pengaturan ekspresi gen

PROSES-PROSES AWAL EKSPRESI GEN PADA TANAMAN
DR. IR. EDY BATARA MULYA SIREGAR, MS
Fakultas Pertanian
Program Studi Ilmu Kehutanan
Universitas Sumatera Utara
1. Pendahuluan
Fenotip yang dapat kita amati dari suatu genotip tanaman tertentu
merupakan manifestasi ekspresi gen. Tulisan ini mencoba memberikan gambaran
beberapa proses yang berhubungan dengan akumulasi dari mRNA atau protein
sesudah terjadinya proses transkripsi.
Meningkat atau menurunnya ekspresi suatu gen dari tanaman tertentu akan
dipengaruhi oleh kondisi lingkungan dimana tanaman tersebut berada dan oleh
perkembangan dari tanamannya.
Faktor lingkungan yang berpengaruh pada
ekspresi gen antara lain akibat adanya infeksi patogen atau berbagai faktor abiotik
(cahaya, suhu, keberadaan oksigen, kekeringan, kelebihan atau kekurangan nutrisi).
Perkembangan tanaman dapat dilihat sebagai temporal
(berhubungan dengan
waktu) dan atau spatial
(berhubungan dengan tempat) serta sejalan dengan
berbagai proses seperti perkecambahan, perkembangan organ (akar, daun), transisi
dari pucuk vegetatif ke morfologi bunga, perkembangan biji, pemasakan buah, dan
berbagai proses lainnya. Yang menjadi pertanyaan adalah bagaimana perubahanperubahan ekspresi gen tersebut di atur ?
Pada tulisan ini juga digambarkan tentang struktur dari gen yang berasal dari
tanaman dan diuraikan tentang berbagai mekanisme yang dapat memodulasi
ekspresi suatu gen.
Beberapa contoh tentang respon suatu gen terhadap
perkembangan dan kondisi lingkungan tertentu, serta teknik yang digunakan untuk
menguji bagaimana suatu gen diatur ekspresinya juga akan disampaikan.
2. Struktur Gen Tanaman
Semua gen tersusun dari sequensi DNA yang ditranskripsi menjadi RNA dan
diapit oleh sekuensi DNA dimana proses transkripsi dimulai dan diakhiri (Gambar 1).
Sekuensi yang dapat ditranskripsi diapit oleh elemen tertentu yang diperlukan untuk
inisiasi dan regulasi proses transkripsi. Proses transkripsi sendiri dilakukan oleh
enzim RNA polimerase. Berbagai gen yang ada dalam genom inti ditranskripsi oleh
salah satu dari tiga jenis enzim RNA polimerase.
RNA polimerase I dan III
bertanggung jawab untuk mensintesis rRNA dan tRNA., sedangkan RNA polimerase
II bertanggung jawab untuk mentranskripsi gen yang mengkode suatu protein
tertentu.
Dalam satu gen tertentu, ada yang mempunyai beberapa exon, yaitu bagian
yang akan mengkode protein atau biasa disebut open reading frame (ORF) dan yang
tidak ditranslasi menjadi protein tetapi berperanan dalam proses transkripsi (nontranslated 5’ atau 3’ region). Hasil transkripsi seringkali juga membawa sekuensi
yang disebut sebagai intron, yang bisa ada di bagian ORF atau di bagian nontranslated 5’ atau 3’ region. Secara bertahap intron ini akan dibuang dari transkrip
yang terbentuk dan exon yang ada akan digabungkan membentuk mRNA yang siap
untuk ditranslasi menjadi protein.
2002 digitized by USU digital library
1
Gambar 1. Struktur Gen Tanaman dan Representasi Ekspresinya
Selain yang ada dalam genom inti, sel tanaman juga mempunyai berbagai
gen yang ada di dalam genom mitokondria dan kloroplas.
Berbagai gen ini
mengkode beberapa protein yang diperlukan bagi mitokondria atau kloroplas untuk
menjalankan fungsinya.
Berbagai gen yang ada dalam genom organel ini
mempunyai karakter seperti gen dari organisme prokariot, seperti polisistronik dan
mempunyai konsensus Shine-Dalgarno.
3. Gen hanya sebagian dari DNA tanaman
Secara umum, proses pertumbuhan dan perkembangan dari berbagai jenis
tanaman tidak terlalu berbeda. Siklus pertumbuhan dan perkembangan meliputi
tahapan perkecambahan, pembesaran dan diferensiasi bagian-bagian vegetatif
tanaman,
perkembangan struktur vegetatif (bunga) dan pembuahan yang
mengarah kepada terbentuknya biji tanaman. Kemiripan proses-proses tersebut
antara satu tanaman dengan yang lain membuat kita mengharapkan bahwa
kandungan DNA total dari berbagai tanaman kira-kira juga akan sama. Tetapi
sebagaimana yang telah ditunjukkan hal tersebut tidaklah benar.
Arabidopsi
thaliana mempunyai total DNA yang paling kecil diantara berbagai tanaman, yaitu
sekitar 145 Mbp untuk setiap haploid genom. Variasi kandungan total DNA antara
berbagai spesies tanaman tersebut terjadi karena perbedaan dalam jumlah DNA
repeat yang ada dalam genom tanamannya.
Bagian yang mengkode protein
biasanya ditemukan pada bagian non-repetitive dari genom tanaman dan biasanya
hanya dalam jumlah beberapa atau kadang satu kopi per genom. Kekecualian dari
hal ini adalah untuk gen yang mengkode rRNA sitoplasmik.
4. Peranan dari proximal regulatory element
Berbagai elemen pengatur yang ada di bagian 5’ dari suatu gen dapat dibagi
menjadi dua kelompok, yaitu : proximal element, yang mengatur agar proses inisiasi
transkripsi dapat terjadi dengan benar dan distal element, yang mengatur dan
memodulasi ekspresi gen. Meskipun kedua kelompok tersebut biasa disebut sebagai
promotor, kedua elemen ersebut dapat terpisah oleh beberapa ratus nukleotida.
Bagian proximal promoter terdiri dari tiga bagian :
1. bagian yang merupakan awal transkripsi (transcription start),
2. TATA box, letaknya kira-kira 30 bp di atas transcription start. Elemen ini
berfungsi untuk mengarahkan enzim RNA polimerase agar menggunakan
transcription site yang benar, dan
2002 digitized by USU digital library
2
3. CAAT atau AGGA box, letaknya kira-kira 75 bp di atas transcription site.
Bagian ini berfungsi mengatur jumlah transkrip yang akan dibuat oleh
suatu gen.
5. Peranan dari distal regulatory element
Elemen pengatur ini diketahui mengatur ekpresi gen yang dipengaruhi oleh
berbagai faktor lingkungan dan ada yang dipengaruhi oleh perkembangan tanaman.
Ada beberapa cara untuk menentukan letak dan mendeteksi elemen ini. Jika suatu
gen telah berhasil diisolasi melalui proses kloning, regulatory element dapat
ditentukan dengan membandingkan sekuensinya dengan sekuensi gen yang aktif
terekspresi dalam kondisi yang sama, sehingga didapat suatu concencus sequences
tertentu. Akan tetapi, hasil yang didapat dari cara di atas harus diuji kembali
dengan analisis fungsi dari elemen yang didapat untuk menghindari kesalahan yang
mungkin terjadi. Penggunaan tanaman transgenim dapat membantu analisis fungsi
dari suatu elemen terhadap ekspresi gen. Prosedur eksperimen yang baku adalah
membuat konstruksi dengan berbagai delesi di bagian 5’ dari gennya. Delesi dapat
dilakukan dengan menggunakan situs enzim restriksi yang ada (Gambar 2) atau
menggunakan enzim nuklease Bal31. Masing-masing kontruksi gen yang didapat
selanjutnya diintroduksikan ke tanaman model (biasanya tembakau) dan ekspresi
dari masing-masing gennya dianalisis.
Aktivitas ekspresi dari berbagai konstruksi gen tersebut dapat diamati dengan
dua cara, yaitu (1) dengan mengamati akumulasi mRNA-nya dengan teknik Northern
bloting, atau (2) dengan mengamati protein yang disandikan oleh masing-masing
kontruksi gen dengan menggunakan antibodi tertentu. Pada Gambar 3 dapat dilihat
hasil dari penggunaan teknik yang kedua untuk mengidentifikasi regulatory element
dari gen legA legumin tanaman kacang kapri (Pisum sativum). Tiga konstruksi
dengan berbagai delesi pada bagian regulatory element dan satu kontruksi dengan
gen utuh diintroduksikan ke tanaman tembakau sehingga terbentuk satu seri
tembakau transgenik yang masing-masing membawa salah satu dari keempat
konstruksi gen yang dibuat. Protein legumin yang dihasilkan diisolasi dari masingmasing individu tanaman transgenik tembakau dan dideteksi dengan teknik ELISA.
Hasil yang didapat menunjukkan konstruksi dengan delesi yang berakhir sampai
dengan –97bp di atas transcription start (kontruksi –97) menghilangkan aktivitas
dari gen (protein legumin tidak diproduksi dari kontruksi gen ini). Sintesis legumin
pertama kali dapat dideteksi dalam tanaman yang membawa konstruksi –549. Hal
ini berarti bahwa sekuensi upstream dari –97 diperlukan untuk mengaktifkan gen
legA. Biji dari tanaman transgenik yang membawa kontruksi –833 dan konstruksi –
1203 (yang tidak mengalami delesi) menunjukkan ekspresi legumin yang tinggi,
pada beberapa tanaman dapat mencapai 0.5% dari total protein sel. Hasil yang
sama dengan data ELISA juga diperoleh ketika jumlah transkrip (mRNA) yang
terbentuk dari masing-masing konstruksi gen ditentukan dengan menggunakan
teknik Northern blotting.
Contoh analisis in vivo menggunakan tanaman transgenik seperti ini dapat
memberikan gambaran tentang dua hal penting yang berkaitan dengan regulatory
element pada tanaman, yaitu : (1) sekuensi DNA yang diperlukan untuk ekspresi
dalam jumlah rendah dan yang bersifat spesifik jaringan biasanya berada di sekitar
500 bp upstream dari transcriptional start, dan (2) elemen yang berada lebih jauh
lagi dapat meningkatkan ekspresi gen tanpa berpengaruh terhadap eks[resi gen
yang bersifat spesifik jaringa. Beberapa dari elemen tipe ini tidak akan berfungsi
jika dipisahkan dari gen-nya semula, sedangkan beberapa yang lain dapat berfungsi
sebagai enhancer ketika digabungkan dengan gen lain.
Dengan demikian,
kesimpulan dari percobaan menggunakan gen legA menunjukkan sekuensi DNA
2002 digitized by USU digital library
3
sampai dengan –549 bp berperanan dalam mengatur ekspresi yang bersifat spesifik
jaringan, sedangkan sekuensi antara –549 dengan –1203 bp dapat meningkatkan
ekspresi gen.
6. Enhancer
Enhancer adalah sekuensi DNA regulator yang posisinya relatif jauh dari
transcription start, dapat berfungsi tanpa tergantung pada posisi atau orientasinya,
dan dapat mendorong proses transkripsi berbagai gen yang ada di dekatnya.
Sekuensi enhancer ditemukan pada gen conglycinin (seed storage protein) yang
berasal dari kedelai. Letak dari enhancer ini ada diantara nukleotida –159 sampai –
257 upstream dari transcription start.
Diantara nukleotida tersebut terdapat
beberapa kopi DNA repeat yang masing-masing berukuran 6 bp dengan urutan
sebagai berikut :
A
AGCCCA
A
Dalam suatu percobaan, DNA repeat tersebut disisipkan dalam berbagai posisi
dan orientasi yang berbeda, upstream dari suatu gen reporter. Sistem gen reporter
yang dibuat terdiri dari : distal element dari gen conglycinin, cauliflower mosaic virus
(CaMV) promoter, dan sekuensi pengkode enzim chloramphenicol acetyl transferase
(CAT). Konstruksi gen ini telah diintroduksikan ke dalam tanaman model sehingga
terbentuk populasi tanaman transgenik yang masing-masing membawa gen reporter
tertentu. Tanaman transgenik yang membawa gen reporter dengan DNA elemen
yang ada diantara –257 dan –159 mampu mengekspresi enzim CAT dalam biji
sebanyak 25 kali lipat lebih tinggi dibanding tanaman kontrol. Hal ini memberikan
indikasi bahwa pada sekuensi DNA diantara –257 dan –159 tersebut terdapat elemen
yang berlaku sebagai enhancer.
7. Fusi Promotor dan gen reporter
Jika teknik untuk menguji produk alami dari gen tertentu tidak tersedia atau
jika ingin mengetahui di bagian jaringan/sel apa suatu gen akan terekspresi, maka
ORF dari gen alami tersebut dapat diganti dengan ORF dari gen reporter yang relatif
mudah untuk dideteksi. Gen reporter yang biasa digunakan adalah gen CAT (untuk
ketahanan antibiotik), gen nptII (untuk ketahanan terhadap kanamycin), atau gen
uid (8-glucuronidase=GUS).
Jika suatu tanaman transgenik mengekspresikan fusi dari gen CAT atau nptII,
dengan promotor dan distal element tertentu, maka jumlah enzim GUS atau CAT
yang diproduksi (diukur berdasarkan tingkat aktivitasnya) akan dapat dengan mudah
ditentukan dan produksi enzimnya akan sangat tergantung pada efektivitas promotor
dan distal element-nya. Penggunaan fusi promotor-gen reporter CAT atau nptII
tidak dapat memberikan gambaran di jaringan atau sel apa gen reporter ini
terekspresi.
Gen reporter yang dapat dimonitor ekspresinya di berbagai tipe jaringan
adalah gen uid (GUS). GUS adalah enzim dari E. Coli yang mengkatalisis pemecahan
berbagai senyawa glukuronidase.
Substrat dari enzim ini telah dibuat secara
komersial untuk analisis menggunakan spektrofotometer, fluorometer, dan
histokimia. Dengan adanya enzim GUS, X-gluc yang dipakai sebagai substrat
analisis histokimia, akan memberikan reaksi warna biru yang dengan mudah dapat
dilihat di bawah mikroskop. Selain itu, tipe-tipe sel atau jaringan tertentu yang
mengekspresikan fusi promotor-GUS akan dapat diamati. Dengan teknik tersebut,
aktivitas suatu elemen regulator tertentu di jaringan tanaman dapat.
2002 digitized by USU digital library
4
8. RNA processing
Hasil awal dari proses transkripsi biasanya berupa molekul RNA yanga ada di
dalam nukleoplasma (Gambar 4), yang dikenal sebagai heteronuklear RNA (hnRNA).
Molekul hnRNA mempunyai ukuran jauh lebih besar dibandingkan dengan nukleotida
yang ada pada mRNA fungsional.
Kelebihan DNA tersebut berupa : (1) 5’ un-translated sequence (5’ UTS), (2)
3’ UTS, dan (3) intron. Molekul hnRNA akan mengalami processing sebelum menjadi
mRNA fungsional. Tahapan RNA processing yang harus dilalui antara lain: (1)
pemberian gugus m7G-CAP (proses capping) pada ujung 5’ dari RNA, (2)
penambahan sekuensi poli-(A) pada ujung 3’ dari mRNA, dan (3) splicing
(penghilangan) intron. Berbeda dengan gen yang berasal dari genom inti, genom
organel (mitokondria dan kloroplas) jarang ada yang mempunyai intron. Transkrip
(mRNA) dari gen-gen yang ada di kloroplas biasanya tidak mengalami penambahan
poli-(A). Sedangkan mRNA dari organel mitokondria mengalami penambahan poli(A) di bagian ujung 3’, tetapi tidak mengalami capping.
9. Penambahan gugus m7G-CAP (Capping)
Pada molekul mRNA yang mengalami capping, sebuah residu 7-methyl
guanosine ditambahkan ke ujung 5’ dari RNA-nya dengan ikatan 5’-5’ (Gambar 5).
Struktur CAP ini berfungsi melindungi RNA dari aktivitas enzim eksonuklease dan
membantu proses binding dari ribosom (subunit 40S) selama inisiasi proses
translasi.
Subunit ribosom ini mengenali gugus CAP diujung 5’ dan bergerak
sepanjang mRNA sehingga mencapai strat kodon untuk memulai translasi.
10. Penambahan Poli-(A)
Setelah capping, transkrip primer mengalami penambahan sejumlah residu
adenosin (poli-[A] ) di ujung 3”. Pada tanaman, signal yang diperlukan untuk
penambahan poli-(A) ini mempunyai sekuensi konsensus AAUAAA. Poli-(A) akan
ditambahkan pada posisi 13-23 bp setelah signal AAUAAA. Kadang-kadang suatu
gen tanaman mempunyai lebih dari satu signal untuk penambahan poli-(A).
Pada hewan, poli-(A) berfungsi melindungi mRNA dari aktivitas enzim
ribonuklease dan membantu dalam proses transportasi mRNA dari inti ke sitoplasma.
Fungsi yang sama juga diduga dipunyai oleh poli-(A) dari mRNA tanaman.
11. RNA Splicing
Proses yang terakhir yang dialami oleh hnRNA sebelum menjadi mRNA
fungsional adalah splicing intron dari mRNA. Proses splicing melibatkan interaksi
antara intron, dan u-type small nuclear ribonucleoprotein particle (snRNP), dan
beberapa protein lain yang belum jelas identitas dan fungsinya, serta merupakan
proses yang memerlukan energi (energy dependent), sehingga memerlukan adanya
ATP.
Antara intron dan ekson diketahui mempunyai batasan tertentu, yaitu batas
ujung 5’ dari intron adalah pasangan nukleotida GT dan batas ujung 3’ adalah
pasangan nukleotida AG. Proses splicing diawali dengan terbentuknya struktur
kompleks yang disebut spliceosome. Proses splicing akan berlanjut melalui dua
tahapan seperti yang diilustrasikan pada Gambar 3.
2002 digitized by USU digital library
5
Gambar 3. Intron splicing dalam pembentukan mRNA matang.
Sekuensi konsensus batas intron-ekson untuk tanaman berbeda dengan
hewan dan organisme eukariot seperti ragi. Dengan demikian, jika gen yang berasal
dari hewan atau eukariot lain diekspresikan di sel tanaman dengan teknik rekayasa
genetika, maka proses splicing dari gen yang diintroduksi akan terganggu.
Kesimpulan
Semua gen tersusun dari sequensi DNA yang ditranskripsi menjadi RNA dan
diapit oleh sekuensi DNA dimana proses transkripsi dimulai dan diakhiri.
Gen hanyalah sebagian dari DNA total yang terdapat di dalam suatu tanaman.
Hasil awal proses trasnkripsi adalah molekul RNA yang terdapat di
nukleoplasma dan dikenal sebagai heteronuklear RNA (hnRNA). Molekul hnRNA akan
mengalami processing sebelum menjadi mRNA fungsional, anatara lain : (1) proses
capping, (2) penambahan sekuensi poli-(A), dan (3) splicing intron.
2002 digitized by USU digital library
6
Daftar Pustaka
Boss, W.F. & J.D. Morre.
1989.
Development. Liss. New York.
Second Messengers in Plant Growth and
Budle, R.J.A. & D.D. Randall. 1990. Light as a signal influencing the phosphorilation
status of plant proteins. Plant Physiol. 94:1501-1504
Datta, N. & A.R. Cashmore. 1989. Binding of pes nuclear protein to promoters of
certain photoregulated genes is modulated by phosphorilation. Plant Cell.
1:1069-1077.
Hames, B.D. & D.M. Glover. 1989.Transcription and Splicing. IRL Press. Oxford.
Old R.W. & S.B. Primrose. 1985. Principles of Gene Manipulation: an introduction to
genetic engineering (3rd ed.) Blackwell Sci. Pub. Oxford.
SambrookJ., E.F. Fritsch & T. Maniatis. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory
Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York.
Shewry, P.R. & A.S. Tatham. 1990. The prolamin storage proteins of cereal seed:
structure and evolution. Biochem J. 267:1-12.
Zimmerman J.L., N. Apuya, K. Darwish & C. O’Carroll. 1989. Novel regulation of
heat shock genes during carrot somatic embryo development. Plant Cell.
1:1137-1146.
2002 digitized by USU digital library
7