reaksi uji terhadap asam amino dan

PERCOBAAN1 PROTEIN:REAKSIUJITERHADAPASAMAMINODAN PENENTUANKONSENTRASIPROTEIN
PENDAHULUAN
1.a.AsamAmino
Asamaminoadalahmolekulorganikdenganmassamolekulkecil(100–200)yangmengandung
setidaknya satu gugus karboksil (—COOH) dan satu gugus amino (—NH2) dan merupakan komponen
pentinguntukbiosintesisprotein.Semuaasamaminomerupakanasamα-amino,kecualiprolin.Variasi
yang terjadi pada asam-asam amino terletak pada gugus R atau rantai sampingnya (Gambar 1.1).
Berdasarkan sifat kimia gugus R, sifat suatu asam amino dapat diramalkan, dan pengetahuan tentang
sifatasamaminoakanmembantuidentifikasijenisgugussampingR. Gambar1.1.Strukturumumasamamino.Karbon-αmengikat gugus-gugus:rantaisamping,karboksil,danamino
Ditinjau dari segi struktur, asam amino diklasifikasikan ke dalam tujuh kelompok (Tabel 1.1).
Klasifikasi ini didasarkan atas sifat kimia gugus R sehingga memudahkan dalam mengingat sifat-sifat
umum masing-masing asam amino. Oleh karena itu, klasifikasi gugus R ini dapat digunakan untuk
merancangmetodeanalisissuatuasamamino(Tabel1.2).
Tabel1.1.KlasifikasiasamaminoberdasarkansifatkimiagugusR
SifatkimiagugusR
Contohasamamino
Alifatik
Gly,Ala,Val,Leu
Aromatik
Phe,Tyr,Trp
Hidroksilik
Ser,Thr
Karboksilik
Asp,Glu
MengandungSulfur
Cys,Met
Imino
Pro,Hyp
Amino
Lys,Arg
Amida
Asn,Gln
13
Tabel1.2.BeberapareaksiuntukmendeteksiasamaminoberdasarkangugusR
Namareaksi
Asamamino
yangdideteksi
KondisiReaksi
Warna
Millon
HgNO3dalamasamnitratdengan sedikitasamnitrit
Tyr
Merah
Xantoproteik
Pendidihandalamasamnitratpekat
Tyr,Trp,Phe
Kuning
Hopkins-Cole
AsamglioksilatdalamH2SO4pekat
Trp
Ungu
Sakaguci
α-naftoldannatriumhipoklorit
Arg
Merah
Nitroprusida
NatriumnitroprusidadalamNH3encer
Cys
Merah
Pauly
Asamsulfanilatterdiazotasidalam larutanbasa
His,Tyr
Merah
Folin-Ciocalteu
Asamfosfomolibdotungstat
Tyr
Biru
1.b.Protein
Secara kimiawi, protein adalah suatu polimer asam amino. Hidrolisis lengkap protein
menghasilkancampuran20–22macamasamamino.Strukturproteindibagidalamempatkelas:primer,
sekunder, tersier, dan kuartener. Keempat struktur protein pada dasarnya dibedakan atas jenis dan
jumlah ikatan/interaksi kimia. Struktur primer hanya terdiri dari satu jenis ikatan, yaitu ikatan kovalen
yang menghubungkan gugus amino dan karboksil antar asam amino atau disebut juga sebagai ikatan
amida/peptida (Gambar 1.2). Oleh karena itu, struktur primer mengandung informasi urutan asam
aminoyangmenyusunsuatuprotein.
Ikatan
peptida
1
2
Gambar1.2.Ikatanpeptida
Ikatan kimia yang terdapat pada struktur sekunder adalah ikatan yang terdapat pada struktur
primer(kovalen)danikatanhidrogenantaraoksigenkarbonildanhidrogenamida(C=O---H―N).Ikatan
hidrogen ini terbentuk menurut pola yang teratur sehingga membentuk struktur yang unik seperti αheliks dan lembaran-β. Struktur tersier merupakan mengemasan elemen-elemen struktur sekunder ke
dalam bentuk tertentu. Struktur tersier melibatkan interaksi antar gugus samping asam-asam amino
pembentukprotein,yaituikatansulfidaantarasamaminosistein,ikatanhidrogen,interaksiionikantar
gugusfungsiyangterionisasi,interaksihidrofobikdanhidrofilik,dankemungkinanjugaterdapatikatan
kovalen koordinasi, seperti pada metaloprotein. Semua ikatan maupun interaksi-interaksi kimia
berperan sebagai penstabil, di samping membentuk struktur tersier. Adapun Struktur terakhir adalah
strukturkuarteneryangterbentukpadabeberapaproteinyangmemilikilebihdarisatusub-unit.Pada
struktur kuartener terjadi interaksi antar struktur tersier protein membentuk suatu molekul yang
14
memiliki fungsi biologi tertentu. Ikatan yang terlibat biasanya non-kovalen dan kebanyakan ikatan
hidrofobik antar daerah non-polar pada permukaan molekul protein. Haemoglobin, sebagai contoh,
terdiri dari empat rantai polipeptida (sub-unit), α, α', β dan β'. Seluruh sub-unit membentuk
haemoglobin tetramer yang memiliki fungsi yang lebih efektif dalam mentransport oksigen
dibandingkanhaemoglobinmonomer.
Perhatian:Beberapapercobaanberikutmelibatkanpemanasanreaksidiinkubatorairmendidih.Berhati-hatilahterhadapuapataupermukaanyangpanas.
PERCOBAAN
1.UjiMillon
Reagenyangdigunakandalamujiiniadalahlarutanmerkuridanionmerkurodalamasamnitrat
danasamnitrit.Warnamerahyangterbentukadalahgarammerkuridaritirosinyangternitrasi.
Perhatian: Reagen Millon’s mengandung merkuri dan HNO3 yang bersifat toksik,
korosif, oksidator kuat, pengiritasi dan dapat mengakibatkan luka bakar. Kontak
dengan bahan yang mudah terbakar akan menimbulkan kebakaran. Hindari kontak
matadankulit.Dilarangmenghirupuapmaupunmenelanreagentersebut. Bahan-bahan:
Alat:
•
•
•
ReagenMillon 2%gelatin Albumintelur
HNO3 Prosedur:
•
•
•
Tabungreaksi
Pipettetes
Gelasukur
Merkuri
1. Siapkan 2 buah tabung reaksi yang bersih dan kering, beri label: 2% gelatin dan albumin.
Masukkan2mLdarimasingmasinglarutanketabungreaksiyangsesuai.
2. Tambahkan3tetesreagenMillonkemasingmasingtabung. 3. Tempatkantabungreaksididalaminkubatorairmendidih.Panaskanlarutansampaimencapaititik
didihnya. Jika reagen yang ditambahkan terlalu banyak, warna yang terbentuk akan hilang pada
pemanasan. 4. Catatpengamatananda.
5. Buanglahlarutanyangmengadungreagenmillonkedalamwadahberlabelkan“DischardedMillon’s
solution”(dilemariasam).Cucilahtabungreaksidengansabundanbilasdenganairsebanyaktiga
kalidankeringkan. 15
Pertanyaan:
•
Apa yang terjadi jika garam merkuri ditambahkan ke dalam protein? Mengapa larutan
albumin terkoagulasi? Larutan protein dengan karakterisasi apa yang akan memberikan uji
negatif?Mengapa?
2.ReaksiSisteindanSistin
2.1 Sistin
Bahan-bahan:
•
•
•
Sistin
NaOH1N
KristalPbasetat
Prosedur:
Larutkansedikitsistinkedalam5mLNaOH1 N.TambahkansedikitkristalPb-asetat.Panaskanhingga
mendidih.
Pertanyaan:
Apawarnaendapan?Senyawaapayangmengendap?
2.2Sistein(ReaksiNitroprusida)
Reaksiantaragugussulfidrildariasamamino(sistein),peptida(glutation)atauproteindengan
nitroprusidadalamsuasanaamoniakberlebihdapatditerangkandenganreaksiberikut:
[Fe3+(CN5NO]2- + NH3 +RSH NH4+[Fe2+(CN3NOSR]2
warnasalmon warnamerah
Gambar1.3ReaksiyangterlibatdalamujiNitroprusida
Prosedur:
1. Larutkansedikitkristalsisteinhidroksidadalam5mLair. 2. Tambahkan0,5mLlarutannitroprusida1%
3. kemudiantambahkan0,5mLNH4OH.
Pertanyaan:
1. Apakahwarnahasilpercobaan?Apakahwarnatersebutstabil?
2. Apakahsistinakanmemberikanujipositif?Mengapa?
3. Gugusapadarisisteinyangmemberikanhasilpositifdenganujinitroprusida?
DAFTARPUSTAKA
1. Harrow,B.”LaboratoryManualofBiochemistry”,Ed.V,1960
2. Mathews, C.K., Holde, K.E. (1990). Biochemistry, the Benjamin/Cummings Publishing Co.,
RedwoodCity,USA
16
2.PenentuanKadarProteinSecaraLowry
Penentuan konsentrasi protein merupakan proses yang rutin dilakukan jika bekerja dalam
bidang biokimia. Ada beberapa metode yang biasa digunakan untuk menentukan konsentrasi protein,
yaitu metode Biuret, Lowry dan lain sebagainya. Masing-masing metode mempunyai kekurangan dan
kelebihan. Pemilihan metode yang terbaik dan tepat untuk suatu pengukuran bergantung pada
beberapa faktor seperti: banyaknya material atau sampel yang tersedia, waktu yang tersedia untuk
melakukanpengukuran,alatspektrofotometriyangtersediaUVatauVIS. Reagen pendeteksi gugus-gugus fenolik seperti reagen Folin-Ciocalteu telah digunakan untuk
menentukan konsentrasi protein oleh Lowry (1951) yang kemudian dikenal dengan metode Lowry.
Dalam bentuk yang paling sederhana, reagen Folin-Ciocalteu dapat mendeteksi residu tirosin dalam
proteinkarenakandunganfenolikresidutersebutmampumereduksifosfotungstatdanfosfomolibdat,
yang merupakan konstituen utama reagen Folin-Ciocalteu, menjadi tungsten dan molibdenum yang
berwarna biru. Hasil reduksi ini menunjukkan puncak absorbsi yang lebar pada daerah merah dari
spektrumsinartampak600–800nm.
Sensitifitas metode Folin-Ciocalteu ini mengalami perbaikan yang cukup signifikan apabila
digabung dengan ion-ion Cu (metode Biuret). Kompleks Cu-protein yang dihasilkan oleh reagen Biuret
akan menyebabkan reduksi pada fosfotungstat dan fosfomolibdat, seperti yang terjadi pada reagen
Folin-Ciocalteu. Kira-kira 75% dari reduksi yang terjadi diakibatkan oleh adanya kompleks Cu-protein
tersebut,sementararesidu-residutirosindantriptofanmereduksi25%sisanya.ReagenFolin-Ciocalteu
merupakan suatu komposisi kompleks yang diperoleh dengan cara pemanasan refluks senyawa Natungstat dan Na-molibdat dengan asam orthofosfat. Selain itu disertakan pula komponen-komponen
lainuntukmeningkatkankestabilanreagenyangdalamkondisinormalberwarnakuningpucat.
Pada saat menentukan konsentrasi protein dalam suatu sampel, harus dilakukan pula
pengukuran terhadap beberapa larutan protein standar yang memiliki rentang konsentrasi tertentu di
manakonsentrasisampelproteinberadadidalamrentangtersebut.Proteinditambahkanpertamakali
kedalamtabungreaksidandiikutiair.Seluruhtabungharusmempunyaivolumeakhiryangsamadan
selalu dilakukan pengadukan setelah penambahan zat/reagen. Reagen penghasil warna selalu
ditambahkan terakhir dan biasanya diperlukan selang waktu tertentu untuk terjadi reaksi yang
sempurna.
PERCOBAAN
Alat-alat:
Tabungreaksi,spektrofotometervisible,stopwatch,danbatangpengaduk/vortex
Bahan-bahan:
2% Na2CO3dalam 0,1 N NaOH, 2,7% Natrium Kalium Tartrat, 1% CuSO4 dalam H2O, 1 N Reagen FolinCiocalteu(ReagenFenol), dan Standarprotein:larutanBovineSerumAlbumin(BSA)dengankonsentrasi
antara20–200µg.
NatriumKaliumTartrat
17
Prosedur:
§
Campurlarutanproteinstandardanairsehinggavolumenyatidakmelebihi0,5mL.Campurkanpula
sampelproteindenganairsehinggavolumeakhir0,5mL.(tabeldibawah)
§
§
Tambahkan2mLlarutanBiuretyangtelahdisiapkankedalammasing-masingtabung
§
Setelah 10 menit tambahkan 0,2 mL reagen fenol ke dalam masing-masing tabung. Kocok segera
denganalatvortexataupengadukan.Inkubasiselama30menitpadasuhukamar.Waktuinkubasi
inidapatdimulaisetelahpenambahan/pencampuranreagenfenolkedalamtabungterakhir.
§
Baca absorbansinya pada λ = 700 nm dengan alat spektrofotometer menggunakan tabung-1
sebagaiblanko.
Inkubasi secara tepat 10 menit pada suhu kamar. Selang waktu ini amatlah kritis. Gunakan
stopwatch(nyalakanstopwatch)ketikamenambahkanlarutanBiuretpadatabung1,tungguhingga
selangwaktutertentu(minimal30detik)sebelummenambahkanlarutanbiuretpadatabung2dan
seterusnya. Tabel1.3.PenentuanproteindenganmetodeLowry
Penambahan(mL)
NomorTabung
1
2
3
4
5
6
7
StandarBSA(200µg/mL)
-
0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
-
Sampelprotein
-
-
-
-
-
-
0,5
H2O
0,5 0,4 0,3 0,2 0,1
-
-
ReagenBiuret
2
2
2
2
2
2
2
Adukhinggatercampurrata.Inkubasiselama10menitpadasuhukamar
ReagenFenol
0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2
0,2
Aduk segera hingga tercampur rata. Inkubasi selama 30 menit pada suhu kamar. Baca
absorbansinyapadaλ=700nmdenganmenggunakantabung1sebagaiblanko.
%T700nm
A700nm
µg/aliquot(µg/tabung)
Pertanyaan:
1. Buatlah kurva standar (A700nm vs µg protein) dan tentukan konsentrasi protein suatu larutan yang
diberikan!
2. ApakebaikandankelemahanmetodeLowryini?
3. Berikan sedikitnya dua metode lain (secara spektrofotometri) yang biasa digunakan untuk
menentukan konsentrasi protein selain metode Lowry. Berikan penjelasan mengenai metodemetodetersebutberikutkelebihandankekurangannyadibandingkandenganmetodeLowry!
TUGASPENDAHULUAN
1. Jelaskanprinsippercobaanini!
2. Gambarkan:
a. Strukturasamamino-asamaminopenyusunproteinyangmengandunggugusfenolik
b. StruktursenyawakompleksCu-proteinhasilreaksiBiuret
18
3. MengapametodeLowrylebihpekadibandingkanmetodeBiuretdalammenganalisisprotein?
4. Adakah metode lain selain spektrofotometri untuk menentukan konsentrasi protein? Jika ada
berikanpenjelasanmengenaimetodetersebutberikutkelebihandankekurangannya!
DAFTARPUSTAKA
1. Colowick,S.PandKaplan,N.O(1957),“MethodsinEnzymology”,vol.V,Acad.PressInc,NewYork,
p.448-450.
2. Holme,D.JandPeck,H(1993),“AnalyticalBiochemistry”,2ndEd.,LongmanScientificandTechnical,
NewYork.
3. Lowry,O.H.,Rosebrough,N.J.,Farr,L.AandRandall,R.J(1951),Proteinmeasurementwiththefolin
phenolreagent,TheJournalofBiologicalChemistry,p.265-275.
4. Alexander,R.RandGriffiths,J.M(1993),“BasicBiochemicalMethods”,2ndEd.,AJohnWiley&Sons,
Inc.,NewCork.
19