Untitled - Portal Garuda

"";
Bul. Agron. (31)(2) 63- 67 (2003)
k~ena itu penerapante~
-
,
: -'c..'c:
I ;;;~;;
~~~
:;~~~~~"";;
rekayasagenetika dapat
.il~"
BAHAN DAN METODE
dlgunakanuntuk mengataslpermasalahan
tersebut.
Teknik
rekarasa genetika p.ada tanamankentangdapat
d lakukan
Konstruk..\"i
GenHordothionin dan PenyiapanBakteri
. .
Gen hordothiomn yang terdapat pada plasmid
p~INPLUSth (pDFI030) (koleksi Dr. Willem J.
Sttek~mada~ CPRO-DLO ~elanda) terdiri daTi tiga
domain,. !attu, sekuen .SI~nal peptida, sekuen
hor~othlomn daD sekuenacIdIc peptida yang berasal
'
t~z~
:t:~~;
I ,;.;;
I
dengan berbagat cara antara lain dengan
bantuanAgrobacteriumtumefaciens(Stiekema,1988).
Beberapagen-genpenyandi peptida anti mikroba
yang digunakan dalarn rekayasa genetika untuk
~en~pa~an ketahananterhadappenyakitbakteri telah
dlapl1kasikan pada tanarnan solanaceae, khususnya
:..
tanarnan tembakau yang umunya dipakai sebagai model
~
I
dalarn sistem.transformasi. Beberapabasil penelitian
yan~ t~~ahdll~
memberikan basil yang cukup
menjanjikan dl masa mendatanguntuk mendapatkan
tanam.anyan~ mempunyai resistensiterhadapbakteri,
sepertlcecropm,attacin, tachyplesinI dan thionin.
Hordothionin, yaitu thionin yang terdapat pada
endospermatanarnanbarley adalah snatu protein anti
bakteri yang dapat meningkatkan resistensi tanaman
terhadap serangan bakteri berdasarkan penelitian
Florack. e~ al. (1994), yang menggunakan gen
hordothiomn yang ditransformasikan pada tanaman
te~bakau dan menunjukkan adanya toksisitas invitro
d~ tanarnan tembakau terhadap beberapapenyakit
sItus .Ec~R!/~~mHl p~da pBINPLUS (Garnbar I).
Plasffild 1m di.mtroduksikankedalarn Eschericia coli
DH5~ .(kolek.sl Dr. Suharsono,Lab. Genetika Pusat
Penel1ttan Bloteknologi lPB) sebagai inang untuk
memperbanyak dan selanjutnya dintroduksikan ke
dal~ Agro~~cterium tumefaciensLBA 4404 (koleksi
Balat Penel1ttanPerkebunanKaret Taman Kencana
Bogor) denganmetodakonjugasitiga tetna (triparental
mating) denganbantuanbakteri penolongE. coli HE 10I
(p~
~013~ (koleksi Dr. Antonius Suwanto, Lab
MikroblOlogI Pusat Penelitian Bioteknologi lPB).
B.akteri basil triparental mating ini selanjutnya
dlgunakanuntuk mentransformasitanamankentang.
,
akibat serangan bakteri pada tanaman solanaceae.
!
Penelitianini bertujuanuntuk mendapatkan
tanarnan
;~~
:
!
C.j:
kenta~g transgenik yang resisteD terhadap penyakit
pCPO5 (Florack et al., 1994) dan diklonkan pada
..
bakten.
i
',
,
:,
.
,
,
;
s
"Of
r
Hordothionin
expr~~;~~3~ector
10kb
\
Signalpeptida
Hordothionin
Acidic polipeptida
p
nos
NPTII
:::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::1111::11~~~:::::::::::::::
::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::~~:~1::::1:::~::::::
~
~
~
~~
~
;
GEN
on pBR
g4
~
LB
I
GarnbarI. Petapla.s~dpBINPL~~th (pDFIO~O).G~nhor~othionin dengantiga domainyaitu: signal peptida,gen
hordothlonm dan aCIdic polypepttda dnnsersikan pada plasmid pBINPLUS menghasilkan plasmid
pBINPLUSth (pDFI030).
:
i
Persiapan. Eksplan, Transformasi, Kokultivasi dan
Regenerasl
!
Eksplan mas batang (internodus) dari tanarnan
kentangin vitro kultivar atlantik (koleksiProf. Dr. G. A.
Wattimena, Lab Bioteknologi Tanaman Jurusan
B.u~idaya Pertanian lPB) yang berornur 4 minggu
dlslapkan dalarn cawan petri,
"
dan ditransformasi
penambahan antibiotika kanarnisin 100 mg/l daD
ti
.
.
ce otaxime 500 mgil. Subkultur dllakukan dengan
pemi~dahanke mediumyang sarna2minggu sekaliatau
ses~ kebutuhan dan eksplan yang bertunas
dlpmdahkan ke medium pengakarandengan penambahankanamysin100mg/l daDcefotaxime250 mg/l.
..
dengan kultur bakteri LBA 4404 (pDF 1030) selarna 15
AnahslS Tanaman Transgenik
menit. ~elanjutnyaeksplan di~okultivasi sel~ma2 hari
daD dltanarn dalarn medIa regenerasl dengan
Tanaman yang mampu bertahan tumbuh dalam
medium seleksikanamisin selanjutnyadiuji keberadaan
,
64
Nurhasanah,G. A. Wattimena,Agus Purwito, Ni Made Annini Wiendi, Suharsono
,
'ci!'o~~~;,,:,,-
-
--
Bul. Agron. (31) (2) 63 67 (2003)
1:;:',,[
c
.:
I
!
gennya dengan analisa PCR dengan menggunakan
I
primer dari promotor CaMv 35S, yaitu 5'-
telah ditransformasidenganLBA 4404 (pDF1030)
t
CTGCATGCTTCACGGTGCAAGC-3
(forward
primer) daD 3'-CAAGCGAGGAGGTGCGACTTC-5
(reverse primer). Kondisi PCR dilakukan pada
setelah enam minggu dalam media regenerasiyang
mengandungkanamisin,mulai beregenerasimembentuk
tunas yang didahului denganpembentukankalus pada
denaturasi awal 94°C 2 menit, denaturasi 94 °C 1 menit,
eksplan
annealing56 °C 1 menit,extension72°C2 menit(35
ditransformasidengan AgrobacteriumLBA 4404
siklus).
kosong (tanpa plasmid pDF1030) yang digunakan
juga dilakukan untuk menguji ketahanannyaterhadap
Ralstonia solanacearum. Tanaman transgenik yang
berumur 4 minggu diinokulasi secarain vitro dengan
inokulum yang berasal dari kentang pada konsentrasi
1.2 X 109Colony Forming Unit (CFU) per ml bakteri.
lnokulasi dilakukan dengan menggunting daun
kedua/ketigadari pucuk denganmenggunakanglinting
yang dicelup dengan inokulum bakteri setiap kali
infeksi. Tanamanyang telah diinokulasi diinkubasipada
suhu 20-25°C daD dilakukan pengamatan terhadap
periodeinkubasidaDkejadianpenyakit.
dipindahkan ke medium regenerasimulai menguning
daD mati. Hal ini menunjukkan ketidak mampuan
tanaman atlantik normal untuk tumbuh di dalam
mediumyangmengandungkanamisin.
Sebagian besar ku1tur dari eksplan yang
ditransformasi yang tidak mampu membentuk tunas
selanjutnyamulai menguningdan mati. Kematiankultur
yang ditransformasi ini dapat diakibatkan oleh
kegagalantransformasieksplan sehinggatidak mampu
bertahandalam medium yang mengandungkanamicin.
Barret et al. (1997), menyatakan bahwa kerugian
transformasi genetik tanaman dengan menggunakan
Agrobacteriumdikarenakanbanyaknyaterjadi kematian
kultur yang dapat diakibatkanoleh kontaminasibakteri
Agrobacterium yang tidak terbunuh oleh antibiotik
cefotaxime karena sulitnya untuk mengeliminasi
pertumbuhan Agrobacterium sehingga mengganggu
pertumbuhan kultur daD mengakibatkan kematian
karena tingginya konsentrasi antibiotik pembunuh
Agrobacterium yang ditambahkan kedalam media
regenerasi.
.
I
t
Analisatoksisitasinvitro padatanamantransgenik
,
HASIL DAN PEMBAHASAN
Gen hordothionin dalam plasmid pDF 1030 telah
berhasil diintroduksikan ke dalam E. coli DH5a yang
digunakansebagaiinang untuk memperbanyakplasmid.
Metoda triparental mating yang dilakukan juga telah
berhasil memindahkanplasmid pDF 1030 ke dalam
Agrobacterium strain LBA 4404. Koloni LBA 4404
(pDF 1030)ini selanjutnyadigunakanuntuk mentransformasitanamankentang.
Eksplan tanaman kentang kultivar atlantik yang
(Gambar
2).
Tanaman
atlantik
yang
sebagaikontrol mulai daTiminggupertamasetelah
~c
-+
...
Gambar2. Perkembangan
eksplanpadamediaregenerasi: a. Eksplanbertunasb. eksplanmenguningdaDmati
. Kultur yangbertunassetelahdipindahkanke dalam
medlu~ pengakaranyang mengandungkanamisin dan
cefotaxlmemampumembentukakar setelah1-2 minggu
di dalam medium pengakaran. Dari 500 eksplanyang
ditransformasidiperoleh 22 kultur dugaan transgenik
yang mampu tumbuh denganbaik menjadiplantlet di
dalammediumseleksikanamisin.Selanjutnyakultur ini
diperbanyakdenganstek satu nodus di dalam medium
kultur yang ditambah kanamisin untuk dilakukan
pengujianlanjutan.
Transfromasi
GenetikTanaman
KentangCV. Atlantik...
.':~
65
~~~~~;;;;t;;;,ccc~£~
,:-",,~i~~~C
;
:j.r
Bur. Agron.
(31) (2) 63
-
67 (2003)
,
.
i{
~
,,
i
!,
:
11
Dari basil analisis PCR dengan menggunakan
tanamankentang. Sedangkantanaman-tanaman
lainnya
primer dari promotor 35S CaMV yang dilakukan pada
yang tahan terhadap media kanamisin (lolos dari media
22 tanaman dugaan transgenik didapatkan 4 tanaman
yang positif dapat teramplifikasi (Gambar 3) yang
ditunjukkan dengan munculnya pita pada ukuran
:t400bp. Hal ini menunjukkan bahwa gen yang
diintroduksikan berhasil masuk ke dalam genom
seleksi kanamisin) tetapi tidak memberikan basil positif
daTi uji PCR mungkin merupakan tanaman yang tumbuh
dari bagian sel eksplan yang tidak bersentuhan dengan
medium kanarnisin.
"-"")-\"11.o1""41:11-01'8'138!i
~~
"C'-'
.,
~
~
,
g
".-,j"~
~~
~
'"
2
-.
" ".,
";,,2"...,2__2'_4,02"-._"-"";0,,
t-"
;];
~
" ., , .
',Co
"
, ,: ~
!'!,
~
~
~
Garnbar3. Hasil analisisPCR pada22 tanarnankandidattransgenik(tahanmediumseleksikanamisin),Terlihat adanya
bandpadaukuran:t 400 bp. Marker DNA A.500 bp.
,
~
}
Hasil pengujian toksisitas in vitro terhadap
Ralstoniasolanacearummenunjukkantingkat resistensi
yang bervariasidaTikultur transgenik(Tabel 1). Dimana
dari keempatkultur transgeniktersebuthanya 2 kultur
yang toleran terhadap Ralstonia solanacearum
sedangkan1 diantaranyamoderat tolerant clan 1 lagi
rentan. Tingkat resistensi yang bervariasi ini
dipengaruhi oleh ekspresi dan gen hordothionin yang
diintroduksikan,yaitu olehjumlah protein hordothionin
yang dihasilkan(Florack et al., 1994)tetapi hal ini suiit
dibuktikan karenadalam penelitian ini tidak dilakukan
isolasiprotein hordothionindari tanamantransgenik.
Tabell. Pengujiantoksisitasinvitro terhadapRalstoniasolanacearum
Nomor tanaman
tr
.k
rransgemK
P . d . rob .
eno e m asl
K . d'
k.
eJa
~ Ian penya
. ~ It
12A (Transgenik+)
12B (Transgenik+)
13A (Transgenik+)
28 (Transgenik+)
Atlantik
15
6
9
14
7
15
100
35
15
100
Berdasarkanbasil penelitian ini dapatdisimpulkan
bahwa:
1. Transformasi genetik tanaman kentang dengan
menggunakan Agrobacterium tumefaciens yang
dilakukan mampu meregenerasikan :t5% dari
eksplan menjadi kultur yang dapat tumbuh dalam
!1lediumseleksi.
2. Didapatkan4 kultur transgenikdaTibasil introduksi
gen hordothionin kedalam genom tanamankentang
berdasarkanbasil analisisPCR.
3. Hasil pengujiantoksisitasinvitro terhadapRalstonia
solanacearum,menghasilkan2 tanamantransgenik
yang toleran, 1 kultur moderattoleran clan 1 kultur
rentanterhadappenyakit ihi.
66
T. k
.
.
mg
- at reslstensl
Toleran
Rentan
Moderattoleran
Toleran
Rentan
UCAPAN TERIMA KASIH
ProyekRUT VIII atasnamaAgus Purwito dengan
judul "Metoda Transgenik clan Fusi Protoplas untuk
Merakit Klon Kentang Tahan Penyakit Busuk Lunak
clanLayu Bakteri" yang mendanaipenelitianini.
DAFfAR PUSTAKA
Barret, C., E. Cobb, R. McNicol, G. Lyon. 1997.A risk
assessm~ntstudy of plant genetic transformation
using agrobacteriumand implications for analysis
of transgenicplants. Plant Cell Tissue and Organ
Culture47: 135-144.
NU'ha~.noh'
G.A. Wattimena,
AgusPurwito,Ni MadeArminiWiendi,Suharsono
j
-
Bul. Agron. (31) (2) 63 - 67 (2003)
During, K., M. Fladung,H. L6rz. 1993. Antibacterial
resistanceof transgenicpotatoplantsproducingT4
,
lysozyme do/am Fritig,
-"
Bomard dan
Mahmud, M. 1990. Penyakit bakteri tanamanpangan
dan hortikultura di IndonesiaDa/am Perlindungan
Michel
Tanaman
Legrand. Mechanismsof plant defenseresponses.
Kluwer AcademicPublishers.p. 437-440.
t
(eds).
Prawiroesoemardjo,
S.,
D.
Sudarmadji,Harsono, I. S. Basuki. PT. Agricon.
Hal 233-251.
During, K. 1996. Genetic engineeringfor resistanceto
bacteria in transgenic plants by introduction of
foreign genes.Molecular Breeding.2: 297-305.
Montanelli, .C., A. Chiari, T. ~hiari, F. St~fanini, G.
Nascarl. 1995. EvaluatIon of resIstance to
Pseudomonas so/anacearum in potato under
controlledconditions.Euphytica.81: 35-43.
Florack, D. E. A., W. G. Dirkse, B. Visser, F.
Heidekamp,W. J. Stiekema.1994. Expressionof
biologically active hordothionins in tobacco.
Effects of pre- and pro-sequences
at the amino and
carboxyl termini of the hordothionin precursoron
mature protein expression and sorting. Plant
Molecular Biology. 24: 83-96.
Poehlman,J. M., D. A. Sleper. 1996. Breeding Field
Crops4rd.Iowa StateUniversity Press.494 halo
Rich, A. E. 1983.PotatoDisease.AcademicPress.238
halo
Stiekema,W. J., F. Heidekamp,J. D. Louwerse,H. A.
Verhoeven, P. Djikhuis. 1988. Introducing of
foreign genes into potato cultivars Bintje and
Desiree using an Agrobacterium tumefaciens
binary vector.PlantCells Report.7: 47-50.
Hayward, A. C. 1991. Biology and epidemiology of
bacterial wilt
caused by
Pseudomonas
so/anacearum.Ann. Rev. Phytopathol.29: 65-87.
,.
,
1
,
::::~~:~:t~
;,.
~
!
-,
',"~~'~":;;
30:;
~
"'"
,
~,
..
~.'.
i¥
ti c
-~
~'"
-
~:
,
i
~
~7.
TransfromasiGenetikTanamanKentangCV. Atlantik,..
67