BAB I PENDAHULUAN A. Latar Belakang Penyakit kardiovaskuler merupakan penyakit penyebab kematian terbesar di dunia. Angka kematian akibat dari serangan penyakit kardiovaskuler masih akan terus bertambah seiring dengan perubahan gaya hidup masyarakat dunia dan semakin berkurangnya aktivitas fisik. Penyakit kardiovaskular (khususnya aterosklerosis) diperkirakan menjadi penyebab utama penyakit yang diderita oleh masyarakat dunia pada tahun 2020. Salah satu penyakit kardiovaskular adalah aterosklerosis. Aterosklerosis menyebabkan nyeri di dada, serangan jantung, dan stroke. Aterosklerosis menyebabkan kematian lebih tinggi setiap tahunnya daripada kanker (Libby, 2004; Dipiro et al., 2008; Loscalzo, 2010). Pada awalnya, aterosklerosis dikaitkan dengan pengendapan lemak di dalam pembuluh darah arteri. Penelitian-penelitian di bidang kardiovaskular terkini menunjukkan bahwa aterosklerosis terkait inflamasi yang dipicu oleh agen-agen pro-inflamasi, seperti: oxLDL, TNF-α, dan IL. Agen-agen proinflamasi yang terlibat di dalam inflamasi berkontribusi dalam bermigrasinya leukosit dan pembentukan plak aterosklerosis pada arteri (Lusis, 2000; Libby, 2002; Takeuchi & Akira, 2010; Riccioni & Sblendorio, 2012). Oleh karena itu, salah satu terapi yang bisa dilakukan untuk menanggulangi aterosklerosis adalah menargetkan inflamasi melalui penghambatan migrasi leukosit. 1 2 Salah satu senyawa yang diketahui mampu menghambat mediator inflamasi adalah kurkumin. Kurkumin menghambat beberapa mediator inflamasi, seperti: TNF-α, IL (IL-1, -1β, -6, dan -8), dan COX-2 (Shehzad et al., 2013). Menurut Anand et al. (2007), kurkumin mempunyai ketersedian hayati yang kurang bagus. Hal ini menjadi permasalahan dalam penggunaan kurkumin secara klinis. Pembuatan senyawa turunan kurkumin secara sintetik dilakukan untuk memperbaiki sifat kurkumin tersebut. Salah satu senyawa hasil sintesis yang berhasil dibuat adalah siklovalon. Menurut Wei et al. (2012), efek penghambatan NF-κB siklovalon lebih baik dibandingkan dengan kurkumin. NF-κB berperan dalam meregulasi ekspresi siklooksigenase, lipoksigenase, sitokin, dan kemokin, serta molekul adhesi. Pada aterosklerosis, NF-κB berperan dalam meregulasi protein-protein pro-inflamasi (Dabek et al., 2010; van der Heiden et al., 2010). Berdasarkan hal tersebut, siklovalon diduga mempunyai efek anti-inflamasi lebih baik dibandingkan dengan kurkumin. Siklovalon dan kurkumin mempunyai potensi menghambat overekspresi protein-protein yang terlibat dalam reaksi inflamasi karena mempunyai aktivitas penghambatan NF-κB. Hal ini membuat siklovalon dan kurkumin berpotensi menjadi senyawa anti-inflamasi yang diharapkan dapat digunakan untuk terapi penyakit yang berkaitan dengan inflamasi, seperti aterosklerosis. Penelitian aktivitas anti-inflamasi siklovalon dan kurkumin dalam menghambat migrasi leukosit menjadi penting dan diharapkan memberikan kontribusi bagi pengobatan maupun pencegahan aterosklerosis. 3 Pada penelitian ini, efektivitas anti-inflamasi siklovalon melalui penghambatan migrasi leukosit dibandingkan dengan kurkumin. B. Perumusan Masalah 1. Apakah siklovalon dan kurkumin mempunyai aktivitas anti-inflamasi melalui penghambatan migrasi leukosit ? 2. Apakah efek anti-inflamasi melalui penghambatan migrasi leukosit siklovalon lebih baik dibandingkan dengan kurkumin ? C. Tujuan Penelitian Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui aktivitas dan efektivitas anti-inflamasi siklovalon dan kurkumin melalui penghambatan migrasi leukosit. D. Tinjauan Pustaka 1. Aterosklerosis Aterosklerosis berasal dari bahasa Yunani, yaitu: athere yang berarti bubur dan skleros yang berarti keras. Aterosklerosis adalah penyakit inflamasi yang ditandai dengan penebalan dan hilangnya permeabilitas dinding bagian dalam arteri (endotelial) yang disebabkan oleh LDL, radikal bebas akibat merokok, hipertensi, diabetes mellitus, faktor genetik, infeksi mikroorganisme, dan kombinasi faktor tersebut, serta faktor lain. Komplikasi terpenting akibat aterosklerosis, yaitu: penyakit jantung koroner, gangguan 4 pembuluh darah serebral, dan gangguan pembuluh darah perifer. Pembuluh darah yang bisa terkena aterosklerosis adalah arteri besar dan sedang, yaitu: pembuluh serebral, vertebral, koroner, renal, aorta, dan pembuluh di tungkai (Ross, 1999; Paoletti et al., 2004; Longe, 2006). Gambar 1. Peran disfungsi endotelial pada aterosklerosis (Chhabra, 2009) Tahap awal dari aterogenesis adalah disfungsi endotelial. Faktor utama penyebab disfungsi endotelial adalah radikal bebas akibat merokok, kadar LDL yang tinggi, hipertensi, diabetes mellitus, perubahan genetik, peningkatan konsentrasi plasma homosistein, infeksi mikroorganisme (virus herpes atau Chlamdia pneumonia), dan faktor lain. Disfungsi endotelial mengakibatkan peningkatan permeabilitas sel endotelial terhadap monosit dan lipoprotein (terutama LDL). Monosit dan LDL menjadi mudah melewati endotelial untuk masuk ke dalam intima. Di intima, LDL akan teroksidasi menjadi oxLDL karena kerusakan oksidatif dan tidak adanya antioksidan di dalam intima. Selain itu, disfungsi endothelial juga akan menyebabkan ketersediaan hayati NO berkurang. Hal ini akan menyebabkan diproduksinya 5 molekul adhesi (VCAM-1, ICAM-1, E-selectin, dan P-selectin) oleh endotelial. Molekul adhesi dan kemokin (MCP-1) akan memfasilitasi monosit dari peredaran darah menuju ke dalam intima (Ross, 1999; Schachninger & Zeiher, 2002; Endermann & Schiffrin, 2004; George & Johnshon, 2010). Gambar 2. Mekanisme terjadinya aterosklerosis (Kumar et al., 2005) Keterangan: IL (interleukin), HDL (High Density Lipoprotein), LDL (Low Density Lipoprotein), dan MCP-1 (Monocyte Chemo-Attractant Protein-1) Monosit akan bertransformasi menjadi makrofag yang mempunyai kemampuan memakan kolesterol, lemak-lemak, dan oxLDL. Makrofag akan mengalami perubahan morfologi menjadi sel busa yang dipenuhi partikel lemak, kolesterol, dan oxLDL. Sel busa akan memproduksi faktor pertumbuhan, ROS, dan sitokin pro-inflamasi. Sitokin dan faktor pertumbuhan berperan penting dalam migrasi dan proliferasi sel otot polos ke arah intima, 6 kemudian sel otot polos akan mendesak dinding sel endothelial. Sitokin dan ROS akan memicu inflamasi selanjutnya sehingga aterogenesis ini bisa berlangsung lama dan sinyal inflamasi yang dihasilkan menjadi semakin kuat yang mengakibatkan terbentuknya plak. Plak yang terdiri dari sel-sel otot polos, sel busa, dan sel-sel yang telah mati. Plak inilah yang menyebabkan penyempitan arteri (Lusis, 2000; Libby et al., 2002; Fan & Watanabe, 2003; Libby, 2004). Gambar 3. Plak aterosklerosis (Kumar et al., 2005) Plak aterosklerosis (ateroma atau fibrous plaque) terdiri dari lemak atau sel-sel mati ditutupi oleh lapisan fibrotic cap yang terdiri dari campuran sel otot polos dan matriks ekstraseluler. Ada dua jenis plak aterosklerosis, yaitu: plak yang stabil dan plak yang labil. Plak yang stabil biasanya terdiri dari small lipid core dan ditutupi oleh lapisan tipis fibromuscular cap dengan sel otot polos dan matriks ekstraseluler sedangkan plak yang labil seringkali terdiri dari large lipid core, thin cap, dan sel-sel inflamasi dalam jumlah besar. Plak labil mempunyai kecenderungan untuk pecah. Pecahan tersebut bisa membentuk gumpalan/endapan dengan darah dan menyumbat pembuluh darah. Penyumbatan pembuluh darah akibat pecahnya plak inilah yang menyebabkan serangan jantung dan stroke (Lusis, 2000; Libby, 2002; Fan & Watanabe, 2003; Libby, 2004). 7 Standar diagnosis aterosklerosis yang baik adalah menggunakan pipa kateter (catheterization), tetapi metode ini mahal dan mempunyai resiko tinggi. Metode diagnosis yang tidak berbahaya atau tidak invasif diperlukan untuk mendiagnosis aterosklerosis. Metode marker biokimia (CRP) dan tidak invasif lainnya (intravascular ultrasound, extravascular ultrasound, dan ultrafast computerized tomography) bisa digunakan untuk mengatasi keterbatasan diagnosis. Tes terhadap LDL, HDL, rasio LDL-HDL, dan tekanan darah sudah dilakukan sejak lama untuk mengetahui peningkatan faktor resiko dan resiko lain yang menyebabkan aterosklerosis. MRI atau CT scans bisa digunakan untuk meningkatkan kemampuan penglihatan ke dalam dinding pembuluh darah. Selain itu, metode pengukuran suhu pembuluh darah bisa digunakan dengan dasar adanya peningkatan suhu akibat reaksi inflamasi yang terjadi pada aterosklerosis (Lusis, 2000; Libby, 2004; Dipiro et al., 2008). Gambar 4. Peran NF-κB pada aterogenesis (Baker et al., 2011) Terapi farmakologi yang dapat dilakukan untuk mencegah atau mengobati aterosklerosis, yaitu: mencegah oksidasi LDL dengan menggunakan antioksidan (antioksidan mengurangi pembentukan ROS); menurunkan kadar kolesterol LDL dalam plasma darah menggunakan obat- 8 obatan golongan statin (statin menghambat enzim biosintesis kolesterol sehingga dapat menurunkan kadar LDL); menghambat ekspresi molekul adhesi dan sitokin menggunakan ACE inhibitors (ekspresi angiotensin II berkaitan dengan ekspresi sitokin); menghambat adhesi, aktivasi, dan agregasi platelet menggunakan aspirin (antiplatelet mencegah terbentuknya trombus); menghambat leukosit menuju pusat inflamasi dengan COX inhibitors (ekspresi COX-2 dapat menginduksi produksi sitokin); dan mengurangi aktifitas NF-κB (NF-κB merupakan regulator yang mengatur produksi sitokin, kemokin, dan molekul adhesi) (Greaves & Channon, 2002; Schachinger & Zeiher, 2002; Paoletti et al., 2004; Riccioni & Sblendorio, 2012). 2. Inflamasi Inflamasi adalah mekanisme pertahanan tubuh nonspesifik untuk menginaktivasi atau merusak organisme yang menyerang, menghilangkan zat iritan, dan mengatur derajat perbaikan jaringan. Inflamasi disebabkan oleh rusaknya jaringan akibat trauma fisik, zat kimia yang merusak, dan zat mikrobiologik. Inflamasi dikarakteristik oleh lima tanda, yaitu: panas, kemerahan, pembengkakan, sakit, dan hilangnya fungsi (Lawrence et al., 2002; Libby, 2003; Tortora & Derrickson, 2012). Menurut Guyton & Hall (2011), inflamasi ditandai dengan (1) vasodilatasi pembuluh darah lokal, (2) kenaikan permeabilitas kapiler yang mengakibatkan kebocoran cairan dalam ruang interstisial, (3) pembekuan cairan dalam ruang interstisial yang disebabkan oleh fibrinogen dan protein 9 lainnya dalam jumlah berlebihan yang berasal dari kapiler yang bocor, (4) migrasi sejumlah besar granulosit dan monosit menuju jaringan, dan (5) pembengkakan jaringan. Gambar 5. Ilustrasi lima tanda inflamasi (Lawrence et al., 2002) Inflamasi disebabkan oleh beberapa faktor, yaitu: mikroba patogen (bakteri, virus, protozoa, dan jamur), luka, gangguan pada sel, serangan fisik (panas, dingin, luka, dan radiasi ultraviolet), agen kimia (toksin mikroba, racun, asam, dan basa), dan antigen yang distimulasi oleh respon imunologi (Waugh & Grant, 2001; Tortora & Derrickson, 2012). Inflamasi dibagi menjadi dua, yaitu: inflamasi akut dan inflamasi kronik. Inflamasi akut terjadi dalam jangka waktu singkat (jam sampai hari) setelah infeksi atau kerusakan. Inflamasi akut ditandai dengan aktivasi sel endotelial, pengerahan leukosit, dan interaksi sel endotelial dengan leukosit yang mengakibatkan bermigrasinya leukosit melintasi sel endotelial. Inflamasi kronik terjadi dalam jangka waktu lama (minggu sampai tahun) setelah infeksi atau kerusakan. Inflamasi kronik terjadi akibat kegagalan resolusi inflamasi 10 akut untuk menghilangkan faktor penyebab inflamasi. Kegagalan ini akan mengakibatkan kerusakan jaringan yang lebih parah (Lawrence & Gilroy, 2006; Serhan et al., 2010). Gambar 6. Inflamasi akut dan kronik (Buckley et al., 2014) Keterangan: COX (cyclooxygenase), IL (interleukin), LT (leukotriene), LX (lipoxins), MCP-1 (Monocyte Chemo-Attractant Protein-1), PG (prostaglandin), PMN (polymorphonuclear leukocytes), PPARɣ (Peroxisome Proliferator Activated Receptor ɣ), dan TGF (Transforming Growt Factor) Inflamasi akut diawali oleh sel endotelial, sel mast, jaringan yang rusak, dan makrofag lokal memproduksi mediator inflamasi (sitokin, kemokin, histamin, bradikinin, prostaglandin, dan leukotrien) sebagai respon terhadap infeksi atau kerusakan. Hal ini menyebabkan leukosit (neutrofil) bermigrasi 11 dari sumsum tulang untuk menuju lokasi infeksi atau kerusakan dan melintasi sel endotelial. Neutrofil merupakan leukosit pertama yang sampai pada lokasi kerusakan. Neutrofil akan memproduksi ROS yang dapat membunuh bakteri. Neutrofil akan memakan bakteri yang telah mati dan mengalami apoptosis. Proses ini berlangsung sampai faktor penyebab inflamasi hilang. Setelah itu, neutrofil yang telah mati akan dimakan oleh makrofag lokal. Inflamasi akan diakhiri dengan cara produksi TGF-β, lipoksin, dan siklopentanon prostaglandin. Proses tersebut disebut dengan resolusi inflamasi yang bertujuan untuk memperbaiki jaringan yang rusak dan mencegah terjadinya inflamasi kronik (Medzhitov, 2008; Guyton & Hall, 2011; Buckley et al., 2014). 3. Obat anti-inflamasi Kegagalan resolusi inflamasi akut akan menyebabkan terjadinya inflamasi yang tidak terkendali (inflamasi kronik). Inflamasi yang tidak terkendali ini dapat menyebabkan berbagai macam penyakit. Obat antiinflamasi dibuat untuk menghentikan inflamasi yang tak terkendali. Obat antiinflamasi bekerja dengan menghambat metabolisme asam arakidonat. Obat anti-inflamasi dibagi menjadi dua golongan, yaitu: golongan steroid dan golongan nonsteroid (Kumar et al., 2005; Serhan et al., 2010). Obat anti-inflamasi golongan steroid (glukokortikoid/kortikosteroid). Obat golongan ini digunakan secara luas untuk terapi berbagai penyakit inflamasi dan penyakit sistem imun. Mekanisme umum efek anti-inflamasi 12 dari obat golongan ini adalah dengan menghambat kerja enzim fosfolipase. Obat golongan ini diantaranya: betametason, deksametason, fludrokortison, hidrokortison, kortison, metilprednisolon, prednisolon, prednison, dan triamsinolon. Obat golongan ini diformulasikan dalam bentuk sedian oral, topikal (salap dan krim), inhalasi (oral dan nasal), rektal, dan tetes (telinga dan mata) (Longe, 2006; Offermanns & Rosenthal, 2008; Sweetman, 2009; Katzung et al., 2011; Martini & Nath, 2012). Gambar 7. Mekanisme kerja obat anti-inflamasi golongan steroid dan nonsteroid (Kumar et al., 2005) Obat anti-inflamasi golongan nonsteroid mengurangi rasa sakit, kekakuan, pembengkakan, dan inflamasi, tetapi tidak menyembuhkan penyakit yang menyebabkan masalah tersebut. Obat golongan ini diantaranya: asam mefenamat, diklofenac, etodolac, flurbiprofen, ibuprofen, indometasin, 13 kalium diklofenak, ketoprofen, ketorolac, mekrofenamat, meloksikam, nabumeton, natrium diklofenak, naproksen, oksaprozin, piroksikam, dan sulindak. Obat golongan ini bekerja dengan menghambat kerja enzim siklooksigenase. Obat golongan ini tersedia dalam bentuk tablet, kapsul, atau kaplet (Lullman et al., 2005; Longe, 2006; Offermanns & Rosenthal, 2008; Sweetman, 2009; Katzung et al., 2011). Tanaman obat sudah lama digunakan sebagai obat untuk mengatasi berbagai penyakit. Tanaman obat telah digunakan sebagai sumber penting sebagai bahan baku pengambangan obat. Tanaman obat mengandung senyawa metabolit sekunder (fitokimia) yang diketahui mempunyai aktivitas antiinflamasi. Mekanisme aktivitas anti-inflamasi dari senyawa fitokimia, yaitu: 1) antioksidan dan penangkap radikal bebas; 2) modulasi aktivitas seluler dari sel-sel pro-inflamasi (sel mast, makrofag, limfosit, dan neutrofil); 3) modulasi aktivitas enzim pro-inflamasi (enzim fosfolipase A2, siklooksigenase, lipoksigenase, dan NOS); 4) modulasi sitokin pro-inflamasi, kemokin, dan molekul adhesi; dan 5) menghambat aktivitas NF-κB (Calixto et al., 2003a; Calixto et al., 2003b; Bellik et al., 2012). 4. Migrasi leukosit Leukosit atau sel darah putih merupakan sistem pertahanan tubuh dari serangan benda asing atau patogen dan membuang zat sisa (racun, kotoran, dan sel yang rusak/abnormal). Dalam keadaan normal manusia dewasa, leukosit berjumlah 4.000-11.000 sel/µL darah. Leukosit diidentifikasi secara 14 mikroskopi dengan pewarna darah menggunakan standar zat warna Wright atau zat warna Giemsa. Pengecatan menggunakan zat warna Giemsa membagi leukosit ke dalam dua jenis berdasarkan ada tidaknya granular, yaitu: granulosit (neutrofil, eosinofil, dan basofil) dan agranulosit (monosit dan limfosit) (Kelly, 2004; Guyton & Hall, 2011; Martini & Nath, 2012). Gambar 8. Jenis-jenis leukosit (Martini & Nath, 2012) Waktu hidup leukosit sangat singkat. Leukosit mampu bermigrasi dari organ ke organ lain secara cepat menuju lokasi infeksi atau luka. Leukosit mempunyai 4 karakteristik, yaitu: (1) mampu bermigrasi melalui aliran darah; (2) mempunyai gerak amoeboid; (3) bereaksi terhadap rangsangan kimia; dan (4) neutrofil, eosinofil, dan monosit bersifat fagositosis/menelan (Martini & Nath, 2012). Neutrofil mempunyai fungsi utama untuk melindungi dari serangan benda asing yang masuk ke dalam tubuh (umumnya bakteri). Neutrofil sangat cepat bergerak dan umumnya pertama kali sampai di lokasi luka. Eosinofil menyerang zat yang berikatan dengan antibodi. Eosinofil akan bertambah banyak pada reaksi alergi. Eosinofil juga bergerak menuju lokasi luka dimana terjadi pelepasan enzim untuk mengurangi inflamasi. Basofil berpindah menuju lokasi luka dan melintasi dinding bagian dalam kapiler untuk 15 berkumpul di jaringan yang rusak. Basofil akan merangsang terjadinya reaksi inflamasi lokal. Monosit mampu berpindah melalui aliran darah selama 24 jam sebelum memasuki jaringan perifer untuk menjadi makrofag. Makrofag merupakan bentuk agresif dari fagositosis. Limfosit berperan dalam reaksi imunologis (Waugh & Grant, 2001; Martini & Nath, 2012). Migrasi leukosit menuju lokasi luka atau inflamasi merupakan tahapan penting pada inflamasi. Proses migrasi leukosit terdiri dari dua tahap, yaitu: 1) tahap pengerahan leukosit dari sumsum tulang dan 2) tahap adhesi leukosit melintasi sel endotelial. Gambar 9. Proses pengerahan leukosit oleh makrofag (Guyton & Hall, 2011) Keterangan: TNF (Tumor Necrosis Factor), IL-1 (interleukin-1), GM-CSF (GranulocyteMonocyte-Colony-Stimulating Factor), G-CSF (Granulocyte Colony-Stimulating Factor), dan M-CSF (Monocyte Colony-Stimulating Factor) Tahap pengerahan leukosit dimulai beberapa menit setelah terjadi inflamasi. Makrofag lokal akan teraktivasi akibat inflamasi dan memproduksi 16 berbagai macam sitokin (TNF-α dan IL-1). Sitokin akan memasuki pembuluh darah untuk menuju sumsum tulang. Sitokin akan memacu pengerahan leukosit dalam jumlah besar menuju lokasi inflamasi untuk menghilangkan faktor penyebab inflamasi. Leukosit akan menuju lokasi inflamasi karena adanya rangsangan kimia (kemotaksis) (Guyton & Hall, 2011). Gambar 10. Proses adhesi leukosit melintasi sel endotelial (Ley et al., 2007) Keterangan: ESAM (endotelial cell-selective adhesion molecule), ICAM1 (intracellular adhesion molecule 1), JAM (junctional adhesion molecule), LFA1 (lymphocyte functionassociated antigen 1), MAC1 (macrophage antigen 1), MADCAM1 (mucosal vascular adhesion cell-adhesion molecule), PSGL1 (P-selectin glycoprotein ligand 1), PECAM1 (platelet/endotelial-cell adhesion molecule 1), PI3K (phosphoinositide 3-kinase), VCAM1 (vascular cell-adhesion molecule 1), dan VLA4 (very late antigen 4) Tahap adhesi leukosit melintasi sel endotelial diawali oleh aktivasi sel endotelial oleh sitokin. Sel endotelial akan memproduksi molekul adhesi yang berperan dalam migrasi leukosit melintasi sel endotelial. Molekul adhesi (Eselectin, P-selectin, VCAM-1, dan ICAM-1) akan memediasi ikatan antara leukosit dengan permukaan endothelial. Selain itu, sitokin juga akan meningkatkan afinitas integrin. Leukosit akan menempel pada sel endotelial akibat adanya selectin (E-selectin dan P-selectin). Leukosit akan berputar akibat adanya aliran darah. Integrin (VLA-4, LFA-1, dan Mac-1) akan 17 berikatan dengan VCAM-1 dan ICAM-1 yang akan memperlambat berputarnya leukosit sampai akhirnya berhenti berputar. Setelah itu, leukosit akan memanjang dan memipih terhadap endotelial. Tahapan ini akan memperkuat proses adhesi leukosit. Leukosit akan bergerak perlahan sampai akhirnya melintasi endothelial. Leukosit akan melintasi endotelial melalui dua cara, yaitu: cara paracelluar (leukosit bermigrasi melalui celah antara sel endotelial) dan transcelullar (leukosit bermigrasi melalui badan sel endotelial) (Prescott et al., 2002; Yadav et al., 2003; Ley et al., 2007; Serhan et al., 2010). Migrasi leukosit dari aliran pembuluh darah sebagai respon terhadap inflamasi berhubungan erat dengan berbagai penyakit, seperti: aterosklerosis, arthritis, asma, dan psorias. Pengembangan obat anti-inflamasi melalui penghambatan migrasi leukosit merupakan terapi baru yang dapat digunakan untuk mengatasi penyakit inflamasi. Penghambatan migrasi leukosit dapat melalui beberapa mekanisme, yaitu: menggunakan antagonis selectin dan integrin (selectin dan integrin bertanggung jawab dalam proses bermigrasinya leukosit), menggunakan heparin (heparin mempunyai aktivitas non- antikoagulasi dengan menghambat adhesi dan aktivasi leukosit; dan mencegah kerusakan endotelial dari molekul perusak, seperti: kemokin, bradikin, histamin, dan oksigen radikal), dan menggunakan antagonis NF-κB (NF-κB meregulasi protein-protein pro-inflamasi) (Guo, 2001; Worthylake & Burridge, 2001; Mackay, 2008). 18 5. Kurkumin Kurkumin [1,7-bis(4-hidroksi-3-metoksifenil)-1,6-heptadiena-3,5- dion] adalah pigmen warna kuning yang diisolasi dari rimpang kunyit (Curcuma longa L.) yang secara tradisional digunakan sebagai pewarna makanan, rempah-rempah, dan pengobatan tradisional. Kurkumin mempunyai banyak aktivitas biologis, seperti: antioksidan, antikanker, anti-inflamasi, antihepatoksik, hipotensif, dan hipokolesterol. Kurkumin diidentifikasi pertama kali oleh Lampe dan Milobedzka pada tahun 1910. Kurkumin mempunyai berat molekur 368,38 dan titik lebur 179-183°C, serta rumus kimia C21H20O6. Kurkumin mempunyai kelarutan dan ketersedian hayati yang kurang bagus, tetapi cukup stabil pada pH asam dari lambung (Itokawa et al., 2008; Sikora et al., 2010; Basnet & Skalko-Basnet, 2011; Bayomi et al., 2013; Shehzad et al., 2013). Menurut Anand et al. (2007), alasan ketersedian hayati kurkumin yang kurang bagus adalah aktivitas intrinsik yang rendah, absorbsi yang kurang bagus, kecepatan metabolisme yang cepat, produk metabolit yang tidak aktif, dan cepat dieliminasi dari tubuh. Gambar 11. Struktur senyawa kurkumin (Wei et al., 2012) Kurkumin mempunyai kemampuan mengobati berbagai penyakit, seperti: kegemukan, diabetes, kardiovaskular, penyakit neugeneratif, cerebral edema, alergi, bronchial astma, inflammatory bowel disease, rheumatoid 19 arthritis, renal ischemia, psoriasis, scleroderma, acquired immunodeficiency syndrome, dan berbagai jenis kanker (Shehzad et al., 2013). Pada inflamasi, kurkumin menghambat siklooksigenase, lipoksigenase, iNOS, dan menghambat sitokin pro-inflamasi (TNF-α, IL-1, -2, -6, -8, -12, MCP-1). Kurkumin menghambat aktivitas faktor transkripsi NF-κB. NF-κB merupakan regulator utama proses inflamasi yang mengatur ekspresi proteinprotein pro-inflamasi (Chainani-Wu, 2003; Duvoix et al., 2004; Itokawa et al., 2008; Shehzad et al., 2013). 6. Siklovalon Siklovalon [2,6-bis(4-hidroksi-3-metoksibenzilidin)sikloheksanon] merupakan sikloheksanon yang menghubungkan dua cincin fenil. Siklovalon mempunyai aktivitas anti-inflamasi dengan menghambat enzim siklooksigenase. Siklovalon mempunyai rumus kimia C22H22O5, titik lebur 178-179°C, dan membutuhkan waktu reaksi sintesis selama 2 hari (Sardjiman et al., 1997; Nurrochmad et al., 1998; Itokawa et al., 2008; Liang et al., 2008). Penelitian Bayomi et al. (2012) menunjukkan siklovalon mempunyai aktivitas antioksidan, antihemolisis, dan antitumor. Gambar 12. Struktur senyawa siklovalon (Wei et al., 2012) Siklovalon disintesis dengan cara mengkondensasi vanillin dengan sikloheksanon dalam suasana asam. Campuran vanillin dan sikloheksanon 20 diaduk pada suhu kamar hingga vanillin terlarut. Setelah itu, HCl pekat diteteskan sambil diaduk-aduk sampai campuran tersebut memadat. Padatan yang diperoleh kemudian dimaserasi dengan menggunakan campuran asam asetat-air (1:1) dan dilanjutkan dengan direkristalisasi. Metode ini akan menghasilkan rendemen sebesar 40% (Hayun, 1995; Sardjiman et al., 1997; Sardjiman, 2000). 7. Mekanisme induksi inflamasi oleh thioglycollate broth Thioglycollate broth merupakan media mikrobiologi yang digunakan untuk pertumbuhan bakteri anaerob. Thioglycollate broth terdiri dari yeast extract, casein peptone, dextrose, sodium thioglycollate, L-cystine, dan resazurin. Sodium thioglycollate dan L-cystine akan mereduksi oksigen menjadi ROS (H2O2, O2•-, dan OH•) (Carlsson et al., 1978; Prescott et al., 2002; Leboffe & Pierce, 2011). Menurut Prescott et al. (2002), oksigen akan tereduksi melalui reaksi berikut ini: O2 + e- O2•O2•- + e- + 2H+ H202 H202 + e- + H+ H20 + 0H• Radikal superoksida (O2•-) lebih reaktif dibandingkan dengan H2O2 dan OH•. Radikal superoksida akan berikatan dengan NO menjadi bentuk ONOO-. Peroksinitrit (ONOO-) mudah berpenetrasi ke dalam sel yang dapat menyebabkan modifikasi oksidatif makromolekul, terutama lemak, DNA, dan protein. Radikal superoksida akan mengoksidasi BH4 (kofaktor yang 21 dibutuhkan untuk memproduksi NO) menjadi BH2. Menurut Dauphinee & Karsan (2010), NO diproduksi melalui reaksi berikut ini: L-arginina + O2 → L-sitrulina + NO Reaksi tersebut dikatalisis oleh enzim eNOS. Produksi NO dapat berkurang karena dua hal, yaitu: berkurangnya L-arginina dan BH4. Berkurangnya BH4 mengakibatkan tidak diproduksi NO. Hal ini mengakibatkan ketersediaan hayati NO berkurang dan diproduksinya molekul adhesi oleh endotelial (Endemann & Schiffrin, 2004; Chhabra, 2009; Dauphinee & Karsan, 2010; Assar et al., 2013). Gambar 13. Fungsi NO (Kumar et al., 2005) 8. Haemocytometer Haemocytometer adalah kaca tebal dengan bagian tengah terdiri dari grid yang didesain sebagai kamar hitung. Setiap kamar hitung mempunyai ukuran 3 x 3 mm. Grid pada umumnya terdiri dari 9 kotak besar berukuran 1 x 1 mm yang mampu menampung volume sebanyak 0,1 mm3. Setiap kotak 22 besar dibagi menjadi 16 kotak kecil dan 16 kotak kecil dari kotak besar dibagian tengah dibagi menjadi 16 kotak yang berukuran lebih kecil (Sharpe, 1988; Bonifacino et al., 2010). Menurut Sharpe (1988), keuntungan menghitung sel dengan menggunakan haemocytometer adalah sederhana, langsung, dan murah sedangkan kerugiannya adalah sulit, memakan waktu untuk mengencerkan suspensi sel, dan kesalahan pengenceran yang berakibat pada kesalahan mengalikan pada perhitungan akhir jumlah sel. Gambar 14. Haemocytometer grid tipe Neubauer Improved (Sharpe, 1988) Perhitungan akurat jumlah sel (sel/mL) akan diperoleh dengan menghitung sel yang berada di 4 kotak besar yang berada di sudut (kotak nomor 1, 2, 3, dan 4 pada Gambar 14). Hasil perhitungan sel yang diperoleh kemudian dihitung nilai rata-rata dan mengalikannya dengan faktor koreksi dari haemocytometer, yaitu: 104 (Sharpe, 1988; Bonifacino et al., 2010). 23 Menurut Bonifacino et al. (2010), jumlah sel per mL dihitung dengan menggunakan rumus berikut ini: Sel/mL = rata-rata hitung 4 sudut grid x faktor pengenceran x 104 Total sel = sel/mL x volume suspensi sel yang diambil dari sampel E. LANDASAN TEORI Inflamasi merupakan mekanisme pertahanan tubuh nonspesifik untuk menginaktivasi atau merusak organisme yang menyerang, menghilangkan zat iritan, dan mengatur derajat perbaikan jaringan. Inflamasi ditandai oleh lima tanda, yaitu: kemerahan, panas, sakit, pembengkakan, dan hilangnya fungsi (Lawrence et al., 2002; Tortora & Derickson, 2012). Salah satu penyakit yang terkait dengan inflamasi adalah aterosklerosis. Aterosklerosis merupakan penyakit inflamasi yang diawali dengan disfungsi endotelial yang menyebabkan bermigrasinya leukosit melintasi endotelial (Lusis, 2000; Libby, 2002; Libby et al., 2002). Oleh karena itu, penghambatan migrasi leukosit bisa dijadikan salah satu terapi untuk pencegahan atau pengobatan aterosklerosis. Siklovalon dan kurkumin mempunyai aktivitas terhadap NF-κB (Sikora et al., 2010; Wei et al., 2012). NF-κB meregulasi ekspresi dari siklooksigenase, lipoksigenase, sitokin, dan kemokin, serta molekul adhesi yang terlibat dalam migrasi leukosit (Dabek et al., 2010; van der Heiden et al., 2010). Menurut Wei et al. (2012), efek penghambatan NF-κB siklovalon lebih baik dibandingkan dengan kurkumin. Oleh karena itu, siklovalon dan 24 kurkumin mempunyai potensi penghambatan migrasi leukosit karena mampu menghabat aktivitas NF-κB. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas dan efektivitas anti-inflamasi siklovalon dan kurkumin melalui penghambatan migrasi leukosit. F. HIPOTESIS 1. Siklovalon dan kurkumin mempunyai aktivitas anti-inflamasi melalui penghambatan migrasi leukosit. 2. Efek anti-inflamasi melalui penghambatan migrasi leukosit siklovalon lebih baik dibandingkan dengan kurkumin.