MAKALAH jurnal kuljar hairy roots

MAKALAH
Hairy Roots Inductions From Portulaca oleracea using Agrobacterium
rhizogenes to Noradrenaline’s production
Sebagai Pemenuhan Tugas Mata Kuliah Kultur Jaringan
Dosen pengampu: Dr. Wahyu Widoretno
Oleh:
1). Alfonsina A. A. Torimtubun ()115061100111027)
2). Megah Mulyo Eko H (115061100111028)
3). Rahma Yulia Rusmo (115061100111029)
4). Angga Reza (115061100111030)
5). Afida Khofsoh (115061100111031)
6).Inggit Kresna Maharsih (115061100111005)
PROGRAM STUDI TEKNIK KIMIA FAKULTAS TEKNIK
UNIVERSITAS BRAWIJAYA
MALANG
TAHUN AJARAN 2012/2013
Abstrak
Noradreneline adalah salah satu metabolit sekunder penting yang diproduksi oleh Portulaca
oleraceao. Awalnya, tanaman ini memproduksi metabolit ini dalam jumlah yang relatif kecil
sehingga induksi rambut akar menjadi suatu hal yang sangat berguna untuk meningkatkan
produk komersialnya. Dalam penelitian ini strain dari Agrobacterium rhizogenes digunakan
untuk menginduksi rambut akar pada Portulaca oleraceao. Untuk meningkatkan transduksi,
perbedaan faktor seperti eksplan (daun, batang, akar), umur eksplan (14, 28, 56 hari), strain
bakteri (15834, C318, 9435, A4), dan konsentrasi bakteri (0/2, 0/4, 0/6, 0/8) digunakan.
Inokulasi eksplan dalam 14 hari dengan 0/6 konsentrasi dari strain AR15834 mengindikasikan
persentasi maksimum dari tranduksi. Analisis PCR menunjukkan kehadiran pita diagnosa
dengan ukuran 780 bp yang dihubungkan dengan reproduksi spesifik dari gen primer dari rolB,
sehingga akar rambut transgenik dapat dikonfirmasi. Konsentrasi dari produksi noradrenalin
dalam akar dapat dievaluasi menggunakan HPLC. Hasil kita menunjukkan konsentrasi dari
rambut akar (garis-A) mempunyai kelipatan hingga 12 kali dari pada akar normal (Non-HR).
Kata kunci: Portulaca oleracea, Noradrenalin, pembentukan rambut akar, starin AR15834,
PCR.
BAB I
PENDAHULUAN
Portulaca oleracea merupakan tanaman hias yang banyak tumbuh di daerah beriklim
sedang dan dapat tumbuh hingga 30 cm, secara umum digunakan sebagai tanaman obat dalam
pengobatan tradisional dan makanan. Karena tanaman ini kaya protein, flavonoid, dopamin, dan
noradrenalin yang memiliki kegunaan untuk terapi anti septik, anti spasmodik, diuretik,
antipiretik, antioksidan yang berguna untuk memperkuat sistem kekebalan tubuh dan
pembersihan darah (Kumar & Kanwar, 2007).
Noradrenalin adalah katekolamin dengan peran ganda seperti membuat keputusan dengan
cepat, meningkatkan kewaspadaan, fokus, energi (Haeri Rohani, 1380) dan secara langsung
meningkatkan denyut jantung, memicu pelepasan glukosa dari menyimpan energi, dan
meningkatkan aliran darah ke otot rangka (Henka et al.2010) sebagai agent anti inflamasi yang
akan dilepas di otak dan efektif dalam mengobati neurologis dan penyakit yang gampang
terkejut (Rentang, 2003).
Banyak tanaman telah diteliti untuk menghasilkan metabolit sekunder
dengan
menggunakan bioteknologi seperti kultur sel dan lain-lain. Secara umum, pada in vitro kultur sel
dan organ untuk produksi metabolit sekunder yang berbeda, biasanya ditemukan suatu
keberhasilan yang terbatas karena hasil yang rendah dan ketidakstabilan genetik. Dalam
beberapa tahun terakhir, banyak peneliti memperhatikan inokulasi dan produksi akar rambut oleh
Infeksi dengan gram negatif bakteri Agrobacterium rhizogenes tanah. Bakteri ini bertindak
sebagai faktor alami untuk transformasi yang merupakan penyebab tumbuhnya akar rambut
transgenik pada tanaman (Binns,2002). Akar-akar rambut dapat tumbuh dengan cepat tanpa
adanya zat pengatur tumbuh eksogen (Phytohormones), tanpa menghilangkan beda fenotipe
mereka dan untuk menghasilkan jumlah metabolit sekunder yang lebih tinggi dibandingkan
dengan kultur suspensi dan bahkan kultur sel induk. Diperlukan sepotong plasmid bakteri
Tanaman seperti gen rolB dalam fitur ini.
Ketika bakteri menginfeksi tanaman, T-DNA antara daerah TR dan TL dari Ri-plasmid
dalam bakteri ditransfer dan diintegrasikan ke dalam kompleks gen dari tanaman inang.
Virulensi gen yang membentuk wilayah vir dari Ri plasmid, dan gen CHV ditemukan pada
kromosom bakteri menengahi transfer T-DNA (Kayser & Quax 2007). Spesies tanaman bandel
untuk transformasi dapat diubah dnegan mendorong gen vir tersebut dari bakteri oleh molekul
sinyal atau dapat dicapai secara in vitro oleh co-budidaya. Agrobacterium dengan jaringan yang
terluka atau dalam media yang mengandung molekul sinyal Transformasi Proses menghasilkan
berharga oleh-produk, akar berbulu, yang akan terbentuk pada atau dekat tempat infeksi (Et
al.1982 Chilton).
Akar serabut tumbuh pesat, menunjukkan pertumbuhan plagiotropic, dan bercabang pada
phytohormone bebas media. Akar-akar tumbuh cepat berbulu memiliki kapasitas biosintesis
tinggi, khususnya akar yang melekat pada metabolit seperti yang ditemukan di akar aslinya in
vivo dan mereka juga dapat digunakan sebagai sumber berkelanjutan untuk produksi metabolit
sekunder yang berharga. Berbeda dengan ketidakstabilan dan variabilitasterorganisir suspensi sel
tanaman, akar berubah mampu menumbuhkan tanaman yang layak secara keseluruhan dan
menjaga stabilitas genetik mereka selama subkultur lanjut dan regenerasi tanaman. Banyak
peneliti tekun berupaya untuk menghasilkan metabolit yang diinginkan berasal dari akar berbulu
(Kittipongpatana et al. 1998).
Untuk berhasil dalam membangun sistem kultur akar rambut untuk jenis tanaman
tertentu, beberapa penting kondisi harus diambil dalam pertimbangan. Beberapa faktor termasuk
jenis dan umur eksplan,konsentrasi dan beda strain Agrobacterium rhizogenes yang efektif dalam
produksi dan meningkatkan akar rambut transgenik tanaman.Dalam penelitian ini, kami
melaporkan produksi akar rambut berubah dalam Portulaca oleracea oleh Agrobacterium
rhizogenes di dalam kondisi in vitro dan diperiksa faktor yang mempengaruhi meningkatnya
induksi akar rambut transgenik Portulaca oleracea untuk meningkatkan produksi noradrenalin di
akar rambut transgenik tanaman ini dari akar normal.
BAB II
BAHAN dan METODE
2.1. Bahan Tumbuhan
Benih Portulaca oleraca diambil dari kebun Hamedan pada Oktober 1989 dan dikirim ke
laboratorium pada kondisi aliran Laminar, disterilisasi dengan 2% NaOCl dan dibilas dengan air
distilasi steril. Kemudian di cawan petri mengandung ½ medium kultur MS.
2.2. Persiapan Bakteri
Untuk persiapan kultur suspensi dari Agrobacterium rhizogenes yang didapat dari Biotechnology
Research Center, Karaj, Iran. Koloni dari bakteri Agrobacterium rhizogenes tumbuh pada
medium padat LB yang dipindah dan dikultur di 10 mL medium cair LB yang mengandung 50
mg/L antibotik rifampin pada kondisi steril. Untuk langkah selanjutnya medium cair LB
dikontaminasi dengan bakteri yang ditransfer ke kamar pertumbuhan dengan 28 oC dan dikocok
dalam Shaker dengan kecepatan 110 rpm untuk 24 jam di kondisi gelap, sampai bakteri tumbuh
dan aktif. Setelah periode ini, konsentrasi suspensi bakteri ditentukan dengan menggunakan
spektofotometer model Lambda 45UV/Tampak di OD600 (Optical Density). Untuk transformasi,
OD diatur pada panjang gelombang 600 nm antara 0/2 hingga 0/8 dan kemudian digunakan
untuk infeksi eksplant bakteri.
2.3. Induksi dan Produksi Akar Rambut
Tiga tipe jaringan (daun, batang, akar) dari 14 hingga 56 hari lamanya bibit berkecambah
digunakan sebagai eksplan untuk menginfeksi. Eksplan dipotong untuk inokulasi dengan bakteri
dan kemudian dipindahkan di suspensi LB yang mengandung bakteri aktif dalam 20 menit.
Setelah periode infeksi untuk bakteri cocultivation selesai, eksplan dipindah ke cawan petri yang
mengandung ½ medium MS tanpa hormone, antibotik dan diletakkan di kamar pertumbuhan
yang gelap dengan temperatur 25oC. Pada waktu yang sama, jumlah eksplan sebagai bukti (tanpa
meletakkan bakteri di suspensi) yang diletakkan di ½ medium MS. Setelah 48 jam kokultivasi,
untuk memindahkan bakteri, eksplan dipindah ke ½ medium MS yang mengandung antibiotic
cefotaxine.
2.4. Faktor diperiksa dalam optimalisasi transgenic
Untuk meningkatkan transgenik di P. oleraca beberapa faktor dipelajari dalam rancangan acak
lengkap. Setiap treatmen dievaluasi di triplicate dan untuk setiap pengulangan dipertimbangkan
10 eksplan. Untuk mereview informasi yang diperoleh, software Excel 2007 dan software SAS
9,1 digunakan untuk membuat diagram dan analisis variasi treatment test berturutan.
2.5. Faktor yang diperiksa meliputi :
1. Tipe eksplan : eksplan berbeda dari daun, batang dan akar yang digunakan
2. Umur eksplan : bibit dari variasi umur 14, 28 dan 56 hari dipelajari
3. Strain berbeda dari A.rhizogenes : AR15834, A4, C318, 9435 untuk menentukan strain
terbaik yang digunakan untuk kontaminasi pada tumbuhan
4. Konsentrasi bakteri : suspense bakteri pada konsentrasi 2/0, 4/0, 6/0 dan 8/0 digunakan
untuk menginfeksi
2.6. Konfirmasi molecular dari akar transgenic
Setelah pengembangan akar rambut, untuk konfirmasi molecular dari akar transgenic, setelah
beberapa langkah dari subkultur di antibiotic yang mengandung medium dan memastikan
pemindahan bakteri komplit, ekstraksi DNA dilakukan dengan metode Cai dkk dan teknik PCR
digunakan dengan primer spesifik gen rol B T-DNA ke dalam genome tumbuhan.
2.7. Ekstraksi dan penentuan noradenaline dari akar transgenic
Setelah pembentukan akar rambut, empat baris dipilih dari akar yang memiliki pertumbuhan
yang baik dan dipotong dalam 3*3 potongan dan kemudian dipindahkan ke 250 mL labu
Erlenmeyer disegel dengan parafilm dan diletakkan pada suhu 25oC dengan periode
pertumbuhan 16 jam siang dan 8 jam gelap dalam shaker elektrik dengan 110 rpm untuk 4
minggu. Setelah 4 minggu, metode Chen dan kampus digunakan untuk ekstraksi noradenaline.
Juga system HPLC dengan c18 kolom (25 cm x 4,6 mm) dan detector UV, digunakan untuk
penentuan kuantitatif noradenaline. Fase gerak mengandung 0/02 molar larutan dari KH2PO4
(95%), asetonitrile (5%), pH 3 dan panjang gelombang 280 nm.
Tiga replikasi dari setiap treatment termasuk dan test dikonduksi di design acak komplet.
BAB III
HASIL DAN PEMBAHASAN
3.1. Induksi akar transgenik
Hasil awal dari benih yang disterilkan dan dikulturkan dalam ½ MS medium cair menunjukkan
pengecambahan biji dan produksi bibit setelah 3 hari, sehingga digunakan untuk produksi
eksplan. Hasil dari variabel umur dari pembibitan menunjukkan bahwa 14 hari pembibitan lebih
besar dari pembibitan 28 dan 56 hari direaksikan dengan agrobacterium rhizogenes. Frekuensi
dari transgenic dalam pembibitan 14 hari mencapai 62% dimana angka tersebut merupakan
angka tertinggi yang ditunjukkan pada perbedaan yang signifikan dari pada 28 dan 56 hari. (pada
gambar a)
gambar 2 a dan b
Hasil dari gambar 2b menunjukkan bahwa jaringan pada daun, batang dan akar digunakan
sebagai eksplan, level dalam eksplan daun bertangkai ternyata lebih tinggi dari eksplan yang lain
sehingga pada level 5 % ditunjukkan perbedaan yang signifikan dengan eksplan yang lain.
Tingginya persentasi dari dari daun transgenic dapad dihubungkan dengan tingginya sensitivitas
dari eksplan daun terhadap bakteri daripada hubungan yang lain, yang mana sensitivitas ini
bergantung pada kondisi fisiologi dari jaringan (Pavar&Maheshvari,2003). Hamill 2003
melaporkan efek kunci rol gen dalam jalan auksin dan sitikinin tidak aktif menjadi aktif
dilakukan pada perbedaan antara seluruh eksplan transgenic dari tanaman. Juga beberapa
penelitian menunjukan bahwa umur eksplan dapat berefek banyak pada limpahan produksi dari
akar rambut karena umur eksplan berefek pada fisat fisik dari sel dan berakibat pada kemampuan
membentuk transgenic (Mehrotra, 2008). Jaringam meristem dan bagian yang muda biasanya
merupakan mempunyai daya tumbuh yang tinggi dan oleh karena itu bagian tersebut cocok
untuk dijadikan transgenic, tanaman lebih tua biasanya pengerasannya lebih rendah.
Pertambahan umur tanaman dan organ tanaman ini menyebabkan diferensiasi berlebihan pada
jaringan dan sel. Dan oleh sebab itu pada kemampuan proliferasi sel dan kemampuannya untuk
sesuai dengan faktor yang menyebabkan penyakit (Bageri&Safari,1887)
Hitungan strain terbaik untuk infeksi dan produksi akar dalam penambahan menggunakan
AR15834, strain A4, 9435 dan C318 yang juga digunakan. Hasil terdapat pada gambar 3-a
menmunjukkan bahwa kecepatan transgenic yang tinggi dengan frekuensi 66% didapatkan dari
penggunaan strain AR15834, statistic dari kstrain menunjukkan perbedaan yang signifikan pada
level 5%.
Gambar 3 a dan b
(gambar 3-a) efek dari perbedaan strain dari A. rhizogenes pada perubahan produksi akar
rambut, b) efek dari perbadaan konsentrasi A. rhizogenes pada perubahan produksi akar rambut,
Hasil yang didapatkan mengindikasikan hasil yang sama dengan penelitian Kamada et al
(Kamada et al, 1986) dan Manu et al, 1986, yang pertama kali untuk produksi tropane alkaloid
menggunakan agrobakteria rhizogenes strain ATCC15834 pada tanaman Atropa belladonna dan
Scopolia japonica, akar rambut tapat dimunculkan secara sempurna. Menurut penelitian ini
kesuksesan pembantukan tanaman transgenic dari strain karena sensitifitas yang tinggi dari
tanaman pada strain bakteri. Hasil dari induksi akar rambut transgenic menunjukkan bahwa
banyaknya variatas dari pertumbuhan akar diamati setelah co-cultivation dengan A.rhizogenes.
Batra dan Colleague melaporkan bahwa masuknya TL dan TR atau salah satunya dapat
menyebabkan pada pertumbuhan dan morfologi pada pada produksi akar karena mereka dapat
merubah kesetimbangan hormone pada akar ini. Tiwari dan colleague melaporkan pada
penelitian dari akar rambut, ada hubungan secara langsung antara ekspresi rolB, pertumbuhan
akar dan cabang lateral dari akar rambut. Keuntungan, termasuk kecepatan tumbuh, waktu
pergandaan rendah, pemeliharaan yang rendah dan kemampuan tuntuk sintesis berbagai senyawa
kimia dari akar rambut terdapat pada teknik ini seperti sumber penting dan permanen dari
metabolit sekunder yang berharga. Akar rambut dapat tumbuh tak terbatas pada medium bebas
hormon dan juga karena sifat khas memiliki stabilitas genetik dan produksi metabolit sekunder
pada level tinggi
Hasil keseluruhan menunjukkan bahwa agrobakterium rhizogenes strain AR15834 dengan
konsentrasi 0/6 sukses untuk kontaminasi dan induksi akar ranmbut dalam 14 hari eksplan daun
tua dari P.oleracea (gambar 4)
Gambar 4. pembentukan akar rambut Portulaca Oleracea dari agrobakterium rhizogenes a) 14
hari pembibitan kecambah dari bibit P.oleracea. b) potongan daun dan inkubasi dengan suspensi
bakteri kemudian di transfer ke medium 1/2MS c) produksi pembentukan akar dengan potongan
eksplan d) perpanjangan pembentukan akar pada medium pada 1/2MS termasuk cefatoxim e)
kecepatan tumbuh dari pembentukan akar pada medium cair.
2.2. Konfirmasi molekul dari akar rambut transgenik
Ditunjukan pada gambar 5, hasil dari elektroforesis gel mengungkapkan kegadiran gen rolB pada
dalam akar rambut.
2.3. Evaluasi Produksi Noradrenaline
Satu dari aplikasi penting akar rambut adalah produksi atau meningkatkan produksi dari
metabolit sekunder dibanding akar biasa. Sebagai pengertiannya dalam Bahan dan Metode,
tingkat noradrenaline ditentukan dengan sistem HPLC menggunakan noradrenaline standard dan
Rt yang berhubungan dengan metabolit ini ditentukan secara akurat menggunakan standard.
Seperti yang ditunjukkan dalam Gambar 6, puncak yang berhubungan dengan metabolit
sekunder noradrenaline ditunjukkan dalam 3/09 menit.
Gambar 6 : Kromatogram HPLC, 280 nm panjang gelombang terdeteksi. Untuk pembelajaran
dari noradrenaline. A : Jumlah noradrenaline dari akar biasa. B : Jumlah noradrenaline dari akar
rambut.
Hasil dari pengukuran jumlah noradrenaline di kontro bari akar dan bari akar rambut
menunjukkan bahwa tingkat noradrenaline di akar terkontrol adalah 0/002 mg per gram berat
kering. Hasil mengindikasikan perbedaan signifikan antara jumlah produksi noradrenaline dari
akar rambut dibanding akar normal. Seperti yang ditunjukkan di Tabel 1, tingkat produksi
noradrenaline di akar rambut transgenik, secara signifikan lebih banyak jumlah produksi
metabolit ini di akar kontrol. Jumlah terbanyak dari noradrenaline didapat dari akar rambut
transgenik (baris A) yaitu 0/025 mg per gram bahan kering yang 12 kali lebih besar diamati di
perbandingan dengan akar kontrol. Sehingga, menggunakan teknik akar rambut, jumlah
noradrenaline yang ditunjukkan meningkatkan akar rambut dibanding akar kontrol. Nilai yang
ditunjukkan dikalkulasi menggunakan LSD pada tingkat 1%.
Tabel 1 : Jumlah noradrenaline di bari A-D (mg/g berat kering), kata berbeda lebih baik untuk
secara statistik signifikan secara tinggi (p<0/01).
Hasil mengindikasikan bahwa seluruh 4 baris menunjukkan
perbedaan signifikan dengan
kontrol (non-HR) dan baris A dan C bersama-sama dengan baris B dan D juga signifikan pada
tingkat 1%. Giri & Narso 2000 melaporkan bahwa perbedaan dalam jumlah produksi metabolit
sekunder antara baris dapat dikarenakan perbedaan jumlah T-DNA copy input ke genom
tumbuhan dan perbedaan pola ekspresi gen T-DNA di baris akar rambut. Hal itu mungkin alasan
utama dari perbedaan ini. Perbedaan penyimpangan T-DNA ke genome tumbuhan. Tenae dkk
juga melaporkan bahwa peningkatan biomassa dapat dikarenakan efek gen rol dalam divisi sel
sehingga meningkatkan metabolit biosintesis potensial.
Secara umum, tingkat noradrenaline secara signifikan naik di akar transgenik yang dapat
digunakan pada bidang farmaseutikal, kimia, komersial dll.