaria gambir dilaporkan
memiliki aktivitas sitotoksik yang sangat
122
SCIENTIA VOL. 6 NO. 2, AGUSTUS 2016
kuat terhadap larva Artemia salina Leach
menggunakan metode Brine Shrimp
Lethality Test (BSLT) dengan LC50 26,30
µg/mL dari fraksi etil asetat (Suminiati,
2013). Penelitian lainnya yang dilakukan
oleh (Bacher, 2005) dengan metode MTT
(3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5difeniltetrazolium
bromid)
terhadap
Uncaria tomentosa menyatakan bahwa
kandungan kimia dari Uncaria tomentosa
yaitu pteoropodin dan uncarin F mampu
menghambat poliferasi sel leukemia
limfoblastik akut. Penelitian terhadap
Uncaria perrottetii juga telah dilakukan
(Vital dan Rivera, 2009) dengan
menggunakan metode TUNEL
dan
menunjukkan hasil bahwa ekstrak Uncaria
perrottetii mampu mengurangi jumlah
parasit dan terjadinya perubahan apoptosis
pada kit deteksi kematian sel.
Salah satu tumbuhan genus
Uncaria yang ditemukan di Indonesia
khususnya di hutan Larangan Adat
Kabupaten Kampar Propinsi Riau adalah
Uncaria cordata (Lour.) Merr. Telah
dilakukan uji aktivitas sitotoksik dari
ekstrak n-heksana, etil asetat, metanol dan
diperoleh nilai LC 50 sebesar 7,46 µg/mL,
6,66 µg/mL dan 7,83 µg/mL. Berdasarkan
nilai LC50 di atas maka perlu dilakukan
isolasi dan uji aktivitas sitotoksik senyawa
murni hasil isolasi dari ekstrak etil asetat
daun Uncaria cordata (Lour.) Merr dengan
menggunakan metode Brine Shrimp
Lethality Test (BSLT).
METODE PENELITIAN
Alat dan Bahan
Alat yang digunakan dalam
penelitian ini adalah kolom kromatografi,
chamber,
lampu
ultraviolet,
spektrofotometer UV, spektrofotometer IR,
alat pengukur titik leleh Fisher Johns,
corong, tisu, spatel, timbangan analitik,
aluminium foil, rak dan tabung reaksi, pipet
mikro, plat tetes, pipet tetes, beker glass,
gelas ukur, kapas,wadah akuarium, aerator,
lampu dan vial uji.
Bahan-bahan
yang
digunakan
adalah ekstrak etil asetat daun tumbuhan
Uncaria cordata (Lour.) Merr., kloroform 2
ISSN : 2087-5045
N, kloroform amoniak 0,05 N, reagen
Mayer, FeCl 3 1%, logam Mg, HCl pekat,
asam asetat anhidrat, H2SO4 pekat, nheksana, etil asetat, metanol, silika gel, plat
Kromatografi Lapis Tipis (KLT), air laut,
larva
Artemia
salina
Leach
dan
dimetilsulfoksida (DMSO).
Prosedur Kerja
Isolasi Senyawa Murni
Sebanyak 4 g ekstrak etil asetat
dipreabsorbsi terlebih dahulu dengan
menggunakan silika gel 60 sehingga
menjadi serbuk. Dilakukan packing kolom
dengan cara membuat bubur silika dengan
pelarut organik yaitu n-heksana lalu
dimasukkan ke dalam kolom dan kemudian
dielusi sampai kerapatan silika dalam
kolom maksimum. Ekstrak yang sudah
dipreabsorbsi kemudian dimasukkan ke
dalam kolom dan dielusi menggunakan
metoda SGP (step gradient polarity)
menggunakan pelarut n-heksan (non polar),
etil asetat (semi polar), dan metanol (polar).
Eluen akan
ditingkatkan kepolarannya
apabila pita yang turun dengan eluen
sebelumnya telah terelusi semua dan
ditampung dalam vial yang sudah diberi
nomor.
Hasil pemisahan kromatografi
kolom dilakukan uji KLT. Vial-vial yang
akan diuji ini diambil secara acak setiap 5
vial. Vial yang mempunyai harga Rf yang
sama dapat digabungkan menjadi satu
fraksi. Fraksi yang mempunyai pemisahan
yang cukup baik kemudian dimurnikan
sehingga diperoleh senyawa murni.
Senyawa murni yang diperoleh dilakukan
uji sitotoksik, pengukuran titik leleh, uji
Liebermann-Burchard serta karakterisasi
menggunakan spektroskopi Ultraviolet
(UV) dan spektroskopi Inframerah (IR).
Uji Sitotoksik Dengan Metode Brine
Shrimp Lethality Test (BSLT)
Wadah disiapkan terlebih dahulu
untuk penetasan larva udang, kemudian
diberi sekat dan sebagian ditutup dengan
menggunakan alumunium foil.Wadah yang
sudah siap, diisi dengan air laut yang sudah
disaring. Kista udang dimasukkan pada
bagian wadah yang ditutup dengan
123
SCIENTIA VOL. 6 NO. 2, AGUSTUS 2016
alumunium foil dan diletakkan di bawah
pencahayaan lampu, biarkan hingga 48 jam.
Vial uji yang dikalibrasi sebanyak
5mL. Sampel uji ditimbang sebanyak 20
mg, kemudian dilarutkan dengan 2 mL
pelarut yang melarutkannya, sehingga
diperoleh larutan induk 10000 µg/mL. Dari
larutan induk dipipet sebanyak 0,5 mL dan
ditambah pelarut hingga 5 mL ke dalam
vial yang sebelumnya telah dikalibrasi
sehingga
diperoleh
larutan
dengan
kosentrasi 1000 µg/mL. larutan dengan
kosentrasi 1000µg/mL dipipet sebanyak 0,5
mL ke dalam 4 vial berbeda, dimana larutan
uji di 3 vial diuapkan dan 1 vial lainnya
ditambah dengan pelarut hingga 5 mL
sehingga diperoleh larutan uji dengan
kosentrasi 100 µg/mL. Perlakuan yang
sama dilakukan hingga didapatkan larutan
uji dengan kosentrasi 10 µg/mL.
Masing-masing vial berisi sampel
uji yang telah diuapkan ditambahkan ke
dalamnya dimetil sulfoksida sebanyak 50
µg/mL, lalu larva udang sebanyak 10 ekor
dan ditambah air laut hingga 5 mL.
Pengamatan dilakukan setelah 24 jam
dengan menghitung jumlah larva yang mati.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Isolasi dari ekstrak etil asetat
diawali dengan melakukan pemisahan
menggunakan kromatografi kolom. Hasil
kromatografi kolom ditampung dalam vial
dan dibiarkan menguap. Sebanyak 467 vial
diperoleh dari kromatografi kolom dan
kemudian dilakukan pemeriksaan KLT
dengan jarak 5 vial, pola nodanya diamati
dibawah lampu UV dan ditandai
menggunakan pensil tepat pada nodanya.
Fraksi yang memiliki noda dan nilai Rf
yang sama kemudian digabung sehingga
didapat 11 fraksi gabungan yang hasilnya
kemudian diperiksa kembali menggunakan
KLT (Gambar 1). Semua fraksi diberi
label Uc1-Uc11. Fraksi Uc1 (vial 67-77),
fraksi Uc2 (vial 127-202), fraksi Uc3 (vial
222-242), fraksi Uc4 (252-272), fraksi Uc5
(vial 322-327), fraksi Uc6 (vial 337-342),
fraksi Uc7 ( vial 347-352), fraksi Uc8 ( vial
387-392), fraksi Uc9 (vial 397-402), fraksi
Uc10 (vial 412-417), fraksi Uc11(vial 457462).
Gambar 1. Profil
KLT
Hasil
Penggabungan Fraksi Kolom
dari Ekstrak Etil Asetat
Uncaria cordata (Lour.) Merr
Dengan Penampak Noda
Anisaldehid
Fraksi Uc5, Uc6, dan Uc7 dipilih
untuk dilakukan pencucian, karena ketiga
fraksi ini berbentuk amorf bewarna putih
kekuningan. Tujuan dari dilakukannya
pencucian adalah untuk menghilangkan
pengotornya,
sehingga
dengan
dilakukannya pencucian diharapkan didapat
amorf bewarna putih.Pencucian dilakukan
berdasarkan perbedaan kelarutan antara zat
yang akan dimurnikan dengan pengotor
dalam suatu pelarut tunggal atau kombinasi
dari beberapa pelarut yang cocok.
Pencucian ini dilakukan dengan cara
melarutkan amorf dengan sedikit pelarut
yang melarutkannya yaitu etil asetat dan
kemudian menambahkan lebih banyak
pelarut yang tidak melarutkannya yaitu nheksan. Apabila amorf sudah mengendap
kembali kemudian pipet pelarut yang
tersisa.Proses pencucian ini dapat dilakukan
berulang-ulang sampai didapatkan senyawa
murni. Dari ketiga fraksi yang dilakukan
pencucian, fraksi Uc7 menunjukkan hasil
yang lebih baik dari kedua fraksi lainnya,
ditunjukkan dengan diperolehnya amorf
bewarna putih
sebanyak
65
mg
(Gambar 2).
Gambar 2. Senyawa Murni Uc 7
ISSN : 2087-5045
124
SCIENTIA VOL. 6 NO. 2, AGUSTUS 2016
Senyawa Uc7 diuji kembali untuk
memastikan bahwa senyawa ini murni
dengan pengujian titik leleh dan diperoleh
nilai titik leleh 232-234
leleh yang sempit ini dapat dikatakan
bahwa senyawa dalam keadaan murni
(Fiesser dan Williamson 1992). Pengujian
Kromatografi Lapis Tipis (KLT) dilakukan
pada beberapa eluen yang berbeda
menggunakan pereaksi warna anisaldehid.
Tujuan pemberian pereaksi warna adalah
untuk membantu memperjelas penampakan
bercak noda pada plat KLT dikarenakan
pada lampu UV 254 dan 366 nm tidak
memberikan tampak noda yang jelas.
Pereaksi warna anisaldehid biasanya
digunakan untuk senyawa- senyawa
terpenoid. Pereaksi warna anisaldehid akan
membentuk
kompleks
sehingga
menimbulkan warna yang spesifik dan jelas
untuk senyawa-senyawa kimia. Adapun
bercak warna yang ditunjukkan meliputi
hijau, biru, coklat hingga
merah
(Matuszewska dan Jhon,2004). Pada
pemeriksaan KLT didapatkan satu noda,
maka senyawa tersebut bisa dikatakan
sudah murni (Gambar 3).
menunjukkan
bahwa
senyawa
Uc7
memiliki gugus kromofor, diduga serapan
ini diberikan oleh gugus C=O yang juga
terlihat pada spektrum IR.
Gambar 4. Spektrum UV Senyawa Uc7
Pada spektrum IR pita serapan
terdapat didaerah bilangan gelombang 1690
dan 1681 cm-1 yang berasal dari gugus
C=O, untuk pita yang muncul pada
bilangan gelombang 2964,72 cm-1, 2927,10
cm-1, 2904,92 cm-1, dan 2871,17 cm-1
menunjukkan adanya gugus C-H hal ini
memberikan petunjuk kemungkinan adanya
gugus metil dan metilena, dugaan ini
diperkuat oleh adanya serapan pada
bilangan gelombang 1459,21 cm-1 yang
disebabkan oleh gugus -CH2 hali ini
mengindikasikan adanya gugus gem dimetil
yang merupakan ciri khas senyawa
terpenoid (Supratman, 2010) (Gambar 5).
Gambar 3. Profil KLT Senyawa Murni
Uc7
dengan
Berbagai
Perbandingan
dan
Penambahan
Reagen
Penampak Noda Anisaldehid
Senyawa murni Uc7 dikarakterisasi
menggunakan
spektroskopi
UVdan
IR.Hasil pengukuran spektrofotometer UV
senyawa Uc7 yang diukur dengan pelarut
metanol pada rentang panjang gelombang
200-400 nm menunjukkan adanya serapan
maksimum pada panjang gelombang 280
nm dan 276 nm (Gambar 4)
maks
ISSN : 2087-5045
Gambar 5. Spektrum IR senyawa Uc7
Senyawa Uc7 dilakukan pengujian
aktivitas sitotoksik menggunakan metode
Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) dengan
kosentrasi 100, 10, 1 µg/mL dan dari
masing-masing
konsentrasi
diperoleh
persen kematian sebesar 90%, 80 % dan
125
SCIENTIA VOL. 6 NO. 2, AGUSTUS 2016
30%. Nilai probit yang didapat yaitu
6,2816, 5,8416, dan 4,4756.
Dari perhitungan yang dilakukan
didapatkan nilai LC 50 sebesar 2,57 µg/mL.
Senyawa ini dapat dikategorikan memiliki
aktivitas sitotoksik yang sangat kuat, karena
suatu senyawa dikatakan bersifat sitotoksik
jika nilai LC 50 kecil dari 30 µg/mL (Meyer
et al, 1982). Aktivitas sitotoksik yang
sangat kuat pada senyawa Uc7 ini diduga
karena adanya senyawa golongan terpenoid
di dalamnya. Hal ini didukung oleh
beberapa penelitian dimana golongan
senyawa
terpenoid
dari
Uncaria
rhynchphylla
mampu
menghambat
phospolipase
50
berkisar antara 9,5 – 44,6 µM (Andre et al,
2013).
KESIMPULAN
Senyawa
yang
diperoleh
merupakan senyawa
Uc7 golongan
terpenoid dan mempunyai aktivitas
sitotoksik kategori sangat kuat yaitu 2,57
pµg/mL.
DAFTAR PUSTAKA
Andre, N., Wang, X., He, Y., Pan, G., kojo,
A., Liu, Y., 2013, A Review of the
Occurrence
of
Non-Alkaloid
Constituent in Uncaria Species and
Their
Structure-Activity
Relationship, American Journal of
Biomedical and life Sciences, Vol
1, No. 4, Hal. 79-98.
Bacher, N., Tiefenthaler, M., Sturm, S.,
Stuppner, H., Ausserlechner, M. J.,
Kofler, R., dan Konwalinka, G.,
2005, Oxindole alkaloids from
Uncaria
tomentosa
Induce
Apoptosis in Proliferating, G0/G1Arrested and bcl-2-Expressing
Acute Lymphoblastic Leukemia
Cells,
British
Journal
of
Hematology, Vol 123, Hal. 615622.
Fiesser, L.F., Williamson, K.L., 1992
Organic Experiments 7th Ed.,
ISSN : 2087-5045
D.C.Heath and Company,Toronto,
Canada.
Kusuma, F.Rdan Zaky, B.M., 2005,
Tumbuhan Liar Berkhasiat Obat,
Agromedia Pustaka, Jakarta.
Matuszweska.A and Jhon.A., 2004, Some
Possibilities
of
Thin Layer
Chromatographic Analysis of The
Molecular Phase of Balticamber
and Other Natural Resins, Acta
Chromatographica.
Meyer, B.N.,Feerigni, N,R., Putnam, J.E.,
Jacobson, L,B., Nicholas, D,E., dan
McLaughlin, J, L., 1982, Brine
Shrimp: A convenient. General
Bioasssay For Active Plant
Constituens, Plant Medical, Vol 45,
Hal. 31-34.
Suminiati, 2013, Skrining Aktivitas
Antioksidan dan Sitotoksik dari
Ekstrak dan Fraksi Daun Gambir
(Uncaria gambir) ( Hunter) Roxb,
Skripsi, Sekolah Tinggi Ilmu
Farmasi Riau, Pekanbaru.
Supratman, U., 2010, Elusidasi Struktur
Senyawa
Organik,
Univeritas
Padjajaran, Bandung.
Vital, P. G., dan Rivera, W. L., 2009,
Antimicrobial
Activity
and
Cytotoxicity
of
Chromlaena
odorata (L.f) King and Robinson
and Uncaria perrottetii (A. Rich)
Merr.
Extracts,
Journal
of
Medicinal Plant Reasearch, Vol 3,
No 7, Hal. 511-518.
126