ANTIBAKTERI DARI BIOTA LAUT Aditya M Fakhri / A 172 001 Delin Pratiwi / A 172 005 Gilang Darmawan / A 172 009 Reni Sumaryani / A 172 021 Sri Nurjayanti / A 172 023 Sri Hantika / A 193 002 Content of the topic Biota laut Pendahuluan Metode fitokimia Senyawa kimia Pembahasan Jurnal Utama 1 2 3 ANTIBAKTERI DARI EKSTRAK KARANG LUNAK Nephtea sp Isolasi Senyawa Bioaktif dari Oscillatoria sp. Sebagai Antibakteri Escherichia coli Aktivitas antibakteri bakteri laut diisolasi dari spons Xestospongia testudinaria dari Sorong, Papua Pendahuluan • Keanekaragaman hayati laut Indonesia sangat tinggi dan memiliki potensi penting dalam perekonomian Negara, Kekayaan bahan hayati telah mendorong manusia untuk mengadakan eksplorasi dan eksploitasi secara besar-besaran, para peneliti berupaya untuk mendapatkan berbagai bahan hayati dalam bentuk senyawa bioaktif yang dapat dimanfatkan bagi kehidupan manusia. • Penelitian bahan hayati laut yang telah dilakukan antara lain substansi bioaktif antimikroba, antifungi, antivirus, antihypocholesterolemia, antitumor, antifouling, antifeedant dan analgesic • Di negara berkembang, termasuk Indonesia, penyakit infeksi masih menjadi penyumbang terbesar, infeksi bakteri merupakan salah satu peyakit yang menjadi perhatian khusus di dalam dunia medis, • Hingga saat ini, penanggulangan penyakit yang disebabkan oleh bakteri telah dilakukan dengan menggunakan obat antibiotik komersil yang bersifat sintesis.Penggunaan obat ini membawa efek negatif bagi tubuh sehingga dapat meningkatkan resistensi bakteri terhadap antibiotik tersebut. • Alternatif lain yang telah dilakukan dalam penanggulangan penyakit ini adalah dengan menggunakan bahan alam laut yang bersumber dari sponge, mikroalga atau bakteriosin diisolasi dari ikan atau udang itu sendiri. Biota Laut yang digunakan Pada review kali ini dipilih beberapa biota laut yang bisa diisolasi metabolit sekundernya yang bisa dijadikan sebagai antibakteri antara lain Bintang laut (Culcita sp), Spons (Xestospongia testudinaria), dan Alga (Oscillatoria sp) 1. Koral Lunak (Nephthea sp) Nephthea sp tumbuh didaerah dengan tutupan karang hidup yang tinggi akan menghasilkan makanan yang lebih banyak penangkal cembranoid diterpen daripada yang berasal dari situs dengan cakupan yang lebih sedikit sehingga secara efektif mencegah makanan ikan. Struktur Kimia Nephthea sp 2. Spons (Xestospongia testudinaria ) Spons merupakan biota laut yang berpotensi memiliki sifat metabolit dan bioaktif sekunder. Hal ini terbukti dari lebih dari 6000 zat bioaktif (senyawa timbal) yang telah diisolasi dari biota laut selama tiga dekade terakhir, dan 40% diantaranya diisolasi dari spons. Spons dari filum porifera sebagian besar strukturnya berpori. Spons memiliki dua lapis struktur yaitu, epidermis dan endodermis. Epidermis terdiri dari sel epitel tipis (pinakosit) sedangkan endodermis terdiri dari sel flagella, yang berfungsi untuk pencernaan makanan, dan corong yang disebut sel leher atau choacocytes. Semua biota laut termasuk spons menghasilkan metabolit primer dan sekunder yang merupakan hasil proses metabolisme di dalam organisme. Produksi metabolit sekunder dipengaruhi oleh lingkungan. Oleh karena itu, diasumsikan bahwa dalam lingkungan yang berbeda (meskipun spesiesnya mirip), metabolit yang dihasilkan akan berbeda. Struktur Kimia Spons (Xestospongia testudinaria ) bromopolyacetylenes 3. Alga (Oscillatoria sp) Oscillatoria adalah salah satu jenis alga yang banyak tumbuh di perairan tawar maupun laut. Mikroorganisme ini memiliki bentuk filamen panjang lurus, ujungnya tidak runcing atau tumpul, terlihat seperti bersegmen-segmen, bewarna hijau tua, dan dapat bergerak dengan cara berseluncur. Salah satu senyawa bioaktif penting yang dihasilkan alga adalah pigmen. Secara umum pigmen alga terdiri dari klorofil, karotenoid dan fikobiliprotein (phycobiliproteins). Struktur Kimia Oscillatoria sp phycocyanin Metodologi Penelitian ALAT Alat yang digunakan pada penelitian ini adalah timbangan analitik Kern, rotary evaporator Eyela N-1000, inkubator Memmert Type INB 500, autoclave Tommy SX-300/500/700, laminar air flow Safe Fast Elite 212 SD, lampu UV UVGL-25, hot plate Akebono, oven Jouan, lemari es LG, perangkat kromatografi lapis tipis,petridisk pyrex, gelas beaker pyrex, tabung reaksi pyrex, corong pisah pyrex, micropipet Pipettemant P20 F123563 (vol. 2-20 L), micropipet Eppendorf (vol 1001000 L) dan alat-alat dasar laboratorium lainnya. BAHAN 1. 2. Penelitian ini menggunakan teknik purposive sampling, dimana sampel diambil di perairan Tanjung Kasuari, Sorong (Papua). Sampel diambil di daerah perairan pantai pada kedalaman 15 - 20 m melalui SCUBA Diving. Segera setelah diambil, sampel dimasukkan ke dalam wadah plastik yang telah disediakan diisi air garam steril, kemudian dibawa ke laboratorium untuk persiapan isolat bakteri. Oscillatoria sp., bakteri Escherichia coli O157:H7 yang diperoleh dari pasien RSUD Zainoel Abidin-Banda Aceh, media Nutrient Agar (NA), serium (IV) sulfat, asam sulfat, asam asetat anhidrat, bismut (III) nitrat, asam klorida, kalium iodida, asam tartarat, ninhidrin, nButanol, asam asetat glasial, KLT SiO2 normal phase, KLT C-18 reverse phase, metanol, etanol, dimetilsulfoksida 2%, chloramphenicol, akuades, serta bahan-bahan pendukung seperti tissue, alumunium foil, dan sebagainya. Metode Penelitian Ekstraksi Metode yang digunakan untuk mengekstraksi adalah metode umum yang telah dimodifikasi. Sampel Nephtea sp. diblender kemudian direndam dengan etanol selama 24 jam, lalu disaring hingga debris I dan filtrate I. filtrate I ditampung dalam wadah sedangkan debris I direndam lagi dengan etanol selama 24 jam. Selanjutnya disaring sehingga diperoleh debris II dan filtrate II. Filtrate II digunakan bersama filtrate I, debris II diberi perlakuan yang sama dengan sebelumnya sehingga diperoleh filtrate III dan debris III. Selanjutnya filtrate I, II dan III digabung dan disaring dengan menggunakan kertas whattman No. 42 lalu diuapkan pada suhu 40oC menggunakan “vacuum rotary evaporator” dikeringkan sehingga diperoleh etanolik setelah itu ditimbang, Ekstraksi Cair Cair (ECC) Ekstrak etanolik Nephtea sp. Dimasukan dalam “ separatory funne” lalu ditambahkan etil asetat dengan perbandingan 1:3 kemudian dikocok dan didiamkan sehigga terdapat 2 lapisan. Masing-masing lapisan ditampung dalam wadah yang berbeda. Selanjutnya lapisan etil asetat diuapkan dalam “vacuum rotary evapotator” hingga kering lalu ditimbang sehingga diperoleh fraksi larut etil asetat. Selanjutnya fraksi etil asetat dipisahkan untuk digunakan dalam pengujian antibakteri. Sisa dari fraksi etil asetat ini kemudian dipartisi kembali dengan menggunakan etanol dan heksan dengan perbandingan 1:3 lalu dikocok dan di diamkan beberapa saat sehingga akan diperoleh lapisan airetanol dan lapisan heksan. Lapisan heksan diuapkan dengan “vacuum rotary evaporator” hingga kering kemudian ditimbang den diperoleh fraksi larut heksan. Lapisan air-metanol dipartisi dengan menambahkan kloroform lalu dikocok sehingga diperoleh lapisan air-metanol dan lapisan kloroform. Lapisan kloroform diuapkan, kemudian ditimbang sehingga didapat fraksi larut kloroform. Lalu setiap fraksi diuji aktifitas antibakterinya terhadap bakteri Escherichia coli. Penyiapan Bakteri Uji Bakteri yang dipakai dalam penelitian ini adalah Escherichia coli. Bakteri tersebut dikultur pada nutrient agar (NA), lalu diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam. Masing-masing bakteri yang telah ditumbuhkan, diambil dan disuspensikan dalam larutan NaCl o,9% dan kepadatannya diatur sebanyak 109 sel/ml, dengan cara disetarakan dengan larutan Mc farland. Selanjutnya, dilakukan pengenceran sehinga kepadatan bakteri menjadi 106 sel/ml. Penyiapan Antibiotik Pembanding Antibiotik pembanding yang digunakan yaitu tetrasklin. Dalam pengujian, kosentrasi antibiotik pembanding yang digunakan yaitu 0,01 mg/ml. Masing-masing antibiotik dilarutkan dalam aquades. Pembuatan Media dan Penanaman Bakteri Nutrient agar (NA) dilarutkan dengan aquades kemudian direbus sambil diaduk hingga larut, selanjutnya disterilkan dalam autoklaf selama 15 menit pada suhu 1210c. setelah itu dituang dalam cawan petri steril masing-masing sekitar 15 ml dan dibiarkan sampai mengeras. Lapisan pembenihan dibuat dari nutrient agar yang dilarutkan dengan aquades dengan komposisi nutrient broth 0,8 g dan 1,8 g agar, kemudian dilarutkan dalam aquades steril 100 ml. Selanjutnya nutrient agar tersebut direbus sambil diaduk sehingga larut, lalu dimasukan dalam tabung-tabung reaksi, kemudian disterilisasi dalam autoklaf pada suhu 121 derajat celcius selama 15 menit selanjutnya pada tabung-tabung tersebut ditambahkan suspense bakteri uji dengan kepadatan 106 sel/ml. Setelah itu di “vortes” dan dituang di atas media dasar dan biarkan sehingga mengeras. Uji Aktivitas Antibakteri Uji aktivitas antibakteri dilakukan dengan metode difusi agar, yang meliputi pembiakan bakteri uji selama 1 hari media kaldu nutrisi di bawah suhu 37ºC. Bakteri kultur dibuat pada densitas 25% T menggunakan spektrofotometer atau densitas 109 sel / mL pada fase logaritmik dan diinokulasi dalam cawan Petri steril, di mana kulturnya merata didistribusikan, ditambahkan dengan media agar, dihomogenkan kemudian dibiarkan mengembun dalam kondisi steril selama 20 menit dalam LAF. Kertas saring disemprot dengan 10 mL tetes larutan uji (yang mengandung bakteri terkait spons) dengan konsentrasi 1 mg/mL. Kemudian diinkubasi di bawah suhu 35ºC selama 2 × 24 jam. Aktivitas antibakteri ditentukan berdasarkan pembentukan zona hambat >9 mm di sekitar cakram Hasil dan Pembasan Hasil dari ekstrak karang lunak Nephtea Sp Perlakuan Konsentrasi (mg/mL) Zona hambat(mm) Fraksi etanolik 0,01 0 1 0,88 0,01 0 1 0 0,01 0 Fraksi larut etil asetat 1 0 Control Negative 0,01 0 tetrasiklin 0,01 11,33 Fraksi larut heksan Tabel 1. Diameter rataan (mm) zona hambat menurut jenis perlakuan (fraksi) Fraksi etanolik ekstrak karang lunak Nephtea sp. Memiliki aktivitas antibakteri dengan daya yang jauh lebih kecil dari kontrol positif sementara itu, fraksi heksan dan fraksi etil asetat tidakmenunjukkan zona hambat. Hal ini menunjukkan tidak adanya aktivitas antibakteri. Nephthea sp mampu menghambat protease bakteri gram negatif yang memiliki beberapa lapisan sel berupa struktur lipopolisakarida yang berikatan silang dengan protein dan mampu memproduksi beberapa jenis protease seperti protease intraseluler golongan protease IV (Wilderman et al., 2001), elastase (Branni et al., 2001; Braunn et al., 2001), dan alkalin protease (Baehaki et al. 2009; Feltzer et al., 2000). Hal ini diduga karena komponen bioaktif yang terdapat pada ekstrak karang lunak Nephthea mampu berkompetisi dengan substrat yang berupa protein (Coval et al., 1996), sehingga membentuk kompleks enzim-inhibitor (EI). Dengan demikian terjadi persaingan antara inhibitor dengan substrat terhadap bagian aktif enzim. Akibat dari kompleks enzim-inhibitor ini menyebabkan terhambatnya produksi enzim ekstraseluler Isolat Bakteri spons Xestospongia testudinaria Gambar disamping menunjukkan bahwa koloni bakteri dominan berbentuk bulat, sedangkan warna dominan putih salju, setiap koloni bakteri yang tumbuh baik diklasifikasikan berdasarkan warna, ukuran, dan bentuk kolon, kemudian dimurnikan menggunakan media similarm. Pengamatan morfologi koloni bakteri simbion pada spons X. testudinaria ditemukan 15 isolat di Sorong, dan hanya 6 isolat bakteri yang berhasil dimurnikan dan diberi kode Xp 4.1, Xp 4.2, Xp 4.3, Xp 4.4, Xp 4.5 dan Xp 4.6. Aktivitas antibakteri dari isolat bakteri spons Xestospongia testudinaria Tabel 1. menunjukkan bahwa isolat bakteri simbion Xp 4.2 memiliki aktivitas penghambatan terhadap bakteri Gram negatif (E. coli dan Klebsiella pneumoniae). Penghambatan ini lebih kuat daripada bakteri Gram-positif ( Bacillus subtilis). Dikatakan memiliki aktivitas antibakteri kuat jika diameter zona hambat > 16,0 mm, antibakteri sedang untuk diameter mulai dari 11-16mm, lemah untuk diameter 7 - 11 mm dan tidak ada aktivitas jiks diameter hambat <7mm Aktivitas antibakteri hasil fraksinasi Xestospongia testudinaria (Xp 4.2) Aktivitas antimikroba diamati baik pada fraksi n-butanol, fraksi etilasetat dan n-heksan dari metabolit sekunder bakteri simbion Xp 4.2 penghambatan yang lebih tinggi ditunjukkan oleh fraksi larut etil asetat. Bakteri spons Xp 4.2 menunjukkan homologi yang tinggi terhadap M. luteusMB-26 (98%), sebagai ekstrak dari strain bakteri yang berhubungan dengan spons luteus memiliki aktivitas antimikrobial yang kuat Skrining fitokimia Xestospongia testudinaria (Xp 4.2) Skrining fitokimia dan uji aktivitas antimikroba fraksi etil asetat menemukan senyawa alkaloid dan steroid, yang memiliki aktivitas antibakteri. Skrinning fitokimia Ekstrak Metanol Oscillatoria sp No Nama senyawa Pereaksi Konstituen 1 Hidrokarbon Serium Sulfat +++ 2 Alkaloid Dragendroff +++ 3 Terpenoid Salkowski - 4 Steroid Liberman-Buchard - 5 Flavonoid Pereaksi Basa - Keterangan : +++ : Respon kuat, ++: Respon sedang, +: Respon lemah, -: tidak ada respon Hasil menunjukkan bahwa dalam crude extract metanol Oscillatoria sp. mengandung senyawa hidrokarbon dan alkaloid, tetapi tidak mengandung senyawa terpenoid, steroid dan flavonoid. Hal ini disebabkan olehsifat senyawa alkaloid yang bersifat polar dan cenderung lebih mudah dieksresi menggunakan pelarut polar, salah satunya adalah metanol Aktivitas antibakteri dari Oscillatoria sp Zona Hambat crude extract metanol dari Oscillatoria Sp Hasil menunjukkan bahwa terdapatnya zona hambat yang dihasilkan oleh senyawa yang terdapat pada crude extract metanol dari Oscillatoria sp sama besarnya dengan kontrol positif Zona hambat hasil fraksinasi Oscillatoria sp Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa kedua fraksi aktif (Fraksi diklorometana = K1B14 dan fraksi metanol:air = K1B15) terhadap antibakteri. Akan tetapi zona hambat yang dihasilkan memiliki diameter yang berbeda. Hasil dari Oscillatoria sp Hasil partisi menunjukkan adanya perbedaan antara K1B1metanol dengan hasil partisi. Selain itu, kandungan hasil partisi antara K1B14 dengan K1B15 juga terdapat perbedaan. Hal ini disebabkan oleh senyawa yang lebih mudah tertarik pada pelarut yang memiliki sifat yang sama dengan senyawa kandungan senyawa metabolit sekunder alkaloid yang berperan sebagai senyawa bioaktif dalam aktivitas anti bakteri pada Oscillatoria sp. Adanya gugus N tersier yang berasal dari senyawa alkaloid dalam fraksi K1B15 menyebabkan terjadinya interaksi gugus terhadap sintesis bakteri yang menyebabkan terhambatnya pembentukan dinding sel tersebut (Gunawan et al., 2011). senyawa metabolit sekunder yang terdapat dalam Oscillatoria sp menghambat pertumbuhan bakteri Escherichia coli yang mengakibatkan berhentinya sintesis protein ribosom sub unit 50S sehingga mencegah transesterifikasi menuju mRNA dan tRNA tidak menjadi ribosom 70S. Hal ini mengakibatkan protein ribosom sub unit 50S tidak mengalami perpanjangan rantai peptida sehingga dinding sel Escherichia coli mengalami pemecahan dinding sel (lisis) (Kurnianda dan Setiawan, 2015; Gunawan et al., 2011). Kesimpulan Jenis Biota Laut Filum Senyawa bioaktif Aktivitas antimikroba terhadap Nephtea Sp Echinodermata Cembranoid diterpen Staphylococcus aureus, Escherichia coli Xestospongia testudinaria Porifera bromopolyacetylenes E. coli, Klebsiella pneumoniae Oscillatoria sp Cyanophyta phycocyanin E. coli
