Analisis secara enzymatis

JURUSAN FARMASI FKIK
UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN
Analisis secara
enzymatis
Oleh :
Hendri Wasito, S. Farm., Apt.
Tinjauan umum
• Pemanfaatan reaksi enzimatis dapat
digunakan untuk anaisis obat pada sampel
biologis dengan mengamati jumlah produk
yang dihasilkan atau jumlah koenzim yang
digunakan.
• Dengan reaksi enzymatis tidak dibutuhkan
tekik yang rumit dan proses pre-treatment
yang panjang.
• Contoh : analisis antibiotik aminoglikosida
(gentamisisn da kanamisin) dengan enzym
asetil/adenil transferase yang dilabel.
Apa itu enzim ???
Enzim merupakan senyawa organik
bermolekul besar yang berfungsi
untuk mempercepat jalannya reaksi
metabolisme di dalam tubuh
tumbuhan tanpa mempengaruhi
keseimbangan reaksi
Enzim tidak ikut bereaksi,
struktur enzim tidak berubah
baik sebelum dan sesudah
reaksi tetap
Enzim merupakan biokatalisator
Bagian enzim yang aktif adalah
sisi aktif dari enzim, tempat
berikatannya dengan substrat
pada saat reaksi katalitik
Tata nama enzimEnzim diberi nama sesuai dengan
nama substrat dan reaksi yang
dikatalisis
Biasanya ditambah akhiran ase
Enzim dibagi ke dalam 7 golongan
besar
Enzyme Commission of the
International Union of Biochemistry
and Molecular Biology (IUBMB)
Fosfotransferase ATP : glukosa =
hesokinase = EC 2.7.1.1 =
transferase.
Fosfotransferase. Fosfotransferase
dengan gugus hidroksil sebagai
penerima. D-glukosa sebagai
penerima gugus fosfat)
S+E
Diffusion
& Affinity
(ES)
Catalysis
(EP)
E+P
Product release
Enzym Multiplied Immunoassay
Technique (EMIT)
• Prinsip kerja : Setiap mol obat stoikiometris
dengan setiap mol enzim yang dilepaskan. Setiap
mol enzim bereaksi dengan substrat yang ada dan
akan menghasilkan produk.
• Yang diukur adalah jumlah produk yang
dihasilkan.
SUBSTRAT
URIN / PLASMA
ANTIBODI
ENZIM-OBAT
KONJUGAT
SPEKTRO
Mekanisme kerja EMIT
Kompleks antara enzim-obat-antibody merupakan
kompleks yang inaktif, sehingga substrat tida
dapat masuk ke sisi aktif anzim.
Adanya obat bebas akan menyebabkan terjadinya
kompetisi antara obat yang sudah terikat dengan
obat bebas untuk berikatan dengan antibodi.
Obat bebas akan berikatan dengan antibodi akan
menyebabkan enzim terlepas dari komples
sehingga sisi aktif enzim bebas dan substrat tidak
dapat masuk.
Kemudian akan terjadi reaksi enzimatis dan akan
menghasilkan suatu produk.
Contoh EMIT
• Substar : Glukosa-6-Phosphat
• Enzim : Dehidrogenase G6P
• Koenzim : NAD (Nicotinamid Adenin
Diphosphat)
• Reaksi :
– substrat + enzim  keilangan atom H
– NAD + H  NADH
• Pengamatan : λ 340-345 nm (NAD tidak
memberkan absorbansi, NADH
mengabsorbansi)
Kelebihan dan Kekurangan EMIT
• Reaksi cepat
• Mudah
diautomatisasi
• Tidak perlu
dilabel radioaktif
Kelebihan
Kekurangan
• Semikuantitatif
• Ketersediaan
antibodi dan
konjugat enzim
sukar didapat
Radio Immuno Assay (RIA)
Analisis berdasarkan reaksi antigen-antibody
(berlabel radioaktif)
Selektifitasnya tinggi (antigen-antibody) dan
sensifitasnya tinggi (10-100 x spektro UV)
Awalnya digunakan untuk senyawa peptida
dan hormon yang sulit dideteksi dengan UV.
Perkembangannnya dapat untuk analisis
senyawa obat.
Radioisotop yang biasa digunakan : H-3, C13, S-35, P-32, I-125, Co-60. (sebaiknya
dipilih yang t1/2 panjang dan partikel yang
dihasilkan lebih aman)
Contoh analisis RIA
• Digoksin tak-berlabel (sampel) ditambahkan
digoksin terlabel dengan jumlah diketahui
ditambahkan antibodi yang akan direaksikan
antigen.
• Antigen akan sebanding dengan obat (digoksin).
• Setelah 20 menit diinkubasi, komponen yang terikat
antibodi dan yang tak terikat dipisahkan dengan
arang aktif, digoksin bebas akan terserap dan
digoksin-antibodi terlarut. Hasil dibaca
radioaktivitasnya.
• Bandingkan dengan standar yang sudah diketahui
kadarnya.
• Semakin besar kadar digoksin semakin kecil
digoksin terlabel yang terikat antibodi (berbanding
terbalik)
Substrat Labeled Fluorescent
Immunoassay (SLFI)
• FDR (Fluorogenic Drug Reagent) misalnya
Umbeliferon galaktosida.
• FDR jika dihidrolisis oleh enzim tertentu
maka florogeniknya akan terlepas sehingga
akan dapat berfluoresensi.
FDR + AB + D
B-galaktosidase
Hidrolisis
AB-FDR + AB-D
FLUORESENSI
Enzyme-linked immunosorbent
assay (ELISA),
• ELISA also known as an enzyme immunoassay
(EIA), is a biocheical technique used mainly in
imunology to detect the presence of an antiody or an
antigen in a sample.
• ELISA test kits can use for research and detection of
drugs and/or their metabolites.
• ELISA is a widely-used method for measuring the
concentration of a particular molecule (e.g., a
hormone or drug) in a fluid such as serum or urine.
Hatur nuhun pisan ...
Jangan lupa untuk menambah informsi
sumber bahan kuliah dari sumber
lainnya ...
Daftar Presentasi Tugas Jurnal
Terstruktur Akhir
•
•
•
•
•
•
•
Ratnawati dkk.
– An LC-MS Method for The Deermnation of Cyclizin in Human Serum.
Meliyana Perwita S. Dkk.
– Identifikasi Ofloxacin dalam Seru Dengan Metode HPLC.
Winda Ariyani dkk.
– Speciation of Drugs in Blood Serum by Surfactant-Mediated HPLC/ICP-MS
with Direct Sample Injection
Afnan dan Gina Puspita S.
– Analysis of Drug and Metabolites in Blood and Urine Using Automated
Disposable Pipette Extraction.
Banu Aji Wijayanto dkk.
– High-Performane Liquid Chromatography Determination of Metrotrexate in
Plasma.
Sabrina Nur F. Dkk.
– Quantification of The Plant-Derivated Hallucinogen Salvinorin in
Conventional and Non-Conventional Biological Fluids by Gas
Chromatography/Mass Spectrometry After Salvia Diviningrum Smoking.
Prima A. Dan Putri D. F.
– Analisis Aspirin pada Urin Relawan Wanita di Musim Dingin.