optimasi isolasi rna jaringan kanker payudara

OPTIMASI ISOLASI RNA JARINGAN KANKER PAYUDARA
TERFIKSASI FORMALIN DARI PENDERITA KANKER
PAYUDARA DI RUMAH SAKIT SAIFUL ANWAR MALANG
DENGAN KIT ISOLASI RNA GENEAID
Pearlindah, Dwi Listyorini dan Abdul Gofur
Universitas Negeri Malang
E-mail : [email protected]; [email protected]
ABSTRAK: Isolat RNA total didapat dari jaringan kanker terfiksasi
formalin umumnya berkualitas rendah. Optimasi mendapatkan isolat RNA
total kualitas tinggi sangat diperlukan. Penelitian ini mengukur tingkat rasio
kemurnian A260/280 menggunakan Nanodrop ND 2000 Spektrofotometer.
Berbagai modifikasi protokol isolasi telah dilakukan dengan penambahan
Proteinase K dan tingkat kecepatan sentrifugasi mendapatkan hasil murni
dan stabil, dengan penambahan Proteinase K sebanyak 30 µl dan lama
inkubasi selama 30 menit pada suhu 60oC, serta tingkat kecepatan
sentrifugasi 15.500 x g/16.000 x g.
Kata kunci: isolasi rna, jaringan kanker payudara terfiksasi formalin, penderita
kanker payudara di rumah sakit saiful anwar Malang.
Insiden kanker sebagai salah satu jenis penyakit tidak menular semakin
meningkat. Jika tidak dikendalikan, kejadian ini akan terjadi lebih cepat di negara
miskin dan berkembang (International Union Against Cancer, 2009). Di
Indonesia, kasus kanker yang paling banyak adalah kanker payudara. Sampai
tahun 2012, sudah lebih dari 550 ribu wanita yang melakukan skrining dengan
jumlah suspek tumor payudara 1.289 orang (Kementerian Kesehatan RI, 2013).
Secara tradisional, tumor dipelajari dari hasil histopatologi, namun idealnya untuk
menunjukkan klasifikasi jenis penyakit kanker harus disertai dengan teknik
biologi molekuler. Gen profiling study adalah teknologi untuk mengidentifikasi
gen yang aktif dalam sampel sel atau jaringan (DeRisi et al.,1996; Alizadeh et
al.,1999; Alizadeh et al., 2001; Rew, 2001). Evaluasi seluruh profil ekspresi gen
tumor bisa dilakukan dengan menggunakan RNA, melalui teknik quantitatif realtime polymerase chain reaction (qRT-PCR) (Espinosa et al., 2005).
Isolasi RNA total yang berkualitas tinggi sangat penting untuk
keberhasilan penerapan berbagai teknik molekuler termasuk gen profiling. RNA
dapat terdegradasi dengan cepat oleh ribonukleases (RNases) dan oleh karena itu,
harus diekstraksi dengan cepat dan efisien (Sambrook et al., 1989). Dalam
penelitian ini menggunakan bahan yang segar sangatlah tidak mungkin karena
melanggar etika dari penanganan sampel di Rumah Sakit Saiful Anwar Malang
sehingga bahan yang didapatkan bukan bahan segar melainkan sudah terfiksasi
formalin. Sampel kanker payudara yang didapatkan adalah sampel hasil biopsi
dari 2 penderita kanker payudara yaitu dengan tipe duktus karsinoma invasif
stadium I (jinak) dan duktus karsinoma invasif stadium II (ganas). Kedua sampel
diperoleh dalam bentuk terfiksasi formalin sesuai dengan kode etik penanganan
yaitu sampel kanker payudara hasil bedah biopsi yang telah dilakukan diberikan
pada bagian patologi anatomi di Rumah Sakit Saiful Anwar Malang kemudian
1
langsung dilakukan fiksasi dengan formalin 10 % untuk selanjutnya disimpan dan
digunakan dalam pengecekan sampel melalui berbagai analisis seperti
histopatologi anatomi dan lain-lain.
Formalin adalah fiksatif tradisional yang telah digunakan selama beberapa
dekade untuk mengawetkan jaringan di patologi (Chu et al., 2002; Shi et al.,
2002). Fiksasi formalin yang rutin digunakan dalam patologi dapat menyebabkan
asam nukleat sangat terfragmentasi dengan kualitas yang buruk. RNA yang
berasal dari spesimen tersebut secara signifikan terdegradasi (Lahr et al., 2002),
karena formalin menyebabkan cross-link antara asam nukleat dan protein.
Monomethylol berikatan dengan empat basa RNA (N-CH2OH) dan membentuk
jembatan metilen yang mudah terdegradasi (Masuda et al., 1999). Penyimpanan
jaringan atau sel dalam periode yang panjang sebelum isolasi RNA juga
meningkatkan degradasi RNA, karena molekul ini sangat labil (Catts et al., 2005).
Keberhasilan dalam penelitian yang berhubungan dengan RNA itu
tergantung pada hasil, kemurnian, dan integritas RNA (Bustin et al., 2005; Nolan
et al., 2006). Namun, metode modifikasi isolasi RNA yang berbeda-beda dapat
menghasilkan RNA dengan berbagai tingkat kualitas (Nour et al., 2010; Rump et
al., 2010). Upaya untuk mempertahankan integritas RNA adalah dimulai dari
persiapan sampel hingga penyimpanan sampel untuk mencegah dari kontaminasi
RNase (Santella, 2006), ini bisa dilakukan dengan pembekuan sampel jaringan
dalam nitrogen cair dan selanjutnya penyimpanan pada -80°C sampai akan
diisolasi (Jarzab et al., 2008). Pada prinsipnya optimasi protokol ini bertujuan
melindungi RNA dari degradasi akibat senyawa lain yang dilepaskan ketika sel
dihancurkan atau kerusakan akibat penanganan fisik (Chu et al., 2002; Shi et al.,
2002).
METODE
Mempersiapkan alat dan bahan yaitu pembuatan DEPC treated water, alatalat yang dipakai dalam penelitian seperti microtip dan microtube 1,5 ml harus
disterilisasi menggunakan DEPC treated water terlebih dahulu dan alat- alat
lainnya seperti mortar, pistil, beaker glass, gunting, pinset, cawan petri, dan gelas
ukur disterilisasi kering selama 30 menit pada suhu 157oC yang sebelumnya
dicuci selama 30 menit dalam USC (Ultrasonic Cleaner). Pengambilan jaringan
kanker payudara dari biopsi penderita kanker payudara di Rumah Sakit Saiful
Anwar Malang (RSSA) yaitu langsung difiksasi formalin 10% untuk dapat
dilakukan pemeriksaan oleh bagian Patologi Anatomi RSSA. Sampel yang
didapatkan dari RSSA diberikan oleh bagian Patologi Anatomi RSSA berupa
jaringan kanker payudara yang sudah terfiksasi oleh formalin 10 % dan sudah
tidak digunakan lagi dan sudah diperiksa oleh pihak RSSA. Jaringan kanker
payudara yang diberikan tersebut sudah terfiksasi formalin selama 2 minggu.
Jaringan kanker payudara yang didapatkan dari RSSA dalam keadaan terfiksasi
formalin dibawa ke laboratorium Bioteknologi, Lab. Sentral Fakultas MIPA
Universitas Negeri Malang, mencuci jaringan dengan DEPC treated water hingga
tidak berbau formalin lagi, menyimpan persediaan jaringan kanker jinak dalam
sentrifus tube 14 ml berisi alkohol absolut dan menyimpan dalam suhu 0oC.
Isolasi total RNA jaringan kanker payudara yaitu menimbang bahan yang akan
diisolasi sebanyak 25 mg, kemudian memasukkan dalam tube 1,5 ml lalu
memasukkan dalam termos kecil berisi nitrogen cair dan menyimpan suhu -60oC
2
selama 1 malam, menyalakan UV selama 30 menit pada UV-cleaner sebelum
melakukan isolasi. Isolasi total RNA mengikuti protokol Geneaid dan melakukan
modifikasi protokol beberapa kali hingga menghasilkan protokol yang optimum
dalam melakukan isolasi RNA jaringan kanker payudara terfiksasi formalin
kemudian memeriksa konsentrasi dan kemurnian total RNA yang diperoleh
dengan menggunakan Nanodrop ND 2000 Spektrofotometer.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Berdasarkan modifikasi protokol isolasi RNA jaringan kanker payudara
terfiksasi formalin yang telah dilakukan, hasil total RNA yang didapatkan
menggunakan Nanodrop ND 2000 Spektrofotometer dengan tingkat kemurnian
dan konsentrasi pada rasio A260/280 disajikan pada Tabel 1.
Tabel 1. Total RNA Jaringan Kanker Payudara dalam Fiksasi Formalin.
Protokol Sample
1
Jinak
2
Ganas
Jinak
3
Ganas
Jinak
4
Ganas
Jinak
5
Jinak
6
Jinak
7
Jinak
Rasio Konsentrasi
Tipe
Modifikasi
A260/
RNA
Kontaminasi
280
(ng/µl)
3.37
1.9
Kontaminasi  Sentrifugasi 15.000 x g,
DNA
 Mengikuti prosedur
Geneaid belum modifikasi
2.02
3.9
Murni
 Sentrifugasi 15.500 x g
2.66
4.0
Kontaminasi  Inkubasi saat elusi RNA
DNA
3 menit
1.56
2.8
Kontaminasi  Sentrifugasi 14.000 x g
protein
 Ethanol 1000 µl
1.56
13.1
Kontaminasi  Inkubasi saat elusi RNA
protein
3 menit
1.72
0.7
Kontaminasi  600 µl buffer lisis
protein
 Ethanol 500 µl
1.21
0.6
Kontaminasi  Sentrifugasi 14.000 x g
protein
 Inkubasi saat elusi RNA
3 menit
2.59
4.5
Kontaminasi  Proteinase K 40 µl
DNA
inkubasi 30 menit, vortex
 Sentrifugasi 15.500 x g
 Inkubasi saat elusi RNA
3 menit
2.10
9.5
Murni
 Proteinase K 30 µl
inkubasi 30 menit, vortex
 Sentrifugasi 15.500 x g
 Inkubasi saat elusi RNA
3 menit
2.40
1.5
Kontaminasi  Proteinase K 40 µl
DNA
inkubasi1 jam,
vortex
 Sentrifugasi 15.500 x g
3
8
Jinak
2.28
1.5
Kontaminasi
DNA
9
Jinak
1.53
5.2
Kontaminasi
protein
10
Jinak
1.36
5.0
Kontaminasi
protein
11
Ganas
2.23
2.3
Kontaminasi
DNA
12
Ganas
1.80
4.1
Murni
13
Ganas
2.02
6.8
Murni
14
Jinak
1.86
4.7
Murni
 Inkubasi saat elusi RNA
3 menit
 Proteinase K 30 µl
inkubasi 1 jam,
vortex
 Sentrifugasi 15.500 x g
 Inkubasi saat elusi RNA
3 menit
 Proteinase K 60 µl
inkubasi 30 menit, vortex,
 Sentrifugasi 15.500 x g
 Inkubasi saat elusi RNA
3 menit
 Proteinase K 60 µl
inkubasi 30 menit,
tanpa vortex,
 Sentrifugasi 15.500 x g
 Inkubasi saat elusi RNA
3 menit
 Proteinase K 30 µl
inkubasi 30 menit, vortex,
 Sentrifugasi 15.500 x g
 Inkubasi saat elusi RNA
3 menit
 Proteinase K 30 µl
inkubasi 30 menit,
tanpa vortex,
 Sentrifugasi 15.500 x g
 Inkubasi saat elusi RNA
3 menit
 Proteinase K 30 µl
inkubasi 30 menit, vortex,
 Sentrifugasi 16.000 x g
 Inkubasi saat elusi RNA
3 menit
 Proteinase K 30 µl
inkubasi 30 menit,
tanpa vortex
 Sentrifugasi 16.000 x g
 Inkubasi saat elusi RNA
3 menit
Rasio absorbansi (A260/A280) yaitu antara 1.8-2.1 merupakan kualitas
yang baik pada total RNA (Centre For Proteomic & Genomic Research, 2006),
dalam kisaran tertentu rasio < 1.8 menunjukkan RNA memiliki kontaminasi
4
dengan protein (Ayadi, 2009) dan rasio > 2.1 menunjukkan kontaminasi dengan
DNA (Brisco et al., 1997)
Total RNA yang diisolasi mempunyai kemurnian yang rendah yaitu antara
1.21 - 1.72 yang menunjukkan kontaminasi protein dan total RNA yang melebihi
rasio 2.1 adalah 2.23 - 3.37 rasio ini menunjukkan kontaminasi oleh DNA. Dari
hasil 14 modifikasi protokol yang paling baik adalah terdapat 5 protokol yaitu
pada protokol 2 yaitu 2.02, protokol 6 yaitu 2.10, protokol 12 yaitu 1.80, protokol
13 yaitu 2.02, dan protokol 14 yaitu 1.86. Total RNA dari jaringan kanker
payudara dalam fiksasi formalin menunjukkan konsentrasi yang sangat rendah ini
ditunjukkan pada konsentrasi yang didapatkan paling tinggi adalah 13.1. Hal ini
dimungkinkan jumlah total RNA sudah terdegradasi karena fiksasi formalin (Lahr
et al., 2002) sehingga mengakibatkan rendahnya konsentrasi (Srinivasan et al.,
2002). Meskipun konsentrasi yang dimiliki rendah tetapi dalam teknik isolasi
dengan memurnikan jaringan berasal dari fiksasi formalin telah dapat ditunjukkan
dengan melihat hasil rasio kemurnian yang didapatkan memenuhi standar.
Dari hasil modifikasi protokol yang telah dilakukan diketahui bahwa
modifikasi pada penambahan ethanol dan buffer lisis menunjukkan tidak
berpengaruh pada tingkat kemurniannya karena semua modifikasi protokol
tersebut mendapatkan hasil dengan kontaminasi DNA maupun protein.
Berdasarkan hasil modifikasi protokol yang berpengaruh dalam isolasi dengan
kualitas tinggi tersebut adalah pada protokol dengan kecepatan sentrifugasi 15.500
x g dan kecepatan sentrifugasi 16.000 x g, jumlah Proteinase K sebanyak 30 µl
dan lama inkubasi Proteinase K selama 30 menit pada suhu 60oC. Perlakuan
antara divortex atau tidak divortex pada protokol setelah penambahan Proteinase
K tidak menunjukkan perlakuan tersebut berpengaruh pada tingkat kemurniannya,
karena hasil setelah penambahan Proteinase K sama-sama menunjukkan hasil
dengan tingkat kemurnian dengan kualitas tinggi sehingga dapat diketahui untuk
perlakuan dengan penambahan Proteinase K dapat dipilih kedua cara tersebut
yaitu dengan melakukan vortex pada tiap 10 menit saat inkubasi dilakukan
ataupun bisa dengan cara tanpa menvortex sekalipun. Protokol 2 tanpa
penambahan Proteinase K pada jaringan kanker payudara ganas memberikan hasil
yang murni tetapi pada jaringan kanker payudara jinak menunjukkan kontaminasi
DNA, hasil yang didapatkan dari kedua sampel tersebut tidak stabil, sehingga
untuk lebih baiknya menggunakan protokol dengan tingkat kemurnian yang
ditunjukkan pada kedua sampel yaitu stabil. Protokol 6, 12, 13 dan 14 untuk
jaringan kanker payudara jinak dan ganas pemberian Proteinase K sangat
berpengaruh hal ini terlihat hasil yang didapatkan adalah stabil dan mendapatkan
murni dengan penambahan Proteinase K sebanyak 30 µl, lama inkubasi selama 30
menit pada suhu 60oC. Hal ini menunjukkan bahwa Proteinase K membantu
menghancurkan protein dalam lisat sel (jaringan, kultur sel) dan pelepasan asam
nukleat, karena sangat efektif menonaktifkan DNase dan RNase serta Proteinase
K dapat menghancurkan cross-linking karena fiksasi formalin (Masuda et al.,
1999; Specht et al., 2001; Srinivasan et al., 2002). Pada protokol 11 juga dengan
penambahan Proteinase K sebanyak 30 µl inkubasi selama 30 menit pada suhu
60oC tetapi dinyatakan tidak murni karena didapatkan hasil kontaminan DNA,
dalam hal ini kontaminan protein tidak terlihat karena penambahan Proteinase K
melainkan masih terlihat kontaminan asam nukleat lain seperti DNA sehingga hal
ini memerlukan DNase untuk dapat menghilangkan kontaminan dari DNA dan
5
dapat menstabilkan kemurnian pada total RNA (Jacobs, 2014). Suhu inkubasi
60oC Proteinase K memberikan hasil tanpa kontaminasi protein, karena aktivitas
proteinase K meningkat pada suhu yang tinggi hingga 65°C (ShineGene
Molecular Biotech, 2014). Selain itu secara teknik kecepatan sentrifugasi dalam
modifikasi isolasi RNA menghasilkan RNA yang stabil dan murni yaitu kecepatan
15.500 x g dan kecepatan 16.000 x g.
KESIMPULAN DAN SARAN
Modifikasi protokol Isolasi total RNA yang optimum dari jaringan kanker
payudara ganas dan jinak terfiksasi formalin menggunakan Kit Isolasi RNA
Geneaid yaitu dengan penambahan Proteinase K sebanyak 30 µl inkubasi selama
30 menit pada suhu 30oC dan tingkat kecepatan sentrifugasi 15.500 x g atau
16.000 x g menghasilkan total RNA murni. Bahan yang digunakan dalam
penelitian isolasi RNA sebaiknya menggunakan bahan segar untuk mendapatkan
tingkat konsentrasi dan kemurnian dengan kualitas tinggi karena RNA sifatnya
mudah terdegradasi dan penyimpanan bahan yang telah didapatkan harus segera
di perlakukan dengan baik dengan menambahkan nitrogen cair dan
menyimpannya sekurangnya pada suhu -60oC serta berdasarkan hasil isolasi RNA
yang didapatkan menunjukkan kontaminasi DNA sehingga memerlukan
penambahan DNAse.
DAFTAR RUJUKAN
Alizadeh, A., Eisen, M., Davis, R. E., Ma, C., Sabet, H., Tran, T., Powell, J. I.,
Yang, L., Marti. G. E.,Moore, D. T., Hudson, J. R., Chan, W. C., Greiner,
T., Weisenburger, D., Armitage, J. O.,Lossos, I., Levy, R., Botstein, D.,
Brown, P. O. & Staudt, L. M. 1999. The lymphochip: a specialized cDNA
microarray for the genomic-scale analysis of gene Thomas et al. Journal of
Clinical Bioinformatics 2013, 3:10 Page 10 of 11
http://www.jclinbioinformatics.com/content/3/1/10expression in normal and
malignant lymphocytes. Cold Spring HarbSymp Quant Biol. 64: 71 -78.
Alizadeh, A., Ross, D. T., Perou, C. M. & Van de Rijn, M. 2001. Towards a novel
classification of human malignancies based on gene expression patterns. J.
Pathol. 195: 41–52.
Ayadi, Mira. 2009. DNA/RNA Extraction & Qualification Version 1.0. The
Quality Control Platform Of Saint Louis.
Brisco, Paula., Sankbeil, Jacqui. & Kephart, Dan. 1997. RNA Purification: A
Rapid and Versatile Protocol for the Isolation of Total RNA. Promega
Corporation 64: p. 07.
Bustin, SA., Benes, V., Nolan. T. & Pfaffl, MW. 2005. Quantitative real-time RTPCR a perspective. J. Mol. Endocrinol. 34: 597-601.
Catts, V. S., Fernandez, H. R., Taylor, J. M., Coulson, E. J. & Lutze-Mann, L. H.
2005. A microarray study of post-mortem mRNA degradationin mouse brain
tissue. Mol. Brain Res. 138: 164-177.
Centre For Proteomic & Genomic Research. 2006. Target Gene Expression. South
Africa: Institute for Infectious Diseases and Molecular Medicine, Faculty of
Health Science.
Chu,W. S., Furusato, B., Wong, K., Sesterhenn, I.A., Mostofi, F. K., Wei, M. Q.,
Zhu, Z., Abbondanzo, S. L. & Liang, Q. 2005. Ultrasound-accelerated
6
formalin fixation of tissue improves morphology, antigen and mRNA preservation. Mod. Pathol. 18: 850-63.
DeRisi, J., Penland, L., Brown, P. O., Bittner, M. L., Meltzer, P. S., Ray, M.,
Chen, Y., Su,YA. & Trent, J. M. 1996. Use of a cDNA microarray to
analyse gene expression patternsin human cancer. Nat. Genet. 14: 457 - 460.
Espinosa, E., Vara, J.A. Fresno., Redondo, A., Sa´nchez, J.J., Hardisson, D.,
Zamora, P., Go´mez Pastrana, F., Cejas, P., Martı´nez, B., Sua´rez, A.,
Calero, F. & Gonza´lez Baro´n, M. 2005.Breast cancer prognosis determined
by gene expression profiling: a quantitative reverse transcriptase polymerase
chain reaction study. J. Clin. Oncol. 23: 7278-7285.
International Union Against Cancer. 2009. 48th ICCA Congress & Exhibition.
(Online), (www.iccaworld.com), diakses 5 desember 2013.
Jacobs, David. 2014. DNase Treatment of RNA. Austin: University of Texas, The
Functional Genomics Research Stream.
Jarząb, M., Różanowski, P., Kowalska, M., Żebracka, J., Rudnicka, L., Stobiecka
E., Jarząb,B., Stachura, J. & Pawlęga, J. 2008. Optimization of the Method
of RNA Isolation from Paraffin Blocks to Assess Gene Expression in Breast
Cancer. Pol. J. Pathol. 59(2): 85–91.
Kemenkes RI. 2013. Seminar Sehari dalam Rangka Memperingati Hari Kanker
Sedunia 2013.(Online),
(http://www.depkes.go.id/index.php?vw=2&id=2233), diakses 23 Januari
2014.
Lahr, G., Starzinski-Powitz, A. & Mayer, A. 2002. Analysis of specific gene
expression. In: Conn PM (Ed) Methods in Enzymology 356: pp 271–281.
Academic Press, San Diego, USA.
Masuda, N., Ohnishi, T., Kawamoto, S., Monden, M. & Okubo, K. 1999. Analysis
of chemical modification of RNA from formalin-fixed samples and
optimization of molecular biology applications for such samples. Nucleic
Acids Res. 27: 4436-4443.
Nolan, T., Hands, RE., Bustin, SA. 2006. Quantification of mRNA using real-time
RT-PCR. Nat. Protoc. 1: 1559-1582.
Nour, AM., Barbour, EK., Depint, F., Dooms, M., Niang, K., Dulac, A., Niamba,
CN., Chaaya, G., Pouillart, PR. 2010. Comparison of five RNA extraction
methods from rabbit’s blood. Agriculture and Biology Journal of North
America 1: 448-450.
Rew, DA. 2001. DNA microarray technology in cancer research. Eur. J. Surg.
Oncol. 27: 504–508.
Rump, LV., Asamoah, B., Gonzalez-Escalona, N. 2010. Comparison of
commercial RNA extraction kits for preparation of DNA-free total RNA
from Salmonella cells. BMC Res. Notes 3: 211.
Sambrook, J., Fritsch, E. F. & Maniatis, T.1989. Molecular Cloning: A
Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NY.
Santella, Regina M. 2006. Approaches to DNA/RNA Extraction and Whole
Genome Amplification. Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev 15:1585-1587.
ShineGene Molecular Biotech. Proteinase-K. WuheRoad, Shanghai, 201109,
China. (Online), (www.synthesisgene.com), diakses 2 Juni 2014.
Shi, S. R., Cote, R. J., Wu, L., Liu, C., Datar, R., Shi, Y., Liu, D., Lim, H. &
Taylor, C. R.. 2002. DNA extraction from archival formalin-fixed, paraffin-
7
embedded tissue sections based on the antigen retrieval principle: heating
under the influence of pH. J. Histochem. Cytochem. 50: 1005-11.
Specht, K., Richter, T., Muller, U., Walch, A., Werner, M. & Hofler, H. 2001.
Quantitative gene expression analysis in microdissected archival formalinfixed and paraffin embedded tumor tissue. Am J. Pathol. 158: 419–429.
Srinivasan, M., Sedmak, D. & Jewell, S. 2002. Effect of fixatives and tissue
processingonthe content and integrity of nucleic acids. Am J. Pathol. 161:
1961–1971.
8