OPTIMASI METODE ISOLASI RNA DARI JARINGAN KANKER

OPTIMASI METODE ISOLASI RNA
DARI JARINGAN KANKER PAYUDARA FIKSASI FORMALIN DENGAN
NUCLEOSPIN® RNA II KIT MACHEREY-NAGEL
Lulus Putri Aninda, Dwi Listyorini, Nuning Wulandari
Universitas Negeri Malang
E-mail: [email protected]
ABSTRACT : Breast cancer is a serious public health problem, therefore an identification
of genetic factors which plays role in cancer development needed to thoroughly as an effort
how to prevent the disease. Research based on RNA from formalin-fixed tissue is an
important for clinic and molecular analysis. Fixation method and extraction on its sample
generally can obstruct nucleic acid acquisition from sample. This research was conducted to
optimize the method RNA extraction from breast cancer formalin-fixed tissue to obtain the
pure and high quantity of total RNA.
The result shown RNA extraction yield using modified protocol NucleoSpin® RNA II
Macherey-Nagel kit were have higher total RNA quantify than original protocol.
Modification was conducted at buffer usage to wash formalin-fixed tissue, crushing the
tissue, cell lysis stage and RNA binding condition adjustment. The next optimization is
needed to avoid contamination.
Keywords: RNA, breast cancer, formalin-fixed, kit, Macherey-Nagel
ABSTRAK: Kanker payudara merupakan masalah kesehatan publik yang serius, oleh
karena itu identifikasi faktor genetik yang berperan dalam perkembangan kanker perlu
dilakukan sebagai upaya untuk menemukan cara pencegahannya. Penelitian berbasis RNA
penting untuk analisis klinik maupun molekuler. Metode fiksasi dan ekstraksi yang
dilakukan pada sampel tersebut secara umum dapat menghambat perolehan asam nukleat
dari sampel. Penelitian ini bertujuan untuk mengoptimalkan metode isolasi RNA dari
jaringan kanker payudara fiksasi formalin untuk mendapatkan RNA total dengan kuantitas
tinggi dan murni.
Hasil isolasi RNA menggunakan protokol modifikasi NucleoSpin® RNA II Kit MachereyNagel menunjukkan RNA total dengan kuantitas yang lebih tinggi dibandingkan
menggunakan protokol asli. Modifikasi dilakukan pada penggunaan bufer untuk mencuci
jaringan fiksasi formalin, penghancuran jaringan, lisis sel dan pengkondisian pengikatan
RNA. Optimasi selanjutnya diperlukan untuk menghindari adanya kontaminasi.
Kata Kunci: RNA, kanker payudara, fiksasi formalin, kit, Macherey-Nagel
PENDAHULUAN
Kanker payudara merupakan masalah kesehatan publik yang serius, oleh karena itu
identifikasi faktor genetik yang berperan dalam perkembangan kanker perlu dilakukan
sebagai upaya untuk menemukan cara pencegahannya (Martin & Weber, 2000). Sebagian
besar penelitian molekuler kanker payudara memiliki fokus hanya pada satu atau dua
informasi dasar yang tinggi, kebanyakan adalah profiling ekspresi mRNA atau analisis
cDNA, dan yang baru-baru ini adalah sekuensing secara besar-besaran (The Cancer Genome
Atlas Network, 2012). Penanda tumor seperti ekspresi RNA (Penland et al., 2007), mutasi
genetik, perubahan epigenetik, dan produk ekspresi gen yang tidak normal, merupakan studi
yang bermanfaat untuk mendeteksi dan mendiagnosis kanker (Huang et al., 2010).
RNA terlibat dalam banyak proses seluler (Mattiesen et al., 2009), namun penelitian
pada RNA jarang dilakukan (Baelde et al., 2001). Penanganan dan pemrosesan kuantitas dan
1
kualitas RNA penting dalam perkembangan uji klinik yang didasarkan pada analisis RNA
(Chung et al., 2008). RNA yang diambil dari jaringan tumor dapat digunakan untuk
mengukur transkripsi dan pola ekspresi gen (Chung et al., 2008; Farragher et al., 2008).
RNA dapat diisolasi dari jaringan segar (Bohmann et al., 2009) maupun jaringan yang
telah diawetkan (Jewell et al., 2002). RNA dengan kualitas yang tinggi didapatkan dari bahan
segar beku, namun bahan ini tidak secara rutin bisa didapatkan di rumah sakit, selain itu
hanya sedikit yang bisa mengadakan pengkoleksian, pemrosesan, dan penyimpanan jaringan
segar beku (Bohmann et al., 2009). Masalah utama pada dasarnya adalah terbatasnya
ketersediaan sampel jaringan segar (Chung et al., 2008).
Di sisi lain, berbeda dengan jaringan yang difiksasi formalin dan diblok dengan
parafin (FFPE: Formalin-Fixed Paraffin-Embedded) yaitu metode yang umum digunakan
untuk menyimpan jaringan (Farragher et al., 2008). Sampel ini secara rutin disimpan oleh
hampir setiap rumah sakit (Abramovitz et al., 2008; Mizuni et al., 1998) karena merupakan
spesimen patologis yang digunakan untuk kepentingan evaluasi (Coombs et al., 1999),
penentuan penyakit, prediksi respon hasil perlakuan (Glenn et al., 2007), dan diagnosis klinik
maupun molekuler (Mizuno et al., 1998).
Fiksasi adalah serangkaian proses kimia kompleks yang memodifikasi makromolekul
pada jaringan dan sel, untuk menjaga morfologi jaringan (Mizuno et al., 1998) dan fungsi
komponen seperti pada fase hidup dengan menghambat bakteri dan pembusukan (Lykidis et
al., 2007). Formalin telah digunakan sebagai fiksatif dalam patologi selama lebih dari seratus
tahun (Shi et al., 2002). Fiksasi formalin menyebabkan penambahan monometilol pada basa
RNA (Chung et al., 2008; Farragher et al., 2008) dan lintas hubungan antara asam nukleat
dengan protein (Antonov et al., 2005; Masuda et al.,1999; Werner et al., 2000).
Sampel jaringan tumor FFPE merupakan sumber analisis RNA dan molekuler genetik
yang sangat berharga, tetapi ketinggian ekstraksi kualitas asam nukleatnya masih diragukan
(Coombs et al., 1999) hal ini karena adanya perubahan kimia dan degradasi berlanjut yang
terus terjadi (Ribeiro-Silva et al., 2007), mengingat RNA sangat labil (Werner et al., 2000).
Bagaimanapun juga, degradasi RNA dapat terjadi pada jaringan sebelum fiksasi, di mana
penanganan jaringan oleh kebanyakan rumah sakit tidak dilakukan sesegera dan setepat
mungkin. (Farragher et al., 2008).
METODE
Penelitian dilakukan di Laboratorium Kultur Jaringan Hewan Jurusan Biologi dan
Bioteknologi Laboratorium Sentral, Universitas Negeri Malang pada bulan Maret hingga
bulan Mei 2014. Penelitian ini telah dinyatakan laik etik oleh komisi etik penelitian kesehatan
Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya berdasarkan nomor 152/EC/KEPK-S1/03/2014.
Membuat Larutan Pencuci Jaringan Kanker Fiksasi Formalin
Larutan pencuci dalam penelitian ini adalah menggunakan DEPC-water. Penggunaan
DEPC-water sebagai media pencuci jaringan adalah untuk melindungi RNA dari RNase yang
dapat menghancurkan RNA dalam jaringan tersebut. Konsentrasi DEPC yang digunakan
adalah 0,01%.
Pengambilan dan Pencucian Sampel
Sampel fiksasi formalin jaringan kanker payudara diperoleh dari rumah sakit Saiful
Anwar Malang bagian patologi anatomi. Sampel kemudian diisolasi dengan protokol yang
berbeda.
2
Sampel dibawa ke laboratorium menggunakan box es, kemudian dicuci dengan
menggunakan DEPC-water. Pencucian dilakukan sampai aroma formalin pada jaringan tidak
ada. Pencucian dilakukan dengan mengocok di mesin shaker selama 30-60 menit. Jaringan
kanker yang sudah dicuci dipisahkan dari lemak yang menempel dan dipotong kecil-kecil
untuk selanjutnya sampel disimpan dalam tabung sentrifus yang berisi alkohol absolut.
Sampel diberi label identifikasi, yang berisi nama dan waktu pengambilan sampel.
Isolasi RNA
Total RNA diisolasi menggunakan dua protokol berbeda, yaitu protokol asli
NucleoSpin® RNA II kit Macherey-Nagel dan protokol modifikasi NucleoSpin® RNA II kit
Macherey-Nagel. Masing-masing protokol diulang tiga kali.
Menggunakan Protokol Asli NucleoSpin® RNA II kit Macherey-Nagel
Protokol asli yang digunakan untuk mengisolasi RNA adalah protokol yang sesuai
dengan protokol NucleoSpin® RNA II kit Macherey-Nagel. (1) Melisiskan 30 mg sampel
menggunakan penambahan nitrogen cair untuk mempermudah menghancurkan jaringan,
kemudian dilisiskan dengan menambahkan 350 µl Buffer RA1 dan 3.5 µl B-mercaptoetanol.
(2) Menyaring lisat dengan cara memindahkannya ke NucleoSpin® Filter (violet ring)
kemudian mensentrifugasi pada 11.000x g selama 1 menit. (3) Mengatur kondisi pengikatan
RNA dengan menambahkan 350 µl etanol 70%. (4) Pengikatan RNA dilakukan dengan
memindahkan lisat ke NucleoSpin® RNA II Column (light and blue ring) dan memipet lisat
ke atas dan ke bawah 2-3 kali kemudian mensentrifugasi pada 11.000x g selama 30 detik,
selanjutnya memindahkan NucleoSpin® RNA II Column (light and blue ring) pada sebuah
Collection Tube 2 ml baru.
(5) Mengurangi kandungan garam membran silika dengan menambahkan 350 µl
Membrane Desalting Buffer (MDB) dan mensentrifugasi pada 11.000x g selama 1 menit. (6)
Menghancurkan DNA dengan memasukkan DNase reaction mixture (mengencerkan 10 µl
rDNase dan 90 µl Reaction Buffer) ke bagian tengah membran silika pada NucleoSpin®
RNA II Column (light and blue ring), kemudian menginkubasi selama 15 menit pada suhu
ruang. Setelah 15 menit, melakukan (7) pencucian dan pengeringan membran silika dengan
menambahkan 200 µl Buffer RA2, 600 µl dan 250 µl Buffer RA3 secara bertahap.
Berikutnya, RNA yang diperoleh ditambahkan 60 µl RNase–free H2O sebagai Buffer Elution
(BE) dan mensentrifugasi pada 11000x g selama 1 menit. Tube yang berisi larutan RNA
ditutup rapat dan diberi parafilm untuk kemudian disimpan pada suhu ˗20oC atau ˗70oC.
Menggunakan Protokol Modifikasi NucleoSpin® RNA II kit Macherey-Nagel
Modifikasi protokol NucleoSpin® RNA II kit Macherey-Nagel dilakukan pada tahap
lisis yaitu pada 500 µl buffer RA1 dan tahap pengkondisian pengikatan RNA yaitu pada
penambahan etanol sebanyak 500 µl.
Pengukuran Kuantitas RNA yang Diperoleh
Pengukuran jumlah RNA secara kuntitatif dilakukan dengan menggunakan mesin
NanoDrop Spectrophotometer (ND-2000) pada panjang gelombang Å260/ Å280 nm.
Kalibrasi dilakukan dengan bufer RNase–free H2O.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Sampel jaringan kanker terfiksasi formalin diisolasi menggunakan dua protokol
berbeda. Protokol pertama menggunakan protokol asli NucleoSpin® RNA II kit Macherey-
3
Nagel, dan yang kedua adalah protokol modifikasi dari kit tersebut. Hasil isolasi RNA dari
keempat protokol dapat dilihat pada Tabel 1.
Tabel 1. Data Hasil Isolasi RNA Sampel Jaringan Kanker Payudara Terfiksasi
Formalin
Protokol
Asli NucleoSpin® RNA II
kit Machery-Nagel
Modifikasi NucleoSpin®
RNA II kit Machery-Nagel
1
Konsentrasi RNA
(ng/ µl)
9,3
2
6,2
1,13
3
9,3
1,34
1
92,8
2,12
2
60,4
2,37
3
34,8
2,15
Ulangan
A260/A280
1,66
Jenis Kontaminasi
Protein
Protein
Protein
Murni
DNA/reagen/
degradasi RNA
Murni
Sampel jaringan kanker payudara yang digunakan bukan jaringan segar karena
mengikuti kode etik yang berlaku. Jaringan yang digunakan dalam penelitian ini berasal dari
stok hasil biopsi pasien di rumah sakit yang sudah tidak digunakan dan sudah difiksasi
dengan formalin. Penghancuran sampel bukan di dalam tube melainkan dilakukan di mortarpistil dengan bantuan penambahan nitrogen cair untuk membekukan jaringan sehingga
mudah dihancurkan. Hal ini dilakukan untuk mempermudah menghancurkan jaringan,
mengingat tekstur jaringan kanker fiksasi formalin yang sangat liat. Tekstur jaringan tersebut
dapat hancur setelah penambahan nitrogen cair sampai beberapa kali.
Isolasi RNA total dari jaringan yang difiksasi dengan formalin menunjukkan bahwa
semakin lama sampel disimpan maka konsentrasi RNA total yang didapatkan juga semakin
berkurang. Hal ini karena dipengaruhi oleh adanya degradasi berkelanjutan (Ribeiro-Silva et
al., 2007) yang terjadi selama proses fiksasi formalin (Werner et al., 2000).
Hasil isolasi RNA total menggunakan protokol asli NucleoSpin® RNA II kit
Macherey-Nagel menunjukkan konsentrasi RNA total dengan kuantitas yang rendah dan
pembacaan rasio Å260/ Å280 di bawah 1,6, hal ini mengindikasikan bahwa isolat
terkontaminasi protein (Okamoto & Okabe, 2000). Rendahnya kuantitas dan adanya
kontaminasi protein ini dapat disebabkan karena adanya degradasi sebelum fiksasi formalin
(Ribeiro-Silva et al., 2007), yaitu ketika penanganan jaringan setelah proses biopsi, di mana
setelah proses tersebut jaringan dibiarkan hingga waktu tertentu tanpa diberi penanganan
khusus, seperti misalnya dicuci langsung menggunakan DEPC-water atau dimasukkan ke
dalam wadah tertentu.
Proses fiksasi formalin yang dilakukan dalam rangka penyimpanan dan pengarsipan
jaringan tersebut (Farragher et al., 2008) juga menjadi penyebab rendahnya konsentrasi dan
adanya kontaminasi. Pemfiksasian jaringan kanker payudara yang dilakukan tersebut
menyebabkan perubahan kimia yang sangat signifikan terhadap RNA (Ribeiro-Silva et al.,
2007) yaitu kerusakan RNA dikarenakan adanya interaksi dengan formalin (Masuda et al.,
1999; Werner et al., 2000). Kontaminasi protein yang terjadi pada isolat RNA total
menggunakan protokol asli NucleoSpin® RNA II kit Macherey-Nagel tersebut bisa jadi
dikarenakan adanya lintas-hubungan antara asam nukleat dengan protein (Antonov et al.,
2005).
Isolasi RNA menggunakan protokol modifikasi NucleoSpin® RNA II kit MachereyNagel mendapatkan hasil yang lebih tinggi dengan rasio Å260/ Å280 yang sesuai dengan
4
standar kit tersebut. Tingginya kuantitas RNA diduga karena pengaruh modifikasi protokol
NucleoSpin® RNA II kit Macherey-Nagel yang dilakukan pada pemecahan jaringan (tahap
lisis) menggunakan 500 ng/µl buffer RA1 dan penambahan etanol (tahap pengaturan kondisi
pengikatan RNA) sebanyak 500 ng/µl, di mana penambahan etanol setelah tahap lisis dapat
meningkatkan total RNA. Peningkatan kuantitas RNA ini dikarenakan peran etanol dalam
mengefektifkan pengikatan RNA dengan membran silika (Macherey-Nagel, 2010), sehingga
semakin banyak etanol yang digunakan maka semakin banyak RNA yang berikatan dengan
membrane silika.
Terdapat satu isolat RNA hasil isolasi menggunakan protokol modifikasi
NucleoSpin® RNA II kit Macherey-Nagel yang rasio Å260/ Å280-nya lebih dari standar
rasio kemurnian RNA, yaitu 2,37. Hal ini mengindikasikan adanya degradasi RNA
(Wilfinger et al., 1997) atau dikarenakan adanya kontaminasi DNA maupun reagen-reagen
kit yang terbawa pada isolat RNA (Macherey-Nagel, 2010). Kontaminasi reagen terjadi
diduga karena kurang maksimalnya tahap pencucian isolat sehingga reagen kimia yang
digunakan sebelumnya terbawa dalam isolat, jadi perlu dipastikan bahwa Wash Buffer RA2
benar-benar tercuci dengan Wash Buffer RA3. Dugaan adanya kontaminasi DNA dapat
disebabkan karena tidak efektifnya tahap penghancuran dengan rDNase pada column. Dalam
hal ini sebaiknya rDNase dipipet tepat pada pusat membran silika. Bagaimanapun juga,
pengisolasian RNA tidak dapat dijamin bahwa RNA 100% murni bebas DNA (MachereyNagel, 2010).
Rendahnya kuantitas RNA total yang diperoleh maupun kontaminasi yang terjadi
dapat disebabkan karena sampel dan reagen yang tidak tercampur dengan benar, sehingga
perlu diperhatikan dalam proses pem-vortex-kan setiap setelah penambahan reagen. Terlalu
banyaknya material jaringan yang digunakan juga dapat memberi kontaminasi RNA dengan
DNA (Macherey-Nagel, 2010). Sebagai upaya menghindari kontaminasi, flow-through
jangan sampai tersentuh column outlet dan perlu dipastikan bahwa etanol telah dihilangkan
secara keseluruhan dengan Wash Buffer RA3 selama proses sentrifugasi. Pencucian pada
suhu rendah efisien dalam pelepasan garam oleh Wash Buffer RA3 (Macherey-Nagel, 2010).
Sebaiknya didukung dengan tempat pengerjaan isolasi yang bebas RNase, menggunakan
glove selama tahap pengerjaan dan melakukan penggantian glove secara berkala agar
mendapatkan RNA murni. Ketrampilan tangan dan kefokusan dalam mengisolasi RNA juga
sangat menentukan hasil yang diperoleh.
KESIMPULAN
Berdasarkan uraian hasil penelitian dan pembahasan yang telah dikemukakan, dapat
diambil kesimpulan bahwa pengembangan protokol isolasi RNA dari jaringan kanker fiksasi
formalin dilakukan dari tahap pencucian, penghomogenan, lisis, dan pengikatan RNA.
Protokol yang menunjukkan hasil optimal dalam isolasi RNA jaringan kanker terfiksasi
formalin adalah protokol modifikasi NucleoSpin® RNA II kit Macherey-Nagel.
SARAN
Berdasarkan simpulan di atas, maka saran yang diajukan adalah sebagai berikut.
Diperlukan penelitian lanjutan untuk mengoptimalkan hasil isolasi RNA dari sampel fiksasi
formalin agar mendapatkan konsentrasi RNA total yang tinggi dan murni, sebaiknya
dilakukan penambahan proteinase-K dalam teknik penanganan jaringan kanker payudara
terfiksasi formalin untuk menghindari adanya kontaminasi protein, peneliti sebaiknya lebih
memperhatikan prosedur standar selama pencucian, penyimpanan, dan pengisolasian jaringan
kanker payudara fiksasi formalin untuk menjamin kualitas objek. Mengenai tahap
penghancuran jaringan kanker payudara fiksasi formalin cukup sulit, sehingga diperlukan
penambahan waktu dalam mengestimasi selesainya pengerjaan isolasi RNA tersebut.
5
DAFTAR RUJUKAN
Abramovitz, M., Ordanic-Kodani, M., Wang, Y., Li, Z., Catzavelos, C. Bouzyk, M., Sledge,
G. W., Moreno, C. S. & Leyland-Jones, B. 2008. Optimization of RNA Extraction
from FFPE Tissue for Expression Profiling in the DASL Assay. Biotechniques, 44:
417-423.
Antonov, J., Goldstein, D.R., Oberli, A., Baltzer, A., Pirotta, M., Fleischmann, A., Altermatt,
HJ. & Jaggi, R. 2005. Reliable Gene Expression Measurements from Degraded RNA
by Quantitative Real-Time PCR Depend on Short Amplicons and A Proper
Normalization. Lab Invest, 85(8): 1040-50.
Baelde, H.J., Cleton-Jansen, A.-M., van Beerendonk, H., Namba, M., Bovee, J. V. M. G. &
Hogendoorn, P. C. W. 2001. High Quality RNA Isolation from Tumours With Low
Cellularity and High Extracellular Matrix Component for cDNA Microarrays:
Application to Chondrosarcoma. J Clin Pathol, 54: 778-782.
Bohmann, K., Hennig, G., Rogel, U., Poremba, C., Mueller, B. M., Fritz, P., Stoerkel, S. &
Schaefer, K.-L. 2009. RNA Extraction from Archival Formalin-Fixed ParaffinEmbedded Tissue: A Comparison of Manual, Semiautomated, and Fully Automated
Purification Methods. Clin Chem, 55(9): 1719-1727.
Chung, J.-Y., Braunscheig, T., Williams, R., Guerrero, N., Hoffmann, K. M., Kwon, M.,
Song, Y. K., Libutti, S. K. & Hewitt, S. M. 2008. Factors in Tissue Handling and
Processing That Impact RNA Obtained from Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded
Tissue. J Histochem Cytochem, 56:1033-1042.
Coombs, N. J., Gough, A. C., & Primrose, J. N. 1999. Optimisation of DNA and RNA
Extraction from Archival Formalin-Fixed Tissue. Nucl Acids Res, 27(16): e12.
Farragher, S. M., Tanney, A., Kennedy, R. D. & Harkin, D. P. 2008. RNA Expression
Analysis from Formalin Fixed Paraffin Embedded Tissue. Histochem Cell Biol, 130:
435-445.
Glenn, S. T., Jones, C. A., Liang, P., Kaushik, D., Gross, K. W., Kim, H. L. 2007. Expression
Profiling of Archival Renal Tumors by Quantitative PCR to validate prognostics
markers. Biotechniques, 43: 639-647.
Huang, W. Y., Sheehy, T. M., Moore, L. E., Hsing, A. W. & Purdue, M. P. 2010.
Simultaneous Recovery of DNA and RNA from Formalin-Fixed Paraffin-Embedded
Tissue and Application in Epidemiologic Studies. Cancer Epidemiol Biomarker Prev,
19(4): 973-7.
Jewell, S. D., Srinivasan, M., McCart, L. M., Williams, N., Grizzle, W. H., LiVolsi, V.,
MacLennan, G. & Sedmak, D. D. 2002. Analysis of the Molecular Quality of Human
Tissues. Am J Clin Pathol 118: 733-741.
Lykidis, D., Noorden, S. V., Armstrong, A., Spencer-Dene, B., Li, J., Zhuang, Z. & Stamp,
G. W. H. 2007. Novel Zinc-Based Fixative for High Quality DNA, RNA and Protein
Analysis. Nucl Acids Res, 35(12): e85.
Machery-Nagel. 2010. Total RNA Isolation: NucleoSpin® RNA II. Germany: Machery-Nagel
Inc.
Martin, M., & Weber, B. L. 2000. Genetic And Hormonal Risk Factors In Breast Cancer.
Journal of the National Cancer Institute, 92(14): 1126-1135.
Masuda, N., Ohnishi, T., Kawamoto, S., Monden, M. & Okubo, K. 1999. Analysis of
Chemical Modification of RNA from Formalin-Fixed Samples and Optimization of
Molecular Biology Applications for Such Samples. Nucl Acids Res, 27(22): 44364443.
6
Mattiesen, W. R., Tauber, S. C., Gerber, J., Bunkowski, S., Bruck, W. & Nau, R. 2009.
Increased Neurogenesis After Hypoxic-Ischemic Encephalopathy in Humans is Age
Related. Acta Neuropathol, 117(5): 525-34.
Mizuno, T., Nagamura, H., Iwamoto, K. S., Ito, T., Fukuhara, T., Tokunaga, M., Tokuoka, S.,
Mabuchi, K. & Seyama, T. 1998. RNA from Decades-Old Archival Tissue Blocks for
Restrospective Studies. Diagn Mol Pathol, 7: 202-8.
Okamoto, T. & Okabe, S. 2000. Ultraviolet Absorbance at 260 and 280 nm in RNA
Measurement is Dependent on Measurement Solution. Int J Mol Med, 5(6): 657-9.
Penland, S. K., Keku, T. O., Torrice, C., He, X., Krishnamurthy, J., Hoadley, K. A., Wossley,
J. T., Thomas, N. E., Perou, C. M., Sandler, R. S. & Sharpless, N. E. 2007. RNA
Expression Analysis of Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Tumors. Lab Invest, 87:
383-391.
Ribeiro-Silva, A., Zhang, H. & Jeffrey, S. S. 2007. RNA Extraction From Ten Year Old
Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Breast Cancer Samples: A Comparison of
Column Purification and Magnetic Bead-Based Technologies. BMC Mol Biol 8: 118.
Shi, S.-R., Cote, R. J., Wu, L., Liu, C., Datar, R., Shi, Y., Liu, D., Lim, H. & Taylor, C. R.
2002. DNA Extraction From Archival Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded Tissue
Sections Based on the Antigen Retrieval Principle: Heating Under the Influence of
pH. J Histochem Cytochem, 50: 1005.
The Cancer Genome Atlas Network. 2012. Comprehensive Molecular Portraits Of Human
Breast Tumours. Nature, 490: 61-70.
Werner, F., Eloranta, J. J. & Weinzierl, R. O. J. 2000. Archaeal RNA Polymerase Subunit F
and P are Bonafide Homologs of Eukaryotic RPB4 and RPB12. Nucl Acids Res,
28(21): 4299-4305.
Wilfinger, W. W., Mackey, K. & Chomczynski, P. 1997. Effect of pH and Ionic Streght on
the Spectrophotometric Assessment of Nucleic Acid Purity. BioTechniques, 22(3):
474-6.
7