ISOLASI FRAKSI AKTIF KAPANG ENDOFIT PADA AKAR TUMBUHAN GANDARIA (Bouea macrophylla Griffith) DAN PENGARUH ANTIMIKROBA TERHADAP TERDAHAP EKSPRESI GEN mecA PADA Staphylococcus Aureus DISUSUN OLEH : JUEN CARLA WARELLA NIM : 011814153013 LATAR BELAKANG : Indonesia sebagai negara tropis sangat kaya akan keanekaragaman hayati Akan tetapi, hingga saat ini banyak potensi alam di Indonesia yang belum sepenuhnya digali dan dimanfaatkan secara maksimal. Beberapa tahun terakhir, banyak bermunculan bakteri resisten yang telah terjadi di seluruh dunia (Golkar et al. 2014; Wright 2014). Hal ini akan berdampak bagi dunia kesehatan di indonesia, karena kesejahteraan yang tidak merata, seringkali ditemui pemberian resep yang tidak tepat, penggunaan obat yang tidak rasional, dan akses tidak terkendali terhadap antibiotik (Abdulah 2012). Akibatnya, pasien yang terinfeksi cenderung memiliki pengeluaran kesehatan yang lebih tinggi, tinggal di rumah sakit yang lebih lama, dan memerlukan pengobatan obat lini kedua atau ketiga yang mungkin kurang efektif dan lebih mahal (Farrell et al. 2005; Levy 2005) . Salah satu solusi yang perlu dikembangkan adalah dengan menghasilkan antibiotik yang mampu untuk membunuh bakteri resisten. Antibiotik yang dihasilkan dari bahan alam. salah satunya adalah Gandaria (Priyadi, 2010). Umumnya tanaman yang tumbuh pada lingkungan yang unik, memiliki sifat etnobotani khusus yang bersifat endemik bagi pertumbuhan mikroba endofit. Bakteri endofit memberikan kontribusi pada pertumbuhan tanaman inang dengan memproduksi zat pengatur tumbuh tanaman, meningkatkan induksi resistensi tanaman inang terhadap patogen dan parasit, membantu fiksasi nitrogen, dan menghasilkan antibiotik (Bhore et al., 2010). RUMUSAN MASALAH: Berdasarkan latar belakang masalah di atas maka dirumuskan beberapa masalah sebagai berikut: 1. Bagaimanakah isolat dan karakterisasi senyawa fenolat kapang endofit pada akar Gandaria (Bouea macrophylla Griffith) ? 2. Manakah aktivitas antibakteri terbaik dari ekstrak senyawa aktif kapang endofit pada akar Gandaria (Bouea macrophylla Griffith) ? 3. Apakah ada pengaruh fraksi aktif terhadap ekspresi gen mecA pada Staphylococcus Aureus ? Tujuan penelitian: Berdasarkan rumusan masalah di atas, maka Tujuan dilakukannya penelitian “Isolasi fraksi aktif kapang endofit akar tumbuhan gandaria (Bouea macrophylla griffith) dan pengaruh antimikroba terhadap terdahap ekspresi gen mecA pada Staphylococcus aureus” Adalah : 1. Mendapatkan isolat dan karakterisasi senyawa fenolat kapang endofit pada batang Gandaria (Bouea macrophylla Griffith). Tujuan Umum : Penelitian ini bertujuan untuk medapatkan isolasi fraksi aktif kapang endofit dan mengetahui pengaruh antimikroba dari kapang endofit kulit batang tumbuhan gandari (Bouea macrophylla Griffith) terhadap ekspresi Gen mecA pada Staphylococcus aureus. Tujuan Khusus 2. Menentukan aktivitas antibakteri terbaik dari ekstrak senyawa aktif kapang endofit pada akar Gandaria (Bouea macrophylla Griffith). 3. Menlihat pengaruh fraksi aktif terhadap ekspresi gen mecA pada Staphylococcus Aureus. Manfaat Penelitian 1. Secara Teoritis : Secara teoritis hasil penelitian ini dapat bermanfaat sebagai : a. Memberikan informasi mengenai potensi senyawa aktif kapang endofit sebagai antibakteri. b. Memberikan informasi mengenai pengaruh kapang endofit terhadap ekspresi gen mecA pada Staphylococcus Aureus. 1. Secara Praktis : Secara praktis hasil penelitian ini dapat bermanfaat sebagai : a. Bagi masyarakat ilmiah b. Bagi masyarakat umum c. Bagi peneliti Populasi dan Sampel Populasi : Populasi yang digunakan dalam penelitian ini adalah kapang endofit dari akar tanaman gandaria di Desa Soya, Kecamatan Sirimau, Kota Ambon, Provinsi Maluku. Sampel : Sampel yang digunakan dalam penelitian ini Isolasi fraksi aktif ekstrak kasar kapang endofit sebanyak 0,5mg, 1mg dan 2mg Farland biakan bakteri Staphylococcus aureus (1,5x108 CFU/mL) yang diinkubasi selama 24 jam yang diperoleh dari laboratorium Mikrobiologi Kedokteran, Fakultas Kedokteran Airlangga Surabaya. 1. 2. 3. Teknik pengambilan Sampel : Pengambilan sampel dilakukan dengan cara bagian akar tanaman gandaria diambil dan disimpan sementara dengan menggunakan wadah plastik khusus yang berpori. Penyimpanan material tanaman dipertahankan pada suhu 4 °C, kemudian dicuci dengan akuades. Proses isolasi sampel : Teknik isolasi kapang endofit dari akar gandaria (Bouea macrophylla Griff), dilakukan dengan metode langsung (direct innoculation) (Noverita et al. 2009) ditransfer ke dalam media kultur PDA untuk mendapakan hasil isolasi kapang endofit, Obyek Penelitian : Sampel yang digunakan dalam penelitian ini Isolasi fraksi aktif ekstrak kasar kapang endofit adalah 0,5mg, 1mg dan 2mg biakan bakteri Staphylococcus aureus (1,5x108 CFU/mL) yang diinkubasi selama 24 jam. Sampel akan dibiakan dalam medium padat media NA dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37oC. Perlakuan yang diberikan pada sampel berjumlah lima, yakni untuk kontrol positif, control negatif, dan tiga konsentrasi ekstrak yang dilakukan secara duplo. Untuk difusi sumur agar Ekstrak kapang endofit dimasukkan ke dalam sumur masing-masing sebanyak 0,5, 1 dan 2 mg. Sebagai kontrol positif digunakan antibiotik kloramfenikol sebanyak 300 μg/mL dan kontrol negatif menggunakan pelarut yang digunakan untuk ekstraksi, yaitu etil asetat sebanyak 20 μL/mL. Kerangka konseptual HIPOTESIS Hipotesis dalam penelitian ini adalah “Ada aktivitas antimikroba dari ekstrak kapang endofit terhadap pertumbuhan bakteri Staphylococcus aureus dan ada pengaruh pemberian ekstrak kapang endofit terhadap ekspresi gen mecA pada Staphylococcus aureus. Variable Penelitian : Variabel Bebas : Variabel bebas adalah variabel yang nilainya menentukan variabel lain (nursalam,2008). Variabel bebas yang digunakan adalah Konsentrasi Ekstrak Kasar fraksi aktif kapang endofit terdapat pada 3 konsentrasi 2mg, 1mg, dan 0,5mg dengan metode Difusi sumur agar. Variabel Terikat : Variabel terikat adalah variabel yang nilainya ditentukan oleh variabel lain (Nursalam,2008). Dalam penelitian ini, variabel terikat adalah aktivitas antimikroba (diameter zona hambat) yang dihasilkan Staphylococcus aureus, ekspresi gen mecA saat diberi ekstrak kapang endofit. Variabel Kontrol : Konsentrasi Bakteri Staphylococcus aureus, jenis bakteri Staphylococcus aureus, Ekstrak kapang endofit, temperature inkubaki kultur bakteri Staphylococcus aureus secara in vitro, Waktu inkubasi, pH pada medium tempat pembiakan Staphylococcus aureus, nutrisi pada medium tempat pembiakan Staphylococcus aureus. Prosedur Pengumpulan data 1. Isolasi dan Karakteris-asi Kapang Endofit • Preparasi sampel • Isolasi kapang endofit • Pemurnian kapang endofit (Arnold et al. 2003) • Seleksi kapang endofit 2. Karakterisasi isolat kapang endofit (Gandjar et al. 2000)Kultivasi dan Penentuan Kurva Pertumbuhan Kapang Endofit Terpilih (Tarman 2011) 3. Ekstraksi Senyawa Aktif Media Kultur Kapang Terpilih (Artanti et al. 2011) 4. Pengujian Aktivitas Antibakteri 5. Uji Sitotoksisitas pada Sel Vero 6. Uji Fitokimia (Harborne 1987) 7. Fraksinasi dan Karakterisasi Senyawa Aktif. 8. Fraksinasi dengan kromatografi lapis tipis preparatif (KLTP) (Gritter et al. 1991) dan karakterisasi senyawa antibakteri. 9. Pengujian dengan PCR Definisi operasional variabel : Variabel Defenisi operasional • Bebas : Ekstrak Kasar fraksi • aktif kapang endofit • Ekstrak Kasar : Ektrak yang mengandung senyawa antimikroba dengan menggunakan pelarut organik. Fraksi aktif : Senyawa aktif yang berfungsi sebagai antimikroba Kapang endofit : mikroba yang hidup di dalam jaringan tumbuhan tanpa menyebabkan efek negatif langsung yang nyata (Noverita et al, 2009). Terikat : Aktivitas antimikroba (diameter zona hambat) yang dihasilkan Staphylococcus aureus • Aktivitas Antimikroba : • Diameter zona hambat : Suatu sumuran yang terbentuk ketika ada suatu agen yang dapat menghabta pertumbuhan bakteri sehinnga cenderung menjauh dan pula dikatakan pada daerah tersebut bakteri tidak dapat hidup. Ekspresi gen mecA saat diberi ekstrak kapang endofit. • Ekspresi Gen : Suatu proses penerjemahan informasi genetik menjadi protein (yang dihasilkan) Gen mecA : gen yang terdapat pada Staphylococcus aureus, yang merupakan salah satu penyebab resistensi mikroba terhadap antibiotik • Instrumen dan skala data : Parameter Alat ukur Skala Data Skor Dilakukan pengocokkan atau pengadukan selama 3x24 jam tanpa proses pemanasan. selanjutnya dipekatkan. vacum rotary evaporator pada suhu 40 oC Lebar zona hambat yang terbentuk Mikrometer skrup (skala milimeter) Rasio Ukuran diameter zona hambat yang terbentuk Ekspresi Gen mecA PCR Ratio Mutasi yang terjadi pada gen mecA saat diberikan ekstrak kapang endofit. Rencana Analisis Data Data hasil penelitian merupakan hasil ratarata dari dua kali ulangan beserta nilai standar deviasinya dan ditampilkan dalam bentuk grafik. Data tersebut dianalisis secara deskriptif, disajikan dalam bentuk gambar, grafik dan tabel. Data IC50 pada uji sitotoksik diperoleh berdasarkan hasil analisis regresi probit. Daftar Pustaka : • Abdulah R. 2012. Antibiotic abuse in developing countries. Pharm Regulat Affairs: Open Access. 1:1–3 • Bhore, S., R. Nithya, & C.Y. Loh. 2010. Screening of endophytic bacteria isolated from leaves of Sambung Nyawa [Gynura procumbens (Lour.) Merr] for cytokinin-like campound. Bioinformation 5: 191–197. • Farrell DJ, Jenkins SG, Brown SD, Patel M, Lavin BS, Klugman KP. 2005. Emergence and spread of Streptococcus pneumoniae with ermB and mefA resistance. Emerg Infect Dis. 11:851–858. • Golkar Z, Bagasra O, Gene Pace D. 2014. Bacteriophage therapy: a potential solution for the antibiotic resistance crisis. J Infect Dev Count. 8:129–136. • Wright GD. 2014. Something old, something new: revisiting natural products in antibiotic drug discovery. Can J Microbiol. 60:147–154. • Levy SB. 2005. Antibiotic resistance—the problem intensifies. Adv Drug Deliv Rev. 57:1446–1450. • Priyadi, H. 2010. Five Hundred Plant Species in Gunung Halimun Salak National Park, West Java. Bogor: Center for International Forestry Research • Noverita, Fitriana D. dan Sinaga, E. 2009. Isolasi dan Uji Aktivitas Antibakteri Jamur Endofit dari Daun dan Rimpang Ziniber ottensi. Jurnal Farmasi Indonesia, 7 (4): 171-176. • Papilaya, P.M. 2007. Kajian Ekologi Gandaria (Bouea macrophylla Griffth). Hubungannya Dengan Produksi Dan Kualitas Buah Pada Ketinggian Dari Permukaan Laut Yang Berbeda Di Pulau Ambon. (Suatu Analisis Tentang Tumbuhan Endemik Daerah Maluku). [Disertasi] Universitas Negeri Malang. • Rajan, N.S.; Bhat, R.; Karim, A.A. Preliminary Studies on the Evaluation of Nutritional Composition of Unripe and Ripe ‘Kundang’ Fruits (Bouea Macrophylla Griffith). International Food Research Journal 2014, 21, 985–990. • Schulz, B.; & Boyle, C. 2006, What Are Endophytes? dalam: Schulz, B.; Boyle, C.; & Sieber, T.N. (Eds.). Soil Biology. Volume 9. Microbial Root Endophytes. Springer-Verlag. Berlin Heidelberg. 2006: 1-13. • Strobel, A.S. & G.A. Strobel. 2007. Plant endophytes as a platform for discovery-based undergraduate science education. Nature Chemical Biology 3: 356–359. • Strobel, G.A. (2003). Endophytes as sources of bioactive products. Microbes Infection 5: 535– 544. • Tangkuman, C. 2006. Identifikasi Potensi Tanaman Gandaria (Bouea macrophylla Griff) Di Dusun KusuKusu Sereh Desa Urimesing Kecamatan Nusaniwe Kota Ambon. [Skripsi]. Fakultas Pertanian Universitas Pattimura. Ambon • Tjitrosoepomo, G., 2001. Morfologi Tumbuhan. Cetakan 13. Gadjah Mada University Press, Yogyakarta.
