Analisis Obat, Makanan dan Kosmetika

Analisis
Obat, Makanan dan Kosmetika
Februari 2008
Oleh
Hari Susanti, S.Si.,M.Si.,Apt
Fakultas Farmasi
Universitas Ahmad Dahlan
Yogyakarta
PROTEIN
I. Struktur Umum Protein
O
H 2N
H
C
R
C
O
H
N
C
R
C
O
H
N
H
C
R
C
OH
R dapat berupa alifatis maupun aromatis
Berdasarkan struktur diatas,
 Protein mempunyai sifat amfoter,
dan dengan asam dan basa akan membentuk garam
yang dapat mengalami ionisasi
 Gugus -NH2 bebas melekat pada ujung kiri dan gugus
-COOH bebas melekat pada ujung kanan molekul
II. Struktur Molekul Protein
Protein terdiri dari asam amino-asam amino,
terikat bersama-sama dalam bentuk ikatan peptida
(-CO-NH-) melalui proses kondensasi.
Pada pembentukan ikatan peptida, air dilepaskan dari H
pada gugus -NH2 suatu asam amino dan dari OH pada
gugus -COOH asam amino yang lain
H 2C
NH2
H2C
NH2
H
O
C
OH
N
CH2
O
H
C
H
N
CH2
O
glisin
C
glisin
OH
ikatan peptida
O
C
OH
III. Sifat Koloid Larutan Protein
Protein membentuk larutan koloid tipe emulsi, atau
koloid hidrofilik. Efek hidrasi dan muatan pada sifat
koloid dan stabilitas larutan protein adalah sbb :
IV. Klasifikasi Protein
1. Berdasarkan komposisi
a. Simple Protein. Protein murni yang ditemukan di
alam, yang jika terhidrolisis membentuk beberapa
asam amino utama atau derivatnya
contoh: albumin, globulin, prolamin, protamin.
b. Conjugated Protein. Simple Protein yang terikat dengan
molekul nonprotein
contoh: kromoprotein, glikoprotein, fosfoprotein,
nukleoprotein.
c. Derived Protein. Protein yang padanya melekat gugus
artifisial (artificial group) hasil dari aktivitas panas, enzim,
dan reagen kimia
contoh: pepton, coagulated protein.
2. Berdasarkan fungsi fisiologinya
a. Protein struktural
b. Protein kontraktil
c. Hormon
d. Enzim
e. Antibodi
f. Protein darah
V. Fungsi Protein
1. Komponen membran dinding sel dan
mitokondria.
2. Komponen darah.
3. Komponen hemoglobin.
4. Enzim (katalis biologis).
5. Hormon.
VI. Komposisi Protein
C = 50-55%, H = 6-7,3%, O = 19-24%, N = 13-19%,
S = 0-4%.
Protein juga dilaporkan mengandung P, Fe, Cu, I,
Mn, Zn.
IX. Analisis Kualitatif
Analisis kualitatif protein tidak cukup dilakukan
dengan beberapa reaksi warna saja melainkan
harus diikuti dengan uji tertentu yang terkait dengan
tertentu yang terdapat pada protein.
1. Uji Komposisi Suatu Protein
a. Uji komposisi secara umum
Protein (serbuk) dipanaskan dalam tabung reaksi kering.
Warna hitam residu menandakan adanya karbon; bau
amoniak (membirukan kertas lakmus merah) menandakan
adanya nitrogen dan hidrogen; kertas yang mengandung
Pb-asetat menjadi berwarna hitam menandakan adanya
sulfur.
b. Uji terhadap nitrogen organik --- uji Lassaigne
c. Uji terhadap sulfur (uji terhadap sulfur pada sistin dan
sistein)
2. Reaksi Warna Untuk Protein
a. Uji Biuret
CuSO4 dalam suasana basa bereaksi dengan senyawa yang
mengandung dua atau tiga ikatan peptida membentuk
kompleks berwarna violet.
Reaksi ini bersifat tidak mutlak spesifik untuk ikatan peptida;
juga diberikan oleh semua senyawa yang mempunyai dua
atau lebih ikatan peptida.
Asam amino  negatif : tidak mempunyai ikatan peptida
Dipeptida  negatif : hanya mempunyai satu ikatan peptida
Warna yang dihasilkan  karena terbentuknya kompleks
koordinasi antara Cu2+, gugus karbonil dan gugus –NH- yang
terdapat pada ikatan peptida
b. Uji Millon
Reagen Millon + larutan protein  pertama-tama
protein diendapkan sebagai garam-merkuri (endapan
berwarna putih). Pada pemanasan dengan nyala api kecil
 endapan berubah seperti warna merah-daging (+)
Hanya protein yang mengandung tirosin yang mengalami
hidrolisis yang memberikan reaksi positif.
Gugus hidroksifenil (-C6H4OH) pada tirosin merupakan
gugus yang merespon uji ini. Karenanya uji Millon
ditujukan untuk tirosin yang terdapat pada protein.
c. Uji Hopkins-Cole
Gugus indol pada triptofan merupakan gugus
yang merespon uji ini. Gugus aldehid pada asam glioksilik
membantu merubah gugus indol menjadi senyawa
berwarna violet.
Uji Hopkins-Cole ini selanjutnya dijadikan uji terhadap
triptofan.
H2 H
C C
NH2
N
H
triptofan
COOH
H2
C
O
+ H
C
COOH
N
H
asam glioksalik
C
H2
C
C
H
COOH
NH
kompleks berwarna
violet
d. Uji Liebermann
Jika HCl pekat ditambahkan pada protein (padatan),
kemudian dididihkan, dan ditambah beberapa tetes
larutan sukrosa, maka warna violet akan terlihat jika
protein mengandung triptofan. Mirip dengan uji
Hopkins-Cole, gugus aldehid di sini berasal dari kerja
HCl terhadap gula
e. Uji Acree-Rosenheim
Uji ini dapat digunakan untuk mengidentifikasi
formaldehid dalam susu. Protein yang
mengandung triptofan pada susu, dengan adanya
formaldehid (mempunyai gugus aldehid),
memberikan hasil positif (ditunjukkan dengan
cincin berwarna ungu) dengan uji ini jika ditambah
asam (HCl) dan dipanaskan.
f. Uji p-DAB Ehrlich
Ehrlich menyarankan digunakannya p-DAB (p-dimetilaminobenzaldehid) sebagai aldehid untuk uji triptofan.
g. Uji Diazo Ehrlich
Pada penambahan larutan protein yang mengandung histidin
atau tirosin, dan larutan dibuat basa dengan NH4OH 
terjadi warna merah hingga orange. Histidin akan
memberikan warna merah hingga orange; tirosin
memberikan warna orange terang.
h. Uji Sulfur
Jika larutan protein dididihkan dengan campuran larutan KOH
atau NaOH dan Pb-asetat, endapan berwarna hitam akan
terbentuk jika terdapat asam amino yang mengandung sulfur
(misalnya sistein dan metionin). Larutan basa kuat memutus
ikatan sulfur pada asam amino, membentuk K2S, yang
dengan Pb-asetat membentuk PbS, senyawa berwarna
hitam.
i. Uji Molisch
Uji ini ditujukan untuk beberapa KH, tetapi baik juga
digunakan untuk keperluan memperoleh larutan protein
murni yang berasal dari glikoprotein.
j. Uji Ninhydrin
Selain oleh protein, hasil positif juga diberikan oleh peptone,
asam amino, dan amin primer lainnya, termasuk
amoniak.
O
O
C
C
O
ninhidrin
C
OH
+ R
C
OH
O_
H
C
COOH
NH2
-asam amino
- H2O
C
C
O
C
N
C
+ R
C
O
O
senyawa komplek
berwarna
C
OH
k. Uji Biuret
 untuk senyawa yang mengandung dua gugus karbamil
(-CONH2) yang berikatan secara langsung maupun
melalui satu atom nitrogen atau atom karbon.
Protein  mengandung pasangan gugus CONH.
 Senyawa yang terbentuk di-postulat sebagai berikut :
OH
CO.NH2
OH
Cu
NH
CO. NH2
OH
H2N.OC
HN
K K
H2N .OC
OH
Senyawa yang mirip yang mengandung (menempati gugus
–CONH2) gugus –CSNH2, -C(NH)NH2, -CH2NH2  juga (+)
Dipeptida tidak memberikan reaksi positif dengan Biuret; begitu
juga dengan protein yang telah mengalami hidrolisis sempurna.
3. Reaksi pengendapan untuk protein
a. Denaturasi dengan panas dan pH ekstrim
b. Pembentukan endapan dengan logam berat (antara lain:
HgCl2, AgNO3)
R
H
C
O
C
O_ +
AgNO3
NH3+
protein
R
H
C
O
C
O Ag +
HNO 3
NH2
perak proteinat
c. Pembentukan endapan dengan reagen bersifat asam (antara lain:
asam fosfotungstat, asam pikrat)
R
H
C
O
C
O_
+
H+ - pikrat
NH3+
protein
d. Endapan dengan ferrosianida
e. Endapan dengan alkohol
R
H
C
+
O
C
NH2
OH
pikrat
protein pikrat
+
H+
X. Analisis Kuantitatif
1. Volumetri
a. Metode Kjeldahl
Yang ditentukan  kandungan nitrogen, bukan protein
Kandungan protein suatu substansi  hasilnya dikali dengan
faktor kimia untuk meng-konversi nitrogen ke kadar protein.
Karena rata-rata kandungan nitrogen dalam protein adalah 16%,
maka 16 mg N2 setara dengan 100 mg protein: 1 mg N2
setara dengan 100/16 setara dengan 6,25 mg protein.
Contoh perhitungan :
Jika makanan tertentu mengandung nitrogen sebanyak 2%,
maka kandungan protein dalam makanan tersebut adalah
sama dengan 2 X 6,25, atau = 12,5%.
Karena lain protein lain pula jumlah kandungan nitrogennya,
maka faktor perkalian lainnya dapat digunakan untuk
menghitung berat protein.
Modifikasi metode Kjeldahl
Yang biasa digunakan :
sampel dipanaskan dengan H2SO4 pekat, Na2SO4 dan
sejumlah kecil CuSO4. Setelah digestasi berjalan sempurna,
nitrogen berada dalam bentuk (NH4)2SO4. Ketika NaOH
ditambahkan pada residu, H2SO4 dinetralkan dan NH3
dibebaskan. NH3 ini didestilasi dan dilewatkan dalam suatu
larutan standar asam (jumlahnya terukur), dan dari asam
yang dinetralkan, sebagaimana biasanya titrasi maka
kelebihan asam dititrasi dengan larutan standar basa.
Modifikasi lainnya :
Mengumpulkan amoniak yang dibebaskan ke dalam larutan
asam borat yang mengandung indikator (misalnya campuran
bromkresol dan merah metil). Asam borat bereaksi dengan
amoniak membentuk amonium borat, karenanya terjadi
pergeseran pH larutan ke arah basa. Dengan menggunakan
indikator yang spesifik maka larutan ini dapat dititrasi
langsung dengan suatu larutan standar asam.
b. Titrasi formol untuk alanin
Formaldehid bereaksi dengan gugus amino(-NH2)
membentuk senyawa monometilol dan senyawa
dimetilol.
-NH2 + HCHO  -NH(CH2OH)
-NH(CH2OH) + HCHO  -N(CH2OH)2
Formaldehid tidak bereaksi dengan gugus amino bermuatan
(-NH3+), sehingga efek penambahan formaldehid adalah
menggeser pK gugus amino ke pH lebih rendah. pH titik
akhir titrasi asam amino dengan larutan standar NaOH
menjadi berkurang sehingga dapat ditetapkan (indikator
PP).
2. Spektrofotometri
a. Metode Biuret
Larutan protein + reagen Biuret, dicampur dan dihangatkan
pada suhu 37 oC selama 10 menit. Kemudian didinginkan
dan ekstinsi dibaca pada 540 nm.
b. Metoda Folin-Lowry
Protein bereaksi dengan reagen Folin-Ciocalteau
membentuk senyawa kompleks berwarna. Pembentukan
warna disebabkan karena reaksi alkaline copper dengan
protein sebagaimana uji biuret dan reduksi fosfomolibdat
oleh tirosin dan triptofan yang terdapat pada protein.
Metode ini umumnya digunakan pada analisis biokimia.
c. Serapan pada daerah UV
1). Serapan pada 210 nm.
2). Serapan pada 280 nm.
3. Metoda Pengikatan Zat Warna
Pada kondisi tertentu, gugus-gugus yang bersifat asam dan
basa pada makromolekul protein berinteraksi dengan
gugus-gugus pada zat warna organik yang mengalami
disosiasi, misalnya radikal asam dari asam sulfonik,
membentuk endapan yang berwarna. Fenomena
pengikatan zat warna dapat digunakan untuk keperluan
4. Turbidimetri
Pada turbidimetri, intensitas cahaya yang dilewatkan melalui
larutan turbid diukur vs intensitas cahaya yang melalui larutan
murni.
Turbidimetri digunakan sebagai metode untuk menentukan
protein sederhana. Jika semua kondisi pengujian adalah
konstan, maka konsentrasi dapat ditentukan hanya dari kurva
kalibrasi.
Metoda turbidimetri untuk menetapkan protein dapat digunakan
terutama untuk keperluan clinical analysis.
5. Fluorometri, refraktometri dan polarografi