GAMBARAN SENSITIVITAS BERBAGAI ANTIBIOTIK DAN PROFIL
advertisement
GAMBARAN SENSITIVITAS BERBAGAI ANTIBIOTIK DAN PROFIL PLASMID Escherichia coli ISOLAT AIR SUMUR GALI DESA NGEMPLAK KABUPATEN PATI SKRIPSI Diajukan sebagai salah satu syarat menyelesaikan Pendidikan Diploma IV Kesehatan Program Studi Analis Kesehatan Proposal Skripsi Analis Kesehatan Diajukan Oleh : Erla Farikatun Nisa G1C012017 PROGRAM STUDI DIV ANALIS KESEHATAN FAKULTAS ILMU KEPERAWATAN DAN KESEHATAN UNIVERSITAS MUHAMMADIYAHSEMARANG 2016 http://lib.unimus.ac.id i GAMBARAN SENSITIVITAS BERBAGAI ANTIBIOTIK DAN PROFIL PLASMID Escherichia coli ISOLAT AIR SUMUR GALI DESA NGEMPLAK KABUPATEN PATI Erla Farikatun Nisa1, Sri Darmawati2, Muhammad Evy Prastiyanto3 1. Program Studi D IV Analis Kesehatan Fakultas Ilmu Keperawatan dan Kesehatan Universitas Muhammadiyah Semarang. 2. Laboratorium Biologi Molekuler Fakultas Ilmu Keperawatan dan Kesehatan Universitas Muhammadiyah Semarang. 3. Laboratorium Bakteriologi Fakultas Ilmu Keperawatan dan Kesehatan Universitas Muhammadiyah Semarang. ABSTRAK Pemberian antibiotik merupakan cara pencegahan atau pengobatan untuk menghambat pertumbuhan bakteri, seringnya penggunaan antibiotik secara terus menerus dapat menimbulkan terjadinya resistensi bakteri terhadap antibiotik. DNA Plasmid yang dimiliki oleh bakteri dapat mempengaruhi sifat resistensi bakteri terhadap antibiotik. Tujuan penelitian ini untuk mengetahui gambaran sensitivitas E. coli terhadap berbagai antibiotik dan profil plasmid E. coli isolat air sumur gali asal Desa Ngemplak Kabupaten Pati. Metode uji sensitivitas bakteri yang digunakan adalah metode Kirby-Bauer dengan empat jenis antibiotik (kloramfenikol, siprofloksasin, gentamisin dan ampisilin) dan metode isolasi Plasmid menggunakan metode lisis alkali. Hasil uji sensitivitas dari 10 strain E. coli menunjukkan hasil sensitif terhadap antibiotik kloramfenikol dan siprofloksasin, pada antibiotik gentamisin terdapat empat strain dengan hasil resisten (SG.04C, SG.07C, SG.08C, SG.09C) dan 10 strain E. coli menunjukkan resistensi pada antibiotik ampisilin. Plasmid hasil isolasi dari 10 strain E. coli menunjukkan empat strain E. coli memiliki plasmid 8000 bp dan enam strain yang lainnya memiliki plasmid 5000 bp yang masing – masing strain E. coli mempunyai satu jenis plasmid. Kata kunci : Escherichia coli, profil plasmid, sensitivitas antibiotik http://lib.unimus.ac.id iv describe the sensitivity of Escherichia coli to various antibiotics and plasmid profiles of E. coli isolates from the village water wells Ngemplak Pati regency Erla Farikatun Nisa1, Sri Darmawati2, Muhammad Evy Prastiyanto3 1. Program Studi D IV Analis Kesehatan Fakultas Ilmu Keperawatan dan Kesehatan Universitas Muhammadiyah Semarang. 2. Laboratorium Biologi Molekuler Fakultas Ilmu Keperawatan dan Kesehatan Universitas Muhammadiyah Semarang. 3. Laboratorium Bakteriologi Fakultas Ilmu Keperawatan dan Kesehatan Universitas Muhammadiyah Semarang. ABSTRACT Giving antibiotics is a way of prevention or treatment to inhibit the growth of bacteria, the frequent use of antibiotics continuously may cause the occurrence of bacterial resistance to antibiotics. Plasmid DNA possessed by the bacterium may affect the nature of bacterial resistance to antibiotics. The purpose of this study to describe the sensitivity of E. coli to various antibiotics and plasmid profiles of E. coli isolates from the village water wells Ngemplak Pati regency. Bacterial sensitivity test method is the method of Kirby-Bauer dengan four types of antibiotics (chloramphenicol, ciprofloxacin, gentamicin and ampicillin) and the plasmid isolation method using the alkali lysis method. The test results of 10 strain E. coli shows the results of sensitivity to the antibiotic chloramphenicol and ciprofloxacin, the antibiotic gentamicin with the results, there are four strains resistant (SG.04C, SG.07C, SG.08C, SG.09C) and 10 strain E. coli showed resistance to the antibiotic ampicillin. Plasmid isolated from 10 strain E. coli showed four strainE. coli plasmid of 8000 bp and six other strains had a 5,000 bp plasmid that each – each strain strain E. coli has one type of plasmid. Keywords: Escherichia coli, Plasmid profile, Antibiotic sensitivity. http://lib.unimus.ac.id iv Kata Pengantar Assalammua’laikum warohmatullahi wabarokatuh Segala puji syukur atas kehadirat Allah SWT yang telah melimpahkan segala rahmat, hidayah dan Inayah-Nya, Sholawat dan salam kepada junjungan kita Baginda Rasulullah SAW beserta keluarga dan para SahabatNya, sehingga penulis dapat menyelesaikan tugas akhir yang berjudul “Gambaran Sensitivitas Berbagai Antibiotik dan Profil Plasmid Escherichia coli Isolat Air Sumur Gali Desa Ngemplak Kabupaten Pati”. Penyusunan skripsi ini merupakan salah satu syarat untuk menyelesaikan pendidikan Diploma IV Analis Kesehatan di Universitas Muhammadiyah Semarang 2016. Penulis menyadari bahwa terselesaikannya tugas akhir ini tidak lepas dari bimbingan, dukungan dan bantuan dari berbagai pihak. Oleh karena itu pada kesempatan ini, penulis ingin menyampaikan ucapan terimakasih kepada: 1. Ibu Dr. Sri Darmawati, M.Si selaku dosen pembimbing I beserta Bapak M. Evy Prastiyanto, M.Sc selaku dosen pembimbing II yang telah memberikan bimbingan, arahan, izin penelitian, kritik dan saran serta memotivasi selama penyusunan skripsi. 2. Ibu Dra. Sri Sinto Dewi, M.Si, Med selaku Ketua Program Studi D IV Analis Kesehatan Fakultas Ilmu Keperawatan dan Kesehatan Universitas Muhammadiyah Semarang. http://lib.unimus.ac.id iv 3. Bapak Suhari, Ibu Sumiyati dan keluarga tercinta yang telah memberikan doa, dukungan moral, dan material. Penulis menyadari masih banyak ketidak sempurnaan dan kekurangan dalam penulisan tugas akhir ini. Penulis mengharapkan kritik dan saran yang membangun. Semoga proposal penelitian ini dapat bermanfaat bagi para pembaca. Amin Wassalammua’laikum warohmatullahi wabarokatuh Semarang, September 2016 Erla Farikatun Nisa G1C012017 http://lib.unimus.ac.id iv DAFTAR ISI Halaman HALAMAN JUDUL ...........................................................................................i HALAMAN PERSETUJUAN ...........................................................................ii HALAMAN PENGESAHAN ............................................................................iii ABSTRAK ...........................................................................................................iv SURAT PERNYATAAN ORIGINALITAS .....................................................vi KATA PENGANTAR.........................................................................................vii DAFTAR ISI........................................................................................................ix DAFTAR TABEL ...............................................................................................xi DAFTAR GAMBAR...........................................................................................xii DAFTAR LAMPIRAN .......................................................................................xii BAB I. PENDAHULUAN................................................................................... 1 1.1 Latar Belakang ......................................................................................... 1 1.2 Rumusan Masalah .................................................................................... 3 1.3 Tujuan Penelitian ..................................................................................... 4 1.4 Manfaat Penelitian ................................................................................... 4 1.5 Orisinalitas Penelitian .............................................................................. 5 BAB II. TINJAUAN PUSTAKA........................................................................ 6 2.1 Sumur Gali disekitar Limbah Tepung Tapioka Kabupaten Pati .............. 6 2.2 Escherichia coli ....................................................................................... 7 2.2.1 Morfologi Escherichia coli ................................................................... 8 2.2.2 Patogenitas Escherichia coli ................................................................. 9 2.3 Uji Sensitivitas Bakteri ............................................................................10 2.4 Resistensi Escherichia coli Terhadap Antibiotik.....................................11 2.5 DNA Plasmid ...........................................................................................12 2.6 Elektroforesis Gel Agarosa ......................................................................13 2.7 Kerangka Teori ........................................................................................15 BAB III. METODE PENELITIAN ...................................................................16 3.1 Desain Penelitian .....................................................................................16 3.2 Variabel Penelitian...................................................................................16 3.3 Definisi Operasional ................................................................................16 3.4 Populasi dan Sampel Penelitian ...............................................................16 3.5 Alat dan Bahan.........................................................................................17 3.5.1. Alat ......................................................................................................17 3.5.2. Bahan ..................................................................................................17 3.6 Cara Kerja ................................................................................................17 3.6.1 Uji Sensitivitas Bakteri .........................................................................17 3.6.2 Isolasi DNA Plasmid Escherichia coli..................................................18 3.6.3 Separasi Profil Plasmid Escherichia coli .............................................19 3.7 Alur Penelitian .........................................................................................20 3.8 Teknik Pengumpulan Data.......................................................................20 3.9 Pengolahan Data dan Analisis Data .........................................................20 3.10 Waktu dan Tempat Penelitian ................................................................21 3.10.1 Tempat Penelitian ...............................................................................21 http://lib.unimus.ac.id iv 3.10.2 Waktu Penelitian .................................................................................21 3.11 Skema Uji Sensitivitas ..........................................................................22 3.12 Skema Isolasi DNA Plasmid..................................................................23 3.13 Skema Separasi DNA Plasmid...............................................................25 BAB IV. PEMBAHASAN...................................................................................26 4.1 Hasil Penelitian ........................................................................................26 4.1.1 Hasil Uji Sensitivitas.............................................................................26 4.1.2 Hasil Elektroforesis Profil Plasmid E. coli ...........................................27 4.2 Pembahasan..............................................................................................28 BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN .............................................................33 5.1 Kesimpulan ..............................................................................................33 5.2 Saran ........................................................................................................33 DAFTAR PUSTAKA LAMPIRAN http://lib.unimus.ac.id iv DAFTAR TABEL Halaman Tabel 1. Orisinalitas Penelitian .............................................................................5 Tabel 2. Standart Hasil Uji Sensitivitas ................................................................10 Tabel 3. Definisi Operasional ...............................................................................26 Tabel 4. Hasil Uji Sensitivitas E. coli terhadap Antibiotik ..................................28 http://lib.unimus.ac.id iv DAFTAR GAMBAR Nomor Gambar 1. Gambar 2. Gambar 3. Gambar 4. Gambar 5. Gambar 6. Gambar 7. Halaman Gambar Plasmid Pada Sel Bakteri ............................................ 12 Skema Kerangka Teori ............................................................. 15 Alur Penelitian .......................................................................... 20 Skema Uji Sensitivitas .............................................................. 22 Skema Isolasi DNA Plasmid..................................................... 23 Skema Separasi DNA Plasmid ................................................. 25 Hasil Elektroforesis Agarosa DNA Plasmid............................. 27 http://lib.unimus.ac.id iv DAFTAR LAMPIRAN Lampiran Halaman Lampiran 1. Pembuatan Media ..................................................................... 38 Lampiran 2. Gambar Penelitian..................................................................... 41 http://lib.unimus.ac.id iv BAB I PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang Air merupakan kebutuhan pokok yang tidak dapat dipisahkan dalam kehidupan manusia. Air dimanfaatkan manusia untuk kebutuhan hidup salah satunya kebutuhan rumah tangga dan industri. Penyediaan air bersih sekarang ini menjadi prioritas dalam perbaikan derajat kesehatan masyarakat. Seiring meningkatnya kepadatan penduduk dan pesatnya pembangunan, maka kebutuhan air pun semakin meningkat sehingga dituntut tersedianya air yang sehat yang meliputi pengawasan dan penetapan kualitas air untuk berbagai kebutuhan dan kehidupan manusia yang bertujuan untuk menjamin tercapainya air minum maupun air bersih yang memenuhi syarat kesehatan bagi masyarakat (Alwi & Maulina, 2012). Masih banyak masyarakat yang memanfaatkan air sumur gali untuk kebutuhan hidupnya yang masih belum jelas kualitasnya, untuk mengetahui kualitas air perlu dilakukan pemeriksaan berdasarkan sifat fisika, kimia maupun biologi. Adanya bakteri Coliform dalam air merupakan salah satu indikator mikrobiologi yang dapat menentukan kualitas air. Coliform merupakan bakteri yang terkandung dalam jumlah banyak pada kotoran manusia dan hewan (Fadilah et al. 2014). Menurut No.492/MENKES/Per/IV/2010 dan Peraturan Menteri Kesehatan No.907/MENKES/SK/VII/2002 Syarat kualitas air bersih yang dapat digunakan sehari-hari memiliki standar maksimum total bakteri Coliform yaitu 0 AMP/100 mL air, sehingga adanya Coliform dalam http://lib.unimus.ac.id iv air menunjukkan bahwa air tersebut sudah tercemar. Bakteri Coliform tidak dapat menimbulkan penyakit tertentu secara langsung, tetapi semakin tinggi kontaminasi bakteri ini, maka resiko adanya bakteri lain yang dapat menimbulkan gangguan kesehatan semakin tinggi (Alwi & Maulina, 2012). Desa Ngemplak Kecamatan Margoyoso Kabupaten Pati terdapat pabrik tepung tapioka yang banyak menghasilkan limbah, salah satunya limbah cair yang dialirkan ke sungai dan pemukiman penduduk. Kandungan dari limbah cair yang merupakan proses dari produksi pembuatan tepung tapioka tersebut adalah bahan organik yang meliputi karbohidrat, lemak, serat dan protein (Robby et al. 2013). Kandungan limbah cair tersebut merupakan nutrient bagi bakteri yang dapat menyebabkan suburnya pertumbuhan bakteri antara lain Coliform, kemungkinan adanya Coliform dalam air dapat ditemukan di sumber air yang dipakai untuk keperluan rumah tangga seperti sumur gali atau sungai yang ada disekitar limbah tersebut (Munfiah et al. 2013). Salah satu bakteri dari kelompok Coliform adalah Escherichia coli (E. coli). E. coli merupakan anggota dari famili Enterobactericeae yang berbentuk batang, bersifat gram negatif dan dalam keadaan normal berada di usus manusia, E.coli menjadi patogen jika mencapai jaringan di luar habitat normalnnya (Winarno, 2008). Manusia dapat terinfeksi E. coli karena makan dan minum yang terkontaminasi bakteri tersebut sehingga dapat menyebabkan diare dan kram pada abdomen (Juliantina, 2008). Infeksi yang disebabkan E. coli dapat dihambat pertumbuhannya dengan pemberian antibiotik. http://lib.unimus.ac.id iv Menurut penelitian (Martha & Tejasari, 2014) saat ini diketahui banyak resistensi E. coli terjadi terhadap berbagai jenis antibiotik, seperti antibiotik ampisilin 100%, siprofloksasin 74,19%, kloramphenikol 29,03% dan gentamisin 32,26% hal ini disebabkan karena kemungkinan seringnya pemberian antibiotik. Selain itu, bakteri gram negatif seperti E. coli menghasilkan plasmid yang dapat memindahkan gen resistensi dan menghasilkan enzim beta laktamase yang dapat menghambat mekanisme kerja antibakteri (Endriani et al. 2010). Meskipun sudah diketahui banyak resistensi bakteri terhadap antibiotik dan mengingat perbedaan tempat dan waktu penelitian yang dilakukan kemungkinan pola resistensi bakteri terhadap berbagai jenis antibiotik juga berubah, sehingga peneliti ingin mengetahui pola resistensi E. coli isolat air sumur gali terhadap berbagai antibiotik dan profil plasmid pada E. coli. 1.2 Rumusan Masalah Berdasarkan latar belakang di atas dapat dirumuskan suatu permasalahan bagaimanakah gambaran sensitivitas berbagai antibiotik dan profil plasmid Escherichia coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak Kabupaten Pati ? 1.3 Tujuan Penelitian Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui gambaran sensitivitas berbagai antibiotik dan profil plasmid Escherichia coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak Kabupaten Pati http://lib.unimus.ac.id iv 1.4 Manfaat Penelitian 1.4.1 Bagi peneliti Menambah pengetahuan dan keterampilan peneliti khususnya dibidang biologi molekuler. 1.4.2 Bagi Ilmu Pengetahuan Hasil ini diharapkan dapat menambah ilmu pengetauan khususnya dalam bidang biologi molekuler. http://lib.unimus.ac.id iv 1.5 Orisinilitas Penelitian – penelitian yang pernah dilakukan terkait dengan uji sensitivitas bakteri dan profil plasmid pada bakteri Escherichia coli, dapat dilihat pada tabel 1: No Nama/tahun/ jurnal Judul Hasil 1 Fery Indradewi A, 2006 Deteksi DNA plasmid pada Lactobacillus sp. dengan metode elektroforesis gel agarosa Hasil pengujian menunjukkan bahwa Lactobacillus sp. tidak mengandung DNA plasmid, kecuali Citrobacter freundii yang dipakai kontrol jelas adanya band DNA plasmid. 2 Michael Haryadi Wibowo, Widagdo Sri Nugroho, Widya Asmara, 2011, jurnal sain veteriner Profil plasmid Escherichia coli resistsen terhadap beberapa antibiotika yang diisolasi dari peternakan ayam komersial Hasil sensitivitas 8 isolat bakteri terhadap ketiga jenis antibiotik yaitu: ampisilin, streptomisin dan enrofloksasin menunjukkan sifat resisten. Hasil DNA plasmid terhadap 8 isolat E. coli yaitu isolat 1,6 dan 3 masing-masing mempunyai 2 jenis plasmid, satu plasmid berukuran diantara 5148 bp sampai dengan 21.226 bp dan plasmid lain berukuran 5148 bp, isolat 2 teramati memiliki 3 plasmid yaitu 2 plasmid terletak pada posisi antara 5.148 bp sampai dengan 21.266 bp dan 5.148 bp, isolat 4 memiliki 3 plasmid yaitu 2 plasmid terletak diantara 5.148 – 21.266 bp dan satu plasmid sedikit diatas 5.148 bp, isolat 7 memiliki 2 plasmid yang terletak di 4973 bp dan 4268 bp, isolat 5 dan 8 masing-masing memiliki 1 plasmid yang terletak pada 5148 bp. Penelitian yang dilakukan sama dengan penelitian sebelumnya menggunakan metode Elektroforesis gel agarosa. Penelitian ini untuk mengetahui sensitivitas bakteri terhadap antibiotik yang diberikan dan Profil plasmid pada bakteri Escherichia coli dari isolat air sumur gali disekitar limbah tepung tapioka. http://lib.unimus.ac.id iv BAB II KAJIAN PUSTAKA 2.1 Sumur gali disekitar limbah tepung tapioka Kabupaten Pati Air merupakan senyawa kimia yang penting bagi kehidupan makhluk hidup di bumi. Fungsi air bagi kehidupan tidak dapat digantikan oleh senyawa lain. jadi air memegang peranan penting dalam setiap aktivitas manusia terutama kebutuhan air bersih (Rahayu & Dwi, 2010). Kebutuhan air bersih di indonesia pada umumnya dapat dipenuhi dari air hujan, air permukaan dan air tanah (Chandra, 2006). Air tanah yang masih banyak digunakan oleh masyarakat khususnya di Desa Ngemplak Kabupaten Pati adalah air sumur gali. Sumur gali menurut Departemen Kesehatan Tahun 1997 adalah salah satu sarana penyediaan air bersih dengan cara menggali tanah sampai mendapatkan lapisan air dengan kedalaman tertentu. Desa Ngemplak Kecamatan Margoyoso Kabupaten Pati merupakan penghasil tepung tapioka, untuk produksi tepung tapioka sampai saat ini Desa Ngemplak masih memanfaatkan air sumur gali untuk kegiatan industri. Hasil dari kegiatan industri tepung tapioka salah satunya adalah limbah cair. Limbah cair yang dihasilkan dari pabrik tepung tapioka tersebut dibuang langsung ke aliran sungai penduduk. Dampak dari pembuangan limbah tersebut dapat beresiko terhadap terjadinya pencemaran sumber air tanah dan sumur gali yang berada disekitar sungai (Munfiah et al. 2013). http://lib.unimus.ac.id iv Pencemaran air yang terjadi akan meresap ke dalam air tanah dan menyerap ke sumber air masyarakat yang ada disekitar sungai (Widiyanto et al. 2015). Sehingga kebutuhan air bersih yang digunakan masyarakat dari sumur gali harus memenuhi syarat kesehatan air bersih dan air minum berdasarkan kualitas air untuk mengetahui adanya bakteri Coliform dan bahan kimia berbahaya bagi kesehatan. Menurut (Agustiningsih et al. 2012) adanya pemeriksaan kualitas air bersih berdasarkan parameter fisik meliputi (bau, suhu, warna, rasa dan kekeruhan), parameter kimia meliputi (pH, klorida, nitrit, nitrat dan magnesium), paremeter mikrobiologi (adanya Coliform dalam air). Pemeriksaan air secara mikrobiologi digunakan untuk mengetahui ada tidaknya bakteri Coliform dalam air. Bakteri Coliform merupakan indikator pencemaran dalam air karena banyak ditemukan hidup di dalam air yang terkontaminasi oleh kotoran manusia atau hewan. Salah satu bakteri yang termasuk kedalam kelompok Coliform adalah E.coli (Tururaja & Mogea, 2010). 2.2 Escherichia coli Escherichia coli merupakan bakteri anaerob fakultatif, tumbuh baik hampir pada semua media yang bisa dipakai di laboratorium yang digunakan untuk isolasi bakteri enterik, pertumbuhan yang baik pada suhu optimal 370C pada media yang mengandung pepton (Jawetz, 2007). Pada media Mac Conkey (MC) menghasilkan koloni berwarna merah muda, karena mampu memfermentasi laktosa dan pada media Eosin Methylen Blue Agar (EMBA) koloni menghasilkan warna hijau metalik (Iswara, 2015). Karakteristik taksonomi E. coli dalam buku http://lib.unimus.ac.id iv Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology sebagai berikut : (Brinner et al. 1932). Domain : Bacteria Kingdom : Bacteria Phylum : Proteobacteria Class : Gamma proteobacteria Order : Enterobacteriales Family Genus : Enterobacteriaceae : Escherichia Species : Escherichia coli 2.2.1 Morfologi Escherichia coli Escherichia coli merupakan bakteri batang gram negatif, motil atau non motil, tidak berspora dengan ukuran 0,4 - 1,0 μm x 1,3 μm, koloni berbentuk bulat, cembung, halus dan beberapa strain mempunyai kapsul (Ikmalia, 2008). Bakteri E. coli merupakan flora normal usus pada manusia dan hewan yang dapat ditemukan diusus besar (Jawetz, 2007). Bakteri E. coli disebut sebagai bakteri oportunis karena dapat bersifat patogen jika dapat memasuki jaringan tubuh lain diluar habitat normalnya sehingga dapat menyebabkan penyakit pada manusia. Bakteri E. coli bergerak menggunakan flagel peritrik. Morfologi kapsula atau mikrokapsula terbuat dari asam-asam polisakarida. Kadang-kadang mukoid memproduksi pembuangan ekstraseluler yaitu sebuah polisakarida dari spesifitas antigen K tertentu atau terdapat pada asam polisakarida yang dibentuk oleh banyak E. coli seperti pada Enterobacteriaceae (Jawetz, 2005). http://lib.unimus.ac.id iv Bakteri E. coli memproduksi macam-macam fimbria atau pili yang berbeda, banyak macamnya pada struktur dan speksitifitas antigen, antara lain filamentus, proteinaceus, seperti rambut appendages disekeliling sel dalam variasi jumlah. Fimbria merupakan rangkaian hidrofobik dan mempunyai pengaruh panas atau organ spesifik yang bersifat adhesi. Hal itu merupakan faktor virulensi yang penting (Brooks, 2007). 2.2.2 Patogenitas Escherichia coli Bakteri E coli pada umumnya tidak menyebabkan penyakit tetapi dapat menjadi patogen bila bakteri dapat memasuki bagian tubuh lainnya, sehingga menimbulkan infeksi pada jaringan tubuh lain di luar usus normal. seperti saluran air kemih, saluran empedu dan selaput otak yang menyebabkan peradangan pada tempat tersebut (Winarno, 2008). Infeksi paling umum yang disebabkan E coli adalah infeksi saluran kemih (ISK) yaitu antigen K yang dimiliki E coli menyebabkan terjadinya perlekatan pada sel epitel, hal tersebut dapat dimungkinkan terjadinya invasi ke dalam gastrointestinal atau saluran air kemih sehingga mengakibatkan infeksi pada saluran kemih (ISK). Adanya infeksi saluran kemih dapat menyebabkan penyakit lain yaitu sepsis (Jawetz, 2005). Pemberian antiobiotik merupakan cara pengobatan atau pencegahan untuk menghambat pertumbuhan bakteri, seringnya penggunaan antibiotik kemungkinan terjadinya resistensi sehingga perlu adanya uji sensitivitas antibiotik terlebih dahulu sebelum memberikan suatu antibiotik. http://lib.unimus.ac.id iv 2.3 Uji sensitivitas bakteri Uji sensitivitas bakteri adalah suatu metode untuk menentukan tingkat kerentanan bakteri terhadap zat antibakteri atau antibiotik dan untuk mengetahui daya kerja dari suatu antibiotik dalam membunuh bakteri (Waluyo, 2009). Kandungan dari antibiotik merupakan senyawa kimia yang dihasilkan oleh mikroorganisme atau dihasilkan secara sintetik yang bersifat toksik. Senyawa yang terbentuk dapat membunuh atau menghambat perkembangan bakteri dan organisme lain yang kontak dengan bakteri tersebut (Nur et al. 2013). Uji sensitivitas bakteri terhadap antibiotik dapat dilakukan dengan metode Kirby-Bauer yaitu dengan menggunakan difusi cakram (disk diffusion method) dengan mengukur diameter zona bening yang menunjukkan adanya respon penghambatan pertumbuhan bakteri oleh senyawa antibiotik. Hasil uji sensitivitas bakteri dibaca berdasarkan Clinical and Laboratory Standart Institute (CLSI) yang digolongkan ke dalam tiga kriteria yang dapat dilihat pada tabel 2. Tabel 2. Standart hasil uji sensitivitas pada antibiotik kloramfenikol, gentamisin, ampisilin dan siprofloksasin Jenis antibiotik Resisten Intermediet Sensitif Kloramfenikol ( C30 ) 12 13 – 17 18 Gentamisin (CN 10 ) 12 13 – 14 15 Ampisilin ( Amp 10 ) 13 14 – 16 17 Siprofloksasin ( CIP 5 ) 15 16 – 20 21 Hasil dari uji sensitivitas, bakteri yang memiliki plasmid dapat menunjukkan adanya resistensi bakteri terhadap beberapa jenis antibiotik. http://lib.unimus.ac.id iv 2.4 Resistensi Escherichia coli terhadap antibiotik Di negara- negara berkembang seperti Indonesia penyakit infeksi masih menempati urutan pertama dari penyebab sakit di masyarakat, untuk pengobatan biasanya masyarakat dengan cara pemberian antibiotik (Noviana, 2004). Seringnya pemberiaan antibiotik dapat meningkatkan resistensi bakteri terhadap antibiotik tersebut. Adanya resistensi E coli terhadap berbagai jenis antibiotik (ampisilin, kotrimoksasol, kloramfenikol dan gentamisin) sebagai antibiotik generasi pertama, karena memiliki R-plasmid yang membawa satu atau lebih gen yang mengkode enzim yang dapat merusak antibiotik. Bakteri yang resisten. terhadap dua atau lebih antibiotik disebut MDR (Multiple drug resistance) [Darmawati et al. 2015]. Terjadinya MDR terhadap antibiotik sehingga digunakannya antibiotik generasi ketiga golongan fluorokuinolon (siprofloksasin) karena memiliki aktifitas yang lebih kuat dari generasi sebelumnya terhadap bakteri gram negatif (Warganegara &Apriliana, 2014). Namun demikin pemberiaan antibiotik secara berlebihan dapat menyebabkan kepekaan bakteri terhadap antibiotik menurun, namun mulai berkembang pesat dengan tambahan integron pada plasmid atau kromosom DNA. Tambahan plasmid yang mengkode -laktamase mempunyai kemampuan untuk menghidrolisis antibiotik berspektrum luas (Yenny & Herwana, 2007). Resistensi bakteri terhadap antibiotik generasi ketiga ini terjadi mutasi gen yang berada pada kromososm mengkode enzim DNA gyrase. Jadi resistensi bakteri terhadap antibiotik ampisilin, kotrimoksasol, http://lib.unimus.ac.id iv kloramfenikol dan gentamisin sebagai generasi pertama disebabkan adanya faktor R plasmid sedangkan resistensi terhadap antibiotik siprofloksasin sebagai generasi ketiga dikode oleh gen yang ada pada kromosom (Darmawati et al. 2015). 2.5 DNA Plasmid Pada sel bakteri terdapat kromosom sebagai pembawa informasi genetik berupa Molekul DNA kromosom berbentuk supercoil yang berukuran besar yang terletak di daerah inti. Selain kromosom bakteri juga memiliki DNA ekstrakromosomal yaitu plasmid. Plasmid merupakan molekul DNA yang melingkar (sirkuler) yang berada di luar kromosom atau ekstra kromosom. Plasmid dianggap baik berukuran kecil, sebagai bahan genetik tambahan, dapat melakukan replikasi sendiri secara otonom, terkadang dapat bersatu dengan kromosom bakteri dan dapat berpindah atau dipindahkan dari satu spesies ke spesies lain (Fery, 2006). Gambar 1. Plasmid didalam sel bakteri [http://www.thefullwiki.org/plasmid] Sifat resistensi bakteri tehadap antibiotik dapat terjadi karena dipengaruhi oleh unsur yang bersifat genetik seperti plasmid. Gen pada plasmid untuk resistensi http://lib.unimus.ac.id iv antibiotik berfungsi mengontrol pembentukan enzim yang mampu merusak antibiotik. Adanya plasmid dapat dilihat apabila gen yang dikandungnya memberikan sifat-sifat baru pada inang. Pada umumnya plasmid tersebut dinamai sesuai dengan sifat plasmid seperti plasmid resistensi, plasmid virulensi, plasmid degradatif, seks plasmid dan kol- plasmid (Michael, 2011). Sel bakteri dapat mempunyai satu jenis atau lebih DNA ekstrakromosom atau plasmid. Plasmid mempunyai ukuran dan berat sekitar 1 – 300 kb, untuk mengetahui ukuran dari plasmid dapat dilakukan dengan cara elekroforesis gel agarosa (Snustad dan Simmons, 2003). 2.6 Elektroforesis Gel Agarosa Elektroforesis merupakan proses bergeraknya molekul bermuatan dalam suatu medan listrik. Kecepatan molekul yang bergerak pada medan listrik tergantung pada muatan, bentuk dan ukuran molekul. Elektroforesis digunakan untuk pemisahan makromolekul seperti protein dan asam nukleat. Hasil elektroforesis yang terlihat adalah terbentuknya band yang merupakan fragmen DNA dan menunjukkan potongan-potongan jumlah pasang basanya (Widyarti, 2011). Elektroforesis gel agarose adalah suatu metode pemisahan molekul DNA dan RNA menurut muatan, ukuran dan bentuk. Metode ini merupakan suatu teknik yang sederhana, cepat terbentuk dan mampu memisahkan campuran potongan DNA sesuai dengan ukurannya. Saat arus listrik diaplikasikan pada gel, molekul bermuatan negatif akan bermigrasi melalui matriks gel menuju kutub positif (anoda). Migrasi struktur molekul yang besar akan lebih lambat http://lib.unimus.ac.id iv dibandingkan struktur molekul yang kecil dalam proses melewati pori-pori gel (Fatchiyah, 2011). Migrasi elektroforesis DNA melalui gel agarosa dipengaruhi oleh faktor ukuran dan bentuk molekul DNA, konsentrasi agarosa, arus listrik dan suhu. Pewarna Etidhium brimid digunakan untuk alat identifikasi dan mengukur fragmen DNA yang terpisah dalam gel (Fatchiyah, 2011). Etidhium bromid akan menginterkalasi atau menyisip ke dalam DNA. Penggunaan Etidhium bromid dimaksudkan untuk membantu visualisasi karena Etidhium bromid akan memendarkan sinar ultraviolet, jika gel di sinari dengan ultraviolet dari bawah akan terlihat pita-pita pada gel yang merupakan molekul-molekul DNA yang bergerak sepanjang gel setelah elektroforesis (Triwibowo, 2005). Berat molekul suatu fragmen DNA dapat dilihat dengan membandingan laju migrasi fragmen molekul DNA standar (DNA marker). http://lib.unimus.ac.id iv 2.7 Kerangka Teori Air sumur gali Patogenitas Antibiotik Escherichia coli DNA plasmid Sensitivitas Resistensi Elektroforesis gel agarosa Profil plasmid E. coli Gambar 2. Kerangka teori Gambaran sensitivitas berbagai antibiotik dan profil plasmid E. coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak Kabupaten Pati. http://lib.unimus.ac.id iv BAB III METODE PENELITIAN 3.1 Desain Penelitian Penelitian yang digunakan merupakan penelitian Deskriptif 3.2 Variabel Penelitian Variabel yang diamati adalah sensitivitas E. coli terhadap antibiotik dan profil DNA plasmid E. coli. 3.3 Definisi Operasional Tabel 3. Definisi Operasional Subjek Penelitian Sensitivitas antibiotik Profil Plasmid E. coli Definisi Sensitivitas antibiotik merupakan suatu metode untuk menentukan tingkat kerentanan bakteri terhadap antibiotik dan mengetahui daya kerja suatu antibiotik dalam membunuh bakteri dengan mengukur zona hambat disekitar disk antibiotik. Profil plasmid E. coli adalah profil sub-sub unit plasmid yang menyusun DNA plasmid yang diperoleh dengan cara Elektroforesis Gel Agarosa. 3.4 Populasi dan Sampel Penelitian Populasi yang digunakan adalah air sumur gali di Desa Ngemplak Kabupaten Pati yang letaknya dekat dengan limbah tepung tapioka. Sampel yang diambil dari 12 air sumur gali di Desa Ngemplak. Spesimen dari penelitian ini adalah 10 strain E. coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak Kabupaten Pati. http://lib.unimus.ac.id iv 3.5 Alat dan Bahan 3.5.1 Alat Alat yang digunakan dalam penelitian ini yaitu Chamber elektroforesis, power supplay, vortex, waterbath (Memmert), sentrifuge (Hettich), microwave (Electrolux), UV Transiluminator, jangka sorong. 3.5.2 Bahan Bahan yang digunakan dalam penelitian ini yaitu bakteri E. coli, media Muller Hinton Agar (MHA, OXOID), Disk antibiotik (kloramfenikol, siprofloksasin, gentamisin, ampisilin), Lysing solution I (Glukosa, EDTA, Tris), Lysing solution II (NaOH, SDS), Lysing solution III (Kalium asetat, Asam asetat), TAE (Tris, Acetid Acid, EDTA), Ethanol 70%, Ethanol absolute, RNAse, Agarosa, dH2O steril, Ethidium bromid (EtBr), loading buffer. 3.6 Cara Kerja 3.6.1 Uji sensitivitas bakteri Sebanyak 10 strain E. coli isolat air sumur gali di Desa Ngemplak kabupaten Pati diuji resistensinya terhadap antibiotik dengan metode disk diffusion (Kirby Bauer) pada media Muller Hinton Agar (MHA). Dibuat suspensi dengan cara satu koloni bakteri diinokulasi kedalam 5 ml media BHI cair, diinkubasi dengan suhu 37oC selama 18 jam kemudian kekeruhannya disetarakan dengan standar Mc.Farland 0,5. Selanjutnya 100 l suspensi bakteri diinokulasikan pada media MHA secara merata dengan menggunakan triangle, tunggu selama 5 - 10 menit supaya bakteri bakteri meresap ke dalam agar, lalu letakkan disk antibiotik pada permukaan media dengan sedikit ditekan supaya disk antibiotik tidak terlepas. http://lib.unimus.ac.id iv Setelah itu diinkubasi pada suhu 37oC selama 18 – 24 jam. Diamati penghambatan pertumbuhan bakteri dan diukur zona hambatnya disekitar disk dengan menggunakan jangka sorong. 3.6.2 Isolasi DNA Plasmid Escherichia coli Diambil 1 koloni bakteri dari lempeng agar dan dipindahkan ke dalam tabung yang berisi 5 ml media LB. Inkubasi pada suhu 370C dalam waterbath selama semalam, setelah itu bakteri dipanen dengan cara disentrifuge 12000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit. Supernatan dibuang, setelah itu dalam tabung yang berisi pellet di tambahkan 100 l Lysing Solution I disuspensikan lalu simpan ke dalam es selama 5 menit, kemudian ditambah 200 l Lysing Solution II homogenkan dengan cara membolak balik tabung lalu simpan ke dalam es selama 5 menit, selanjutnya ditambahkan 150 l Lysing Solution III homogenkan dengan cara membolak balik tabung lalu simpan ke dalam es selama 5 menit, kemudian di sentrifuge 12.000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit. Supernatan diambil lalu di pindahkan ke dalam tube yang baru dan ditambahkan kloroform 1:1 lalu gojok dengan shaker selama 15 menit, kemudian di sentrifuge 12.000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit, setelah itu pindahkan lapisan atas kedalam tube baru dan ditambahkan Ethanol absolut dingin 1:1 kemudian ditambahkan Na. Asetat sebanyak 40 l (untuk membantu presipitasi). Setelah itu disimpan dalam freezer (-200C) selama 1 jam. Selanjutnya sentrifuge 12.000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit, pellet dicuci dengan ethanol 70% kemudian di sentrifuge 12.000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit, setelah itu pellet di keringkan anginkan ± selama 1 jam selanjutnya pellet dilarutkan dengan TE 50 l, setelah itu tambahkan 10 l http://lib.unimus.ac.id iv RNAse dan inkubasi dalam waterbath selama 1 jam. Kemudian cek DNA plasmid dengan elektroforesis gel agarosa 1,5%. 3.6.3 Separasi Profil Plasmid Escherichia coli Metode Elektroforesis Agarose Separasi Profil Plasmid Escherichia coli dengan Elektroforesis Agarose menyiapkan sisir dan pencetak gel yang sudah dibersihkan dengan alkohol 70%. Setelah alat pencetak gel disiapkan, gel agarose dibuat dengan ditimbang 1,5 gram agarose dan dilarutkan ke dalam 150 ml TAE, kemudian larutan agarose dipanaskan menggunakan microwave selama 3 menit (setiap menit dikelurkan dan digoyang- goyang agar cepat larut), selanjutnya larutan agarose ditambah Ethidiumbromid (EtBr) sebanyak 4 l di homogenkan kemudian larutan agarose di tuang ke dalam cetakan gel agarose, dan pasang sisir diatas larutan agarose. Larutan di diamkan sampai berubah menjadi gel yang padat kemudian sisir diambil dari atas gel secara perlahan (Annisa et al. 2011). Cetakan yang telah berisi gel agarose dimasukkan ke dalam tangki elektroforesis dan masukkan buffer TAE hingga gel terendam seluruhnya. Dimasukkan 18 l sampel DNA plasmid (15 l sampel + 3 l loading buffer) ke dalam sumuran gel. Setelah semua sumuran terisi kemudian alat dihubungkan dengan power supplay dan dielektroforesis pada tegangan 100 volt selama 60 menit. Setelah elektroforesis selesai gel hasil elektroforesis diambil dari cetakan dan band DNA plasmid dapat diamati dibawah sinar ultraviolet (UV). http://lib.unimus.ac.id iv 3.7 Alur Penelitian Air sumur gali Desa Ngemplak 10 Strain E. coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak Uji Sensitivitas Antibiotik (Kloramfenikol, Gentamisin, Ampisilin, Siprofloksasin) metode Kirby Bauer Isolasi DNA plasmid E. coli Elektroforesis metode Gel Agarosa 1,5% Gambaran profil plasmid E. coli Gambar 3. Alur penelitian gambaran sensitivitas berbagai antibiotik dan profil plasmid E. coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak Kabupaten Pati 3.8 Teknik Pengumpulan Data Data yang digunakan dalam penelitian ini merupakan data primer dan hasil penelitian disajikan dalam bentuk narasi. 3.9 Pengolahan Data dan Analisis Data Data diolah dan dianalisis secara deskriptif http://lib.unimus.ac.id iv 3.10 Tempat dan Waktu Penelitian 3.10.1 Tempat Penelitian Penelitian gambaran kepekaan berbagai antibiotik dan profil plasmid E. coli isolat air sumur gali di Desa Ngemplak Kabupaten Pati dilakukan di laboratorium Mikrobiologi Analis Kesehatan Universitas Muhammadiyah Semarang dan laboratorium Rekayasa genetik Bioteknologi Universitas Gadjah Mada Yogyakarta 3.10.2 Waktu Penelitian Waktu penelitian dilaksanakan mulai bulan Maret 2016 sampai dengan bulan Juli 2016. http://lib.unimus.ac.id iv 3.11 Skema Uji Sensitivitas 10 Strain E. coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak Uji sensitivitas antibiotik metode Kirby Bauer Ampisilin Kloramfenikol Resisten Siprofloksasi Sensitif Gambar 4. Skema Uji Sensitivitas terhadap berbagai jenis antibiotik http://lib.unimus.ac.id iv Gentamisin 3.12 Skema Isolasi DNA plasmid Koloni yang sudah murni ditumbuhkan dalam 5 ml LB Inkubasi 370C selama 48 Gojok kuat-kuat pada suhu 370C dalam shaker inkubator selama semalam Inkubasi 370C selama 48 jam Sentrifuge 3000 rpm pada suhu 40C selama 15 Buang supernatan, Pellet di tambah 100 l lysing solution I ink. dalam es 5 menit Di tambah 200 l lysing solution II, homogenkan ink. dalam es 5 menit Di tambah 150 l lysing solution III, homogenkan ink. dalam es 5 menit Sentrifuge 12.000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit Ambil supernatan, pindahkan dalam tube baru dan ditambah kloroform 1:1 homogenkan Gojok dengan shaker selama 15 menit Sentrifuge 12.000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit Pindahkan lapisan atas kedalam tube baru, dan ditambahkan ethanol absolut dingin 1:1 Tambahkan Na. Asetat sebanyak 40 l (untuk membantu presipitasi) Simpan dalam freezer (-200C) selama 1 jam Sentrifuge 12.000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit Pellet dicuci dengan ethanol 70% http://lib.unimus.ac.id iv Sentrifuge 12.000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit Pellet dikering anginkan ± 1 jam kemudian pellet dilarutkan dengan TE 50 l dan ditambah Rnase stock 10 l, inkubasi selama 1 jam Cek DNA plasmid dengan elektroforesis agarosa Gambar 5. Skema isolasi DNA Plasmid Escherichia coli http://lib.unimus.ac.id iv 3.13 Skema separasi DNA plasmid metode Elektroforesis Agarose Siapkan sisir dan baki gel yang telah disterilkan dengan alkohol Larutan Agarose (1,5 gr + 100 ml TAE dipanaskan sampai larut sempurna menggunakan microwave Larutan Agarose ditambah EtBr sebanyak 2 l dihomogenkan, tunggu sampai dingin Masukkan larutan agarose ke dalam baki gel agarose dan sisir diatasnya tunggu sampai polimerasi Angkat sisir secara perlahan, lalu baki yang berisi gel dimasukkan ke dalam tangki elektroforesis Masukkan buffer TAE ke dalam tangki elektroforesis sampai gel terendam Masukkan 18 μl sampel yang sudah ditambah loading buffer ke dalam masing-masing sumuran Hubungkan alat dengan aliran listrik 100 volt tunggu selama 45 – 60 menit Aliran listrik dimatikan lalu keluarkan gel dari baki gel agarose Gel hasil elektroforesis diamati di bawah sinar UV Gambaran profil plasmid Escherichia coli Gambar 6. Skema Separasi DNA plasmid Escherichia coli http://lib.unimus.ac.id iv BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1 Hasil Penelitian 4.1.1 Hasil UjiSensitivitas 10 Strain Escherichia coli Gambaran hasil uji sensitivitas 10 strain E. coli dari isolat air sumur gali asal DesaNgemplak Kabupaten Pati terhadap antibiotik Kloramfenikol, Siprofloksasin, Gentamisin dan Ampisilin yang disajikan pada Tabel 4. Tabel.4 Hasil ujisensitivitas bakteri E. coli terhadap antibiotik kloramfenikol, siprofloksasin, gentamisin dan ampisilin Jenis Antibiotik No Kode Sampel Kloramfenikol (C 30) mm Kepekaan Siprofloksasin (CIP 5) Mm Kepekaan Gentamisin (CN 10) mm Kepekaan Ampisilin (Amp 10) mm 1 SG.02C 20,2 S 19,3 I 18,3 S 12,2 R 2 SG.03C 21,2 S 24,2 S 13,4 I 12 R 3 SG.04C 17 I 24,2 S 11,2 R 10,3 R 4 SG.05B 19,4 S 25,3 S 13 I 0 R 5 SG.07C 19,2 S 23 S 11,2 R 0 R 6 SG.08C 16,3 I 24,4 S 10,4 R 2 R 7 SG.09C 21,4 S 21,4 S 10,2 R 2 R 8 SG.10C 18,3 S 16,2 I 13,2 I 0 R 9 SG.11C 19,2 S 15,2 I 13,2 I 12,4 R 10 SG.12C 17,3 I 30,4 S 15,4 S 12,2 R Keterangan: S: sensitive; I: Intermediate; R: resistensi Berdasarkan hasil uji sensitivitas bahwa dari 10 strain E. coli yang diisolasi dari air sumur gali Desa Ngemplak Kabupaten Pati terhadap keempat jenis antibiotik yang digunakan, yaitu kloramfenikol, siprofloksasin, gentamisin dan ampisilin. Hasil penelitian menunjukkan tujuh strain sensitif terhadap http://lib.unimus.ac.id iv Kepekaan antibiotik kloramfenikol dan siprofloksasin. Empat strain resisten terhadap antibiotik gentamisin dan 10 strain resistensi pada antibiotik ampisilin. 4.1.2 Hasil Elektroforesis Profil Plasmid Escherichia coli Hasil elektroforesis DNA plasmid dari 10 strain E. coli setelah diseparasi menggunakan Elektroforesis Gel Agarosa 1,5 % diamati dibawah sinar ultraviolet menunjukkan hasil : Gambar 7. Elektroforesis Gel Agarosa DNA plasmid Escherichia coliberturut – turut , M = Marker, 1) SG.02C, 2) SG.03C, 3) SG.04C, 4) SG.05B, 5) SG.07C, 6) SG.08C, 7) SG.09C, 8) SG.10C, 9) SG.11C, 10) SG.12C Gambar 7 diatas pada 10 strain E. coliteramati bahwa masing – masing strain mempunyai satu jenis plasmid dan menunjukkan profil plasmid dengan ukuran yang berbeda – beda, 4 diantaranya memiliki plasmid yang berukuran 8.000 bp pada nomer 1,3,8 dan 10, sedangkan 6 lainnya memiliki plasmid dengan ukuran 5.000 bp yang ditunjukkan pada nomer 2,4,5,6,7 dan 9 4.2 Pembahasan Hasil uji sensitivitas 10 strain E. Coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak Kabupaten Pati terhadap antibiotik kloramfenikol, siprofloksasin, gentamisin dan http://lib.unimus.ac.id iv ampisilin diketahui pada antibiotik kloramfenikol dan siprofloksasin 10 strain E. coli menunjukkan hasil sensitif dan intermediet, sedangkan pada antibiotik gentamisin terdapat 6 strain diantaranya menunjukkan hasil sensitif dan intermediet serta 4 strain lainnya resisten dan pada 10 strain E. coli semua menunjukkan resistensi terhadap antibiotik ampisilin. Dilihat dari hasil uji sensitivitas tersebut, hal ini sesuai dengan penelitian (Krisnaningsih et al. 2005) yang menunjukkan adanya variasi sensitivitas dalam satu spesies bakteri E. coli terhadap berbagai antibiotik. Hasil sensitif pada antibiotik kloramfenikol disebabkan adanya ikatan dengan subunit 50S dari ribosom dan akan mempengaruhi pengikatan asam amino yang baru pada rantai peptida sehingga kloramfenikol menghambat enzim peptidil transferase. Hal ini menyebabkan sintesis protein terhenti seketika. Kloramfenikol bersifat bakteriostatik dan pertumbuhan mikroorganisme akan berlangsung lagi apabila antibiotik ini menurun (Krisnaningsih et al. 2005). Jadi penggunaan antibiotik kloramfenikol masih mampu digunakan secara efektif terhadap pengobatan E. coli, namun masih perlu diwaspadai dalam penggunaannya. Siprofloksasin merupakan antibiotik golongan fluorokuinolon generasi pertama. Hasil sensitif pada 7 strain E. coli secara umum terjadi pada saat perkembangbiakan bakteri dimana terjadi pemisahan double helix dari DNA bakteri menjadi 2 utas DNA. Hambatan ini dapat diatasi bakteri dengan bantuan enzim DNA girase. Peranan antibiotika golongan fluorokuinolon menghambat kerja enzim DNA girase pada bakteri dan bersifat bakterisidal, sehingga bakteri mati (Martha & Tejasari, 2014). http://lib.unimus.ac.id iv Gentamisin merupakan antibiotik golongan aminoglikosida. dua strain bakteri yang sensitif terhadap aminoglikosida karena menghambat sistesis protein bakteri. Antibiotik dengan golongan aminoglikosida juga dapat terikat pada reseptor protein spesifik yaitu subunit 30S pada ribosom bakteri yang akan mengakibatkan kode genetik pada mRNA tidak terbaca dengan baik sehingga mengakibatkan biosintesis protein dari bakteri dapat terganggu (Kelanit et al. 2016). Resistensi yang terjadi terhadap antibiotik gentamisin karena kegagalan penetrasi kedalam sel bakteri, rendahnya afinitas obat pada ribosom atau inaktivasi obat oleh enzim bakteri. Enzim inaktivator aminoglikosida yang dikenal yaitu enzim adenilat, fosforilat dan asetilat. Informasi genetik untuk sintesis enzim terutama didapat melalui konjugasi, transfer DNA sebagai plasmid dan transfer faktor resisten. Plasmid pembawa faktor resistensi yang tersebar luas terutama pada suatu lingkungan tertentu bertanggung jawab terhadap penyempitan spektrum kenamisin, gentamisin dan tobramisin (Refdanita et al. 2004). Resistensi dari 10 strain E. coli terhadap antibiotik ampisilin menunjukkan tingkat resistensi yang tinggiterhadap antibiotik golongan penicilin yang mempunyai sifat spektrum luas dengan toksisitas rendah (Nur et al. 2013). Resistensi E. coli terhadap antibiotik ampisilin dapat disebabkan oleh kemampuan bakteri menghasilkan enzim beta-laktamase yang disandi oleh gen dalam plasmid. Enzim tersebut menyebabkan terbukanya cincin beta-laktam pada penisilin sehingga dapat merusak aktivitas antimikroba. Hal ini dapat juga disebabkan karena ampisilin merupakan antibiotik yang banyak ditemukan pada unit-unit http://lib.unimus.ac.id iv pelayanan kesehatan untuk pengobatan terhadap berbagai penyakit infeksi ringan (Tenover, 2006). Selain itu antibiotik ampisilin digunakan juga untuk makanan hewan ternak yang hanya dilakukan oleh petani dan kurang diawasi oleh tenaga ahli hal ini merupakan salah satu bentuk penyalah gunaan antibiotik yang dapat menyebabkan terpaparnya bakteri patogen oleh antibiotik yang kemudian menjadi resisten (Refdanita et al. 2004). Mekanisme resistensi dapat menyebar pada E. coli lain yang belum memiliki mekanisme tersebut melalui plasmid. Plasmid dapat dikelompokkan berdasarkan sifat yang disandi oleh gen yang dikandungnya antara lain plasmid R yang membawa gen resistensi terhadap antibiotik yang dapat menularkan pada bakteri lain dari satu sel ke sel lain. Transfer plasmid R terjadi tidak hanya dalam satu spesies tetapi dapat terjadi dalam satu genus dengan cara konjugasi sehingga dapat meningkatkan populasi resistensi bakteri dialam dan mengurangi efektifitas pengobatan terhadap antibiotik (Michael,2011). Data molekuler yang mendasari sifat resistensi E. coli adalah plasmid. Hasil isolasi dan analisis Elektroforesis DNA plasmid terhadap 10 strain E. coliplasmid yang teramati akan terlihat sebagai pita DNA yang berpendar berwarna orange fluoresence oleh sinar ultra violet yang dapat dilihat pada Gambar 6.DNA Plasmid E. coliterlihat bahwa masing – masing strain teramati mempunyai satu jenis plasmid. Hal tersebut sama dengan penelitian yang dilakukan (Al-Bahry, 2006) terhadap isolat yang diperiksa teramati 100% mempunyai R-plasmid dan mempunyai berat molekul yang bervariasi pula dan menurut data penelitian tersebut bakteri resisten terhadap satu jenis antibiotik http://lib.unimus.ac.id iv mempunyai satu plasmid namun demikian tidak digunakan sebagai acuan karena ditemukan bakteri resisten tetrasiklin mempunyai 2 plasmid. Ukuran DNA plasmid tersebut dapat dibandingkan dengan marker DNA yang sudah diketahui nilainya dan hasilnya menunjukkan satu plasmid berukuran 8.000 bp dan plasmid lain berukuran 5.000 bp. Plasmid pada kode sampel SG.02, SG.04, SG.10 dan SG.12 terletak pada posisi 8.000 bp sedangkan plasmid pada kode sampel SG.03, SG.05, SG.07, SG.08, SG.09, SG.11 terletak pada posisi 5.000 bp. Kondisi tersebut sesuai dengan pernyataan (Islam et al. 2008)yang dapat mengisolasi plasmid resistensi ganda pada 10 isolat E. coli di Bangladesh menunjukkan profil plasmid yang berbeda-beda, 7 diantaranya mempunyai plasmid dengan ukuran yang besar, 3 sisanya memiliki ukuran yang kecil, namun demikian tidak disebutkan secara pasti ukuran plasmid tersebut. Hasil elektroforesis tersebut juga teramati bahwa masing-masing isolat yang diteliti hanya mempunyai satu jenis plasmid. Jadi data yang diperoleh dari uji kepekaan dan elektroforesis DNA plasmid bahwa E. coli menunjukkan resistensi dengan tingkatan yang berbedabeda terhadap ke empat jenis antibiotik yakni kloramfenikol, siprofloksasin, gentamisin dan ampisilin yang diisolasi dari air sumur gali Desa Ngemplak di Kabupaten Pati dan menunjukkan profil plasmid E. coli yang diamati dibawah sinar ultra violet plasmid yang terisolasi mempunyai ukuran 8000 bp dan 5000 bp. Perbedaan ukuran DNA plasmid dapat dipengaruhi karena adanya perbedaan http://lib.unimus.ac.id iv genetik pada plasmid sehingga penelitian tersebut menunjukan ukuran DNA plasmid yang samabelum tentu membawa gen resistensi yang sama. http://lib.unimus.ac.id iv BAB V KESIMPULAN DAN SARAN 5.1 Kesimpulan Berdasarkan hasil penelitian mengenai Gambaran sensitivitas terhadap berbagai antibiotic dan Profil plasmid Escherichia coli isolat air sumur gali Desa Ngemplak KabupatenPati menunjukkan, dari 10 strain E. coli terdapat 3 strain intermediet dan 7 strain sensitive terhadap antibiotik kloramfenikol. Terhadap antibiotik siprofloksasin menunjukkan 3 strain intermediet dan 7 strain sensitif. Terhadap antibiotik gentamisin menunjukkan 4strain dengan hasil resisten serta 6 strain lainnya menunjukkan hasil sensitif dan intermediet. Terhadap 10 strain E. coli semuanya menunjukkan resistensi pada antibiotic ampislin. Hasil elektroforesis gel agarosa DNA plasmid menunjukkan 4 strain memiliki plasmid dengan ukuran 8000 bp yakni (SG.02, SG.04, SG.10 dan SG.12), sedangkan 6 strain lainnya memiliki plasmid dengan ukuran 5000 bp yakni (SG.03, SG.05, SG.07, SG.08, SG.09 dan SG.11). 5.2 Saran Berdasarkan hasil penelitian disarankan perlu dilakukan analisis molekuler Gambaran profil DNA plasmid E. coli dari beberapa tempat yang lain dari berbagai daerah khususnya di Jawa sehingga dapat diketahui gambaran profil DNA plasmid dari berbagai tempat. http://lib.unimus.ac.id iv DAFTAR PUSTAKA Agustiningsih, D., Sasongko, B.S & Sudarno. 2012. Analisis Kualitas Air dan Strategi Pengendalian Pencemaran Air Sungai Blukar Kabupaten Kendal. Jurnal Presipitasi. Vol 9(2). Pp. 64-71 Al-Bahry, S.N., Al-Mashany, B.M., Elshafie, A.E., Pathare, N., AL-Harthy, A.H. 2006. Plasmid Profile of Antibiotic Resistant Escherichia coli Isolated from Chicken Intestine. J. of Ala. Acad. Of Sci. 77(3-4): 152-159. Alwi, M & Maulina, S., 2012. Pengujian Bakteri Coliform dan Escherichia coli Pada Beberapa Depot Air Minum Isi Ulang di Kecamatan Palu Timur Kota Palu. Jurnal Biocelebes, Vol 6(1), pp. 40-47 Annisa, A. N., Ria, S.P & Aminin, L.N., 2011. Pemurnian DNA Plasmid Puc19 Menggunakan Kolom Silika dengan Denaturan Urea. Jurnal Sains dan Matematika. Vol 19(2). pp. 47-53 Brooks GF. 2007. Mikrobiologi Kedokteran jawetz, Melnick & Adelberg. EGC, Jakarta Brinner, D.J., Krieg, N.R. & Staley, J.T., 1932. Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology. USA Chandra, B. 2006. Pengantar Kesehatan Lingkungan. Penerbit Buku Kedokteran. EGC, Jakarta. Darmawati, S., Sembiring, L., Asmara, W., Artama, W.T., 2015. Identifikasi bakteri batang gram negatif pada darah widal positif berdasarkan karakter fenotipik. pp.89–96. Departemen Kesehatan Republik Indonesia. 2002. Syarat – syarat Pengawasan Kualitas Air Minum PerMenkes RI No.907/Menkes/SK/VII/2002. DepKes RI. Jakarta. Endriani, R., Andrini, F. & Alfina, D., 2010. Pola Resistensi Bakteri Penyebab Infeksi Saluran Kemih ( ISK ) Terhadap Antibakteri di Pekanbaru. Jurnal Natur Indonesia. Vol 12(2). pp.130–135. Fadilah, R. et al., 2014. Studi Kualitas Bakteriologis Air Sumur Gali pada Kawasan Permukiman Menggunakan Biosensor TECTA TM B16 ( Studi Kasus : Dusun Blimbingsari dan Dusun Wonorejo , Kabupaten Sleman Yogyakarta ). Jurnal Sains dan Teknologi Lingkungan. Vol 6(1). pp.38–47. http://lib.unimus.ac.id iv Fatchiyah. Arumingtyas, E L. Widyarti, S. rahayu, S. 2011. Biologi molekular; Prinsip dasar analisis. Penerbit Erlangga. Jakarta. Fery, I.A., 2006. Deteksi DNA Plasmid Pada Lactobacillus sp. Dengan Metode Elektroforesis Gel Agarosa. WARTA-WIPTEK. Vol 14(2). p.02. Ikmalia. 2008.Analisa profil protein isolat escherichia coli S1 hasil iradiasi sinar gamma. Fakultas sains teknologi universitas islam negeri syarif hidayatullah. Jakarta Islam, M.J., Sultana, S., Das, K.K., Sharmin, N., Hasan, M.N. 2008. Isolation of plasmid mediated Multidrug Resistant Escherichia coli from Poultry. Int. J. Sustain. Crop. Prod. 3 (5): 46-50. Iswara, A.I., 2015. Pola Sensitivitas Eschericia coli Terhadap Antibiotik pp.273– 277. Jawetz, M dan Adelberg’s. 2005. Mikrobiologi kedokteran. Salemba Medika. Jakarta Jawetz, M dan Adelberg’s. 2007. Mikrobiologi Kedokteran. Buku Kedokteran EGC, Jakarta Juliantina, F., D.A. Citra, B. Nirwani. 2008. Manfaat Sirih Merah (Piper crocatum) sebagai Agen Anti Bakterial Terhadap Bakteri Gram Positif dan Gram Negatif. UII Press. Yogyakarta Kelanit, S.R., Runtuboi, Y.P. Dirky., Gunaedi T., 2016. Uji Resistensi dan Deteksi Gen Plasmid IncHI1 Salmonella typhi Isolat Jayapura. Jurnal Biologi Papua, Vol 8(1), pp. 48-56. Krisnaningsih, M.M. Firdiana., Asmara, W., Wibowo, H.M. 2005. Uji Sensitivitas Isolat Escherichia coli Patogen Pada Ayam Terhadap Beberapa Jenis Antibiotik. Jurnal Sain Veteriner, Vol (1), pp. 16-17 Martha, D & Tejasari, M. 2014. Escherichia coli Resisten terhadap Seftriskson dan Siprofloksasin. Prosiding Penelitian Sivitas Akademika Unisba (Kesehatan). Bandung, Indonesia. Hal.586-587. Michael, H.W., Nugroho, S.W & Asmara, W., 2011. Profil Plasmid Escherichia coli Resisten Terhadap Beberapa Antibiotika yang Diisolasi Dari Peternakan Ayam Komersial. Jurnal Sain Veteriner, Vol 29(1), pp. 43-50. http://lib.unimus.ac.id iv Munfiah, S., Nurjazuli & Setiani, O., 2013. Kualitas Fisik dan Kimia Air Sumur Gali dan Sumur Bor di Wilayah Kerja Puskesmas Guntur II Kabupaten Demak Physical and Chemical Water Quality of Dug and Bore Well in the Working Area of Public Health Center II Guntur Demak Regency. Jurnal Kesehatan Lingkungan Indonesia, Vol 12(2), pp.154–159. Noviana, H., 2004. Pola kepekaan antibiotika Escherichia coli yang diisolasi dari berbagai spesimen klinis. Jurnal Kedokteran Trisakti, Vol 23(4), pp.122– 126. Nur, I., Musjaya, M.G. & Muhammad, A., 2013. Uji Resistensi dan Sensitivitas Bakteri Salmonella thypi Pada Orang Yang Sudah Pernah Menderita Demam Tifoid Terhadap Antibiotik. Jurnal Biocelebes.Vol 7(1), pp.27–34. Rahayu, S.P. & Dwi, O.P., 2010. Pengaruh jarak sumur gali dengan septic tank terhadap kandungan bakteri coliform pada air sumur gali. Jurnal IKESMA. Vol6(1), pp.25–33. Refdanita, Maksum R, Nurgani A, Endang P. 2004. Pola Kepekaan Kuman Terhadap Antibiotika di ruang intensif Rumah Sakit Fatmawati Jakarta Tahun 2001-2002. Jakarta: makara kesehatan vol.8(2) Robby, R.H. et al., 2013. Produksi Biogas dari Limbah Cair Industri Tepung Tapioka dengan Reaktor Anaerobik 3.000 Liter Berdistributor. Jurnal Teknik Pomits. Vol 2(1), pp.1–5. Snustad DP & MJ Simmons. 2003.Principles of Genetic. Hoboken (US): Wiley & Sons Inc. Tenover, F.C. 2006. Mekanisme Resistensi Antimikroba pada Bakteri. Amerika J. of Med. 199(6A):S3-S10 Tururaja, T. & Mogea, R., 2010. Bakteri Coliform di Perairan Teluk Doreri, Manokwari Aspek Pencemaran Laut dan Identifikasi Species. Ilmu kelautan, Vol 15(1), pp.47-52. Waluyo, L., 2009. Mikrobiologi Lingkungan. UMM PRESS, Malang. Warganegara, E. & Apriliana, E., 2014. AD. The Determining type of ExtendedSpectrum Β -Lactamase Enzyme ( ESBL ) from Escherichia coli resistance Cephalosporine of third Generation in RSUD Abdoel Moeloek Bandar Lampung. JUKE. Vol 4(7), pp.87–96. Widiyanto, A.F., Yuniarno, S & Kuswanto, 2015. Polusi Air Tanah Akibat Limbah Industri Dan Limbah Rumah Tangga. Jurnal Kesehatan Masyarakat. Vol 10(2). pp.246–254. http://lib.unimus.ac.id iv Widyarti, S. 2011. Prinsip dasar analisis-biologi molekuler. penerbit erlangga. Jakarta Winarno FG. 2008. Kimia Pangan dan Gizi. MBrio Press. Bogor Yenny & Herwana, E., 2007. Resistensi dari bakteri enterik : aspek global terhadap antimikroba. UNIVERSA MEDICINA. Vol 26(1). Pp. 46-56. http://lib.unimus.ac.id iv LAMPIRAN 1 : Pembuatan Media 1. Sterilisasi Alat dan Bahan Peralatan dan bahan yang digunakan penelitian seperti cawan petri, tabung reaksi, erlenmeyer dan aquades disterilisasi terlebih dahulu agar tidak terkontaminasi oleh mikroba. Alat-alat dicuci hingga bersih kemudian dibungkus dengan kertas, selanjutnya alat yang terbungkus dimasukkan ke dalam autoclave yang bersuhu 121oC dengan tekanan 1 atmosfer selama 15 menit. Alat dimasukkkan ke dalam oven pada suhu 100oC selama 1 jam agar kering sebelum digunakan. 2. Pembuatan Media : a. Media Mueller Hinton Agar (MHA) Cara pembuatan: ditimbang stok media 95 gram dilarutkan dengan aquadest 2000 ml dihomogenkan dan dimasak sampai mendidih, setelah itu dipindah pada erlenmeyer dan disumbat dengan kapas dan dibungkus dengan kertas, diautoclave suhu 121° C selama 15 menit pada tekanan 1-2 atm kemudian angkat media dan dibagi pada cawan petri kira-kira 32 ml dinginkan, lalu masukkan ke kulkas. b. Media Mac Concey (MC) OXOID Komposisi: pepton 8,5 gram, laktosa 5 gram, NaCl 1,5 gram, netral red 0,015 gram, agar 6,75 gram, aquadest 500 ml, PH 7,2 ±0,2. Cara pembuatan: ditimbang stok media 25 gram dilarutkan dengan aquadest 500ml dalam erlenmeyer 1000 ml dihomogenkan dan dipanaskan sampai mendidih, disumbat dengan kapas dan dibungkus dengan kertas, http://lib.unimus.ac.id iv diautoclave suhu 121° C selama 15 menit pada tekanan 1-2 atm kemudian angkat media dan dibagi pada cawan petri kira-kira 8-10ml dinginkan, di bungkus dengan kertas lalu masukkan ke kulkas. c. Media Lauria Bertani Bahan : 0,25 gram ekstrak yeast, 1 gram tryptone, 1 gram Nacl dan 50 ml dH2O. Cara Membuat : Campurkan semua bahan tersebut kedalam 50 ml dH2O kemudian diautoclave suhu 121° C selama 15 menit setelah itu angkat media dan dinginkan kemudian dibagi pada tabung konical masing-masing 5 ml. d. Pembuatan Lysing Solution I Bahan : 50 mM Glukosa (2M) dari stock 1 gr, 10 mM EDTA (0,5M) 0,3846 gr, 25 mM Tris (1M) 0,30 gr, Aquadest 100 ml Cara Membuat : diambil labu ukur 100 ml, kemudian dihomogenkan semua bahan dan ditepatkan dengan aquadest hingga volume 100 ml e. Pembuatan Lysing Solution II Bahan : 0,4 M NaoH 1,6 gr, SDS 2% 1 gr, Aquadest 50 ml Cara Membuat : dibuat satu persatu dengan menggunakan labu ukur 50 ml, saat akan digunakan baru dihomogenkan keduanya dengan perbandingan 1:1 f. Pembuatan Lysing solution III Cara Membuat : 5 M Kalium Asetat (pH 4,8) 60 ml, Asam asetat 11,5 ml dan Aquadest 100 ml http://lib.unimus.ac.id iv Cara Membuat : diambil labu ukur 100 ml, kemudian dihomogenkan semua bahan dan ditepatkan dengan aquadest hingga volume 100 ml. g. Pembuatan TAE 1x sebanyak 1 Liter Bahan : Stok TAE 5x, Aquadest 800 ml Cara pembuatan : diambil 200 ml TAE 5x kemudian ditambah 800 ml dH2O steril dan homogenkan. h. Pembuatan Gel Agarosa 1,5% Bahan : serbuk agarosa 1,5 gram, Ethidium Bromide 2 ul, TAE 1x 150 ml Cara Membuat : Melarutkan agarosa yang telah ditimbang kedalam 150 ml TAE 1x kemudian homogenkan dan larutkan menggunakan microwave selama 3 menit (setiap menit dikeluarkan dan digoyang-goyang agar cepat larut), setelah itu ditambah 2 ul EtBr homogenkan, biarkan dingin lalu tuang kedalam baki gel agarosa. i. Pembuatan Standar Mac.Farland 0,5 Larutan Asam Sulfat (H2SO4) 1% dari larutan BaCl2 1% yang dicampur dalam tabung reaksi dengan perbandingan tertentu sehingga mencapai volume 10 ml, tabung ditutup lalu dihomogenkan. Suspensi BaSO4 yang terdapat dalam tabung dibandingkan dengan kekeruhan suspensi kuman. Komposisi : H2SO4 1% 9,95 ml BaCl2 1% 0,05 ml Prosedur : 1. Dicampur semua bahan dalam tabung reaksi steril 2. Dihomogenkan larutan tersebut http://lib.unimus.ac.id iv LAMPIRAN 2 : Gambar Penelitian .Inkubasi E. coli pada media LB Sentrifuge isolasi DNA plasmid Pembuatan gel agarosa Bahan yang digunakan elektroforesis http://lib.unimus.ac.id iv LAMPIRAN 3 Running elektroforesis gel agarosa Penanaman bakteri pada media Penanaman disk antibiotik pada media MHA http://lib.unimus.ac.id iv LAMPIRAN 4 Gambar hasil diameter zona hambat antibiotik: a) Antibiotik gentamisin resisten, b) kloramfenikol intermediet, c) ampisilin resisten, d) siprofloksasin sensitif. Gambar hasil diameter zona hambat antibiotik: a) Antibiotik kloramfenikol sensitif, b) ampisilin resisten, c) siprofloksasin intermediet, d) gentamisin resisten. http://lib.unimus.ac.id iv http://lib.unimus.ac.id iv
