Laporan Praktikum 6
advertisement
Laporan Praktikum 6 Ekstraksi dan Penentuan Kadar Protein Nama : Cokhy Indira Fasha NIM : 10699044 Kelompok :7 Tanggal Praktikum : 29 Oktober 2001 Tanggal Laporan : 5 November 2001 Asisten : Rizki Ali Akbar Departemen Biologi Institut Teknologi Bandung 2001 Laporan Praktikum 6 Ekstraksi dan Penentuan Kadar Protein I. Pendahuluan A. Latar Belakang Sel hidup mutlak memerlukan molekul-molekul penyusunnya, antara lain karbohidrat, protein dan lemak. Salah satu dari penyusun sel tadi, protein, memiliki fungsi yang sangat fundamental dalam struktur dan kimiawi sel. Semua proses kimia dalam sel memerlukan protein. B.Tujuan Tujuan dari praktikum ini adalah : Ekstraksi jaringan dilakukan untuk memisahkan protein dari bagian sel lainnya. Penentuan kandungan protein C. Teori Dasar Sel terdiri dari protein yang mencapai setengah dari berat keringnya. Protein ini menentukan bentuk dan struktur sel dan juga berperan sebagai instrumen utama pada pengenalan molekul lain. Protein ini memiliki fungsi stuktural, pendukung, penyimpan, transportasi zat lain, sinyal, pergerakan dan pertahanan. Fungsi yang tidak kalah pentingnya ialah sebagai enzim yang meregulasi metabolisme dengan mempercepat reaksi kimia dalam sel secara selektif. Manusia memiliki sepuluh ribu macam protein yang berbeda, masingmasing memiliki fungsi yang berbeda pula. Protein adalah molekul yang paling rumit strukturnya yang pernah diketahui manusia. Setiap jenis protein ini memiliki struktur tiga dimensi yang spesifik pula, yang dinamakan konformasi. Hal-hal diatas dilatarbelakangi bahwa protein merupakan polimer dari 20 jenis monomer asam amino. Polimer dari asam amino ini disebut rantai polipeptida. Sebuah protein teridir dari satu atau lebih rantai polipeptida yang terlipat dan tergulung menjadi konformasi yang spesifik. Asam amino adalah molekul organik yang memiliki gugus karboksil dan amino. Selain 20 asam amino yang esensial, terdapat pula beberapa asam amino yang tidak membentuk protein, tetapi memiliki fungsi penting dalam tubuh. Perbedaan asam amino ditentukan oleh gugus sampingnya. Gugus samping inilah yang menentukan sifat kimia dan fisik dari asam amino ini. Asam amino berdasarkan gugus sampingnya dapat diklasifikasikan sebagai berikut : Asam amino dengan gugus samping non polar yang hidrofobik. Asam amino dengan gugus samping polar yang hidrofilik. Asam amino dengan gugus samping bermuatan positif. Asam amino dengan gugus samping bermuatan negatif. Ketika sel menyintesis polipeptida, rantai ini melipat secara spontan dan memberi protein fungsi. Arsitektur protein ini dapat dibagi menurut tingkatannya menjadi : 1. Struktur primer Struktur ini merupakan urutan unik asam amino yang terpolimer menjadi polipeptida. 2. Struktur sekunder Struktur sekunder dipengaruhi ikatan hidrogen dari antara CO..NH2. Struktur ini membentuk -heliks dan -plate. 3. Struktur tersier Struktur tersier merupakan hasil dari interaksi antar gugus samping protein, misalnya interaksi hidrofobik dan ikatan disulfida. 4. Struktur kuartener Struktur ini merupakan hasil agregasi beberapa subunit polipeptida sehingga terbentuk protein yang fungsional. II. Alat dan Bahan Alat Ekstraksi Jaringan : Mortar Tabung sentrifuga Spatula Tabung sampel Pipet ukur Timbangan Sentrifuga Penentuan Kadar Protein : Cuvet Spektrofotometer Tissue Bahan Jaringan tanaman 300 mg Nitrogen cair Buffer Tris-HCl 0,05 M pH 8 pada suhu 0OC Triton X-100 0,15% Sampel hasil ekstraksi Protein standar BSA Reagen pewarna 0,028% coomasie blue Buffer Tris-HCl 0,05 M pH 8 pada suhu 0OC Triton X-100 0,15% III. Cara Kerja Ekstraksi Jaringan : Prosedur ekstraksi dilakukan menurut metode Abe & Futsuhara (1989) yang dimodifikasi. Awalnya, sampel tumbuhan segar sebanyak 300 mg digerus dalam mortar dengan nitrogen cair. Setelah gerusan halus, ditambahkan 2 ml buffer Tris-HCl 0,05 M pH 8 pada suhu 0OC dan Triton X-100 0,15%. Salanjutnya campuran dihomogenisasikan hingga merata dan dimasukkan ke dalamtabung sentrifuga, Larutan sampel disentrifuga pada 14.000 rpm dan suhu 0OC selama 20 menit. Supernatan jernih selanjutnya disebut ekstra jaringan, dipisahkan untuk analisis lebih lanjut. Penentuan Kadar Protein : Penentuan konsentrasi protein dilakukan dengan metode Bradford, 1976 yang dimodifikasi. Metode ini terdiri dari dua tahap, yaitu tahap penentuan persamaan garis linier protein standar BSA kemudian tahap penentuan konsentrasi protein sampel. Konsentrasi stok protein standar (BSA) adalah 1,4 mg/ml). Dari stok protein standar dibuat kembali larutan stok dengan kisaran konsentrasi 0-1400 g/ml dengan selang tertentu untuk membuat kurva standar. Dari larutan stok tersebut masing-masing diambil sebanyak 200 l ditambah dengan 7 ml reagen pewarna kemudian diinkubasi selama 5 menit pada suhu ruang. Pengukuran absorbansi protein standar dengan kisaran konsentrasi tersebut dilakukan pada = 460 nm. Sebagai balnko digunakan buffer sampel sebayak 200 l yang ditambah dengan 7 ml reagen pewarna. Nilai absorbansi hasil pengukuran digunakan sebagai harga Y sedangkan kadar protein dinyatakan dengan sebagai X, sehingga diperoleh suatu bentuk persamaan Y = a + bX. Persamaan ini akan didapatkan dengan menggunakan analisis Regresi Linier, yang akan digunakan selanjutnya untuk penentuan konsentrasi sampel. Penentuan konsentrasi protein sampel dilakukan dengan cara yang sama. Sampel yang telah diekstraksi diambil sebanyak 200 l dan ditambah dengan 7 ml reagen pewarna. Selanjutnya inkubasi dilakukan selama 5 menit pada suhu ruang. Nilai absorbansi yang diperoleh dikonversikan terhadap persamaan garis linier protein standar BSA. IV. Hasil Pengamatan Pada penggerusan sampel kalus wortel dengan nitrogen cair didapatkan hasil gerusan yang halus berwarna kehijauan. Bubuk ini ditambahkan 2 ml buffer sampel dan sebanyak 1,5 ml campuran ini dimasukkan dalam tabung sentrifuga kecil. Setelah disentrifuga, didapatkan dua lapisan yaitu supernatan yang berwarna kehijauan dan pellet yang berupa endapan. Setelah ditambahhkan reagen pewarna, larutan tampak berwarna biru. Larutan yang didapatkan dispektrofotometri.
