peningkatan ekspresi gen cdk5 pada kultur sel leukimia
advertisement
PENINGKATAN EKSPRESI GEN CDK5 PADA KULTUR SEL LEUKIMIA OLEH EKSTRAK HERBA DAN BAKTERI VULKANIS ESTI DWI RAHAYU PROGRAM STUDI BIOKIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2006 ABSTRAK ESTI DWI RAHAYU. Peningkatan Ekspresi Gen CDK5 pada Kultur Sel Leukimia oleh Ekstrak Herba dan Bakteri Vulkanis. Dibimbing oleh I MADE ARTIKA dan NOVIK NURHIDAYAT. Kanker adalah suatu penyakit yang terjadi karena pertumbuhan sel yang abnormal, cepat, dan tidak terkendali. Leukimia merupakan kanker yang menyerang sel darah putih, sehingga produksi sel darah putih menjadi berlebih. Salah satu penyebabnya adalah terhambatnya proses apoptosis. Peristiwa apoptosis merupakan target utama untuk pengembangan terapi terhadap penyakit terutama kanker dan AIDS. Oleh karena itu dilakukan pencarian senyawa bioaktif antikanker yang berfungsi sebagai induser apoptosis. Senyawa selenium telah terbukti mampu menghambat pertumbuhan kanker dengan memicu terjadi peristiwa apoptosis pada sel kanker. Hasil penelitian terdahulu menyebutkan bahwa ciplukan rinjani, bawang putih rinjani dan bakteri termofil Geobasillus 22a mengandung selenium tinggi (3.04-40.55 ppm), berpotensi memicu apoptosis sel model Saccharomyces cerevisiae (7.79-23.28 %) dan hasil analisis kromatografi gas menunjukkan adanya beberapa jenis senyawa selenium yang terdapat dalam ekstrak airnya. Penelitian ini dititikberatkan pada pengaruh ekstrak herba dan bakteri vulkanis terhadap ekspresi gen cdk5, sebagai gen regulator apoptosis pada sel kanker dengan mengunakan actb sebagai kontrol positif. RT-PCR digunakan untuk analisis target gen apoptosis. Intensitas pita DNA diukur secara semikuantitatif dengan Bio Rad Count TM Software. Apoptosis pada sel Namalwa dan HL-60 meningkat dengan adanya peningkatan ekspresi gen cdk5. Ekstrak bakteri Geobasillus 22a lebih efektif meningkatkan ekspresi gen cdk5 pada sel Namalwa, sedangkan ekstrak ciplukan rinjani lebih efektif meningkatkan ekspresi cdk5 pada sel HL-60. ABSTRACT ESTI DWI RAHAYU. Upregulation of CDK5 gene expression in leukemic cell line by vulcanize herb and bacteria extracts. Under the direction of I MADE ARTIKA and NOVIK NURHIDAYAT. Cancer is a disease caused by the abnormal, rapid and uncontrolled cell growth. Leukemia is a cancer that attacks white blood cells, so that the production of white blood cells become excessed. It can also be caused by the inhibition of apoptotic process. Apoptosis has become the main target in improving cancer and AIDS therapy. For these reasons there were studies conducted to find bioactive compounds for anticancer agent which can be used as apoptosis inducer. Selenium compounds were proven to have the ability in slowing down the cancer growth by triggering apoptosis process on cancer cells. Former researches proved that rinjani ciplukan, rinjani garlic, and thermofil bacteria Geobacillus 22a contains high selenium (3.04-40.55 ppm) which had potentials to cause Saccharomyces cereviciae cells apoptosis (7.79-23.28%) and gas chromatography analysis showed that there were several types of selenium compounds in the water extract. This research was focused on the effect of vulcanize herb and bacteria extracts on cdk5 genes as apoptosis gene regulator of cancer cells. RT-PCR was used to analyse apoptosis target genes. DNA band intensity was measured semiquantitatively by using Bio Rad Count TM Software. Mechanism apoptotic of Namalwa and HL-60 cells increased with cdk5 gene expressions. Geobacillus 22a extract was more effective in increasing cdk5 gene expressions of namalwa cells whereas the ciplukan rinjani extract can increase cdk5 expression of HL-60 cells. PENINGKATAN EKSPRESI GEN CDK5 PADA KULTUR SEL LEUKIMIA OLEH EKSTRAK HERBA DAN BAKTERI VULKANIS ESTI DWI RAHAYU Skripsi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Program Studi Biokimia PROGRAM STUDI BIOKIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2006 Judul Skripsi Nama NIM : Peningkatan Ekspresi Gen CDK5 pada Kultur Sel Leukimia oleh Ekstrak Herba dan Bakteri Vulkanis. : Esti Dwi Rahayu : G 44101015 Disetujui Komisi Pembimbing Dr. I Made Artika M.App.Sc. Ketua Dr. Novik Nurhidayat Anggota Diketahui Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Institut Pertanian Bogor Dr. Ir. Yonny Koesmaryono, M.S. NIP 131473999 Tanggal Lulus : PRAKATA Segala puji dan syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT karena hanya atas pertolonganNya penulis dapat menyelesaikan penulisan karya ilmiah ini. Tulisan ini saya persembahkan untuk bapak dan ibu yang selalu mendoakan keberhasilan dan kesuksesan anaknya. Karya ilmiah ini berjudul Peningkatan Ekspresi Gen CDK5 pada Kultur Sel Leukimia oleh Ekstrak Herba dan Bakteri Vulkanis. Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Biosistematika dan Genetika Bidang Mikrobiologi, Pusat Penelitian Biologi, LIPI, Bogor, Laboratorium Biologi Molekuler Eijkman dan Pusat Penelitian Kimia, LIPI, Bandung. Penulis mengucapkan terima kasih kepada bapak I Made Artika dan bapak Novik Nurhidayat atas bimbingan dan kesabarannya selama ini. Rangkaian terimakasih juga penulis ucapkan untuk bapak, ibu dan saudaraku yang telah memberikan doa dan semangat. Terima kasih untuk ibu Candra, ibu Safarina Malik, ibu Linar, ibu Hartin, Data, teh Ratih, teh Rina, teh Indah yang telah membantu menyelesaikan penelitian ini. Terima kasih juga untuk semua temanteman yang selalu memberikan semangat dan perhatiannya. Akhir kata penulis berharap semoga karya ilmiah ini dapat bermanfaat bagi semua pembaca. Bogor, Juni 2006 Esti Dwi Rahayu RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Solo Jawa Tengah pada tanggal 22 September 1983 sebagai anak kedua dari ayah Haryoso Hari Prasetyo dan ibu Sri Lestari Saksiati. Tahun 2001 penulis lulus dari SMUN 5 Solo Jawa Tengah dan pada tahun yang sama lulus seleksi masuk IPB melalui jalur USMI (Undangan Seleksi Masuk IPB). Penulis menempuh studi di Program Studi Biokimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. Pada tahun 2004, penulis mengikuti Praktek Kerja Lapang di Laboratorium Biosistematika dan Genetika bidang Mikrobiologi LIPI, Bogor. DAFTAR ISI Halaman DAFTAR GAMBAR ....................................................................................... ix DAFTAR LAMPIRAN .................................................................................... ix PENDAHULUAN ........................................................................................... 1 TINJAUAN PUSTAKA Senyawa Selenium .................................................................................. Apoptosis ................................................................................................ Kultur Sel ................................................................................................ Herba Vulkanis ....................................................................................... Bakteri Termofil Geobasilus 22a ........................................................... Bioinformatika ........................................................................................ Isolasi mRNA ......................................................................................... RT-PCR (Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction) ............. 1 2 2 3 4 4 4 5 BAHAN DAN METODE Bahan dan Alat ....................................................................................... Metode .................................................................................................... 5 6 HASIL DAN PEMBAHASAN Penelusuran Informasi Gen pada GenBank ............................................ Desain Primer ......................................................................................... Peremajaan dan Perhitungan Kultur Sel Kanker .................................... Apoptosis pada Sel Kanker..................................................................... Isolasi mRNA ......................................................................................... Ekspresi Gen cdk5 dan actb .................................................................... Mekanisme Apoptosis............................................................................. 8 8 9 9 11 11 13 SIMPULAN DAN SARAN Simpulan ................................................................................................. Saran ....................................................................................................... 14 14 DAFTAR PUSTAKA ...................................................................................... 14 LAMPIRAN ..................................................................................................... 16 DAFTAR GAMBAR Halaman 1 Morfologi sel Namalwa ................................................................................... 3 2 Morfologi sel HL-60 .................................................................................... 3 3 Ciplukan (Physalis minima) rinjani ........................................................... 3 4 Bawang putih (Allium sativum) rinjani...................................................... 4 5 Penampakan mikroskopis Geobasillus 22a ............................................... 4 6 Foto sel Namalwa setelah perlakuan ......................................................... 10 7 Foto sel HL-60 setelah perlakuan .............................................................. 10 8 Pola pita ekspresi gen actb dan cdk5 pada sel Namalwa .......................... 11 9 Intensitas ekspresi cdk5 pada sel Namalwa ............................................... 12 10 Pola pita ekspresi gen actb dan cdk5 pada sel HL-60 ............................... 12 11 Intensitas ekspresi gen actb dan cdk5 pada HL-60 ........................ .......... 12 12 Mekanisme apoptosis melalui ekspresi gen actb dan cdk5............. .......... 13 DAFTAR LAMPIRAN Halaman 1 Metode penelitian ...................................................................................... 17 2 Perlakuan pada sel Namalwa ..................................................................... 18 3 Perlakuan pada sel HL-60............................................................. ............ 19 4 Isolasi mRNA dengan MikroFastTrack 2.0 Kit ........................................ 20 5 Sekuen gen cdk5 ........................................................................................ 21 6 Sekuen gen beta aktin ................................................................................ 23 7 Output primer3 cdk5 .................................................................................. 25 8 Hasil pengukuran intensitas pita cdk5 pada Namalwa .............................. 27 9 Hasil pengukuran intensitas pita cdk5 pada HL-60 ................................... 28 10 Prosedur pembuatan beberapa larutan....................................................... 29 1 PENDAHULUAN Kanker merupakan penyebab kematian nomor dua setelah penyakit jantung di Indonesia. Kanker adalah suatu penyakit yang terjadi karena pertumbuhan sel yang abnormal, cepat dan tidak terkendali. Leukimia atau kanker darah yaitu penyakit yang disebabkan karena produksi sel darah putih yang berlebih. Hal ini bisa merupakan akibat dari terhambatnya proses apoptosis (Jalal 1999). Peristiwa apoptosis dijadikan sebagai target utama untuk pengembangan terapi terhadap penyakit terutama kanker dan AIDS (Zea 2001). Oleh karena itu dilakukan pencarian induser apoptosis yang berfungsi sebagai antikanker. Senyawa selenium merupakan senyawa yang efektif dalam mencegah pertumbuhan kanker. Hal ini disebabkan kemampuannya menginaktifkan protein NF-kB (Nuclear Factor-kappa B) yang berfungsi sebagai penghambat proses apoptosis (Youn et al. 2001). Selain itu senyawa selenium mampu menghambat siklus sel pada fase S (sintesis DNA) sehingga menyebabkan sel mengalami apoptosis (Jiang 2001). Berdasarkan kemampuan senyawa selenium tersebut Laboratorium Biosistematika dan Genetika (Biosgent) LIPI Bogor melakukan seleksi terhadap tanaman dan mikroba dari daerah vulkanis. Hal ini bertujuan untuk mencari sumber-sumber selenium dari alam. Hasil seleksi menunjukkan ciplukan rinjani, bawang putih rinjani dan Geobasillus 22a memiliki konsentrasi selenium mencapai 3.04-40.55 ppm dan mampu memodulasi apoptosis dengan frekuensi petit mencapai 7.79-23.28 %. Sel khamir yang mengalami petit mengindikasikan terjadinya kerusakan fungsi mitokondria yang ditandai dengan perubahan morfologi menjadi kecil. Mitokondria memegang peranan penting dalam proses apoptosis. Oleh karena itu kerusakan fungsi mitokondria pada sel khamir dapat memicu terjadinya peristiwa apoptosis. Fenomena apoptosis yang sama pada sel khamir dengan sel mamalia, menyebabkan efek senyawa selenium dalam ekstrak herba dan bakteri vulkanis diyakini mampu memicu terjadinya peristiwa apoptosis pada sel kanker. Penelitian ini akan mempelajari efek ekstrak herba dan bakteri vulkanis hasil seleksi kemampuannya dalam memodulasi apoptosis pada tingkat molekuler. Efek dari ekstrak tersebut dapat dilihat dari ekspresi gen cdk5 dan actb pada sel kanker namalwa dan HL-60 yang telah diberi perlakuan dengan ekstrak. Gen actb disini digunakan sebagai kontrol positif. Gen cdk5 dan actb yang diekspresikan dapat dilihat dari pita DNA yang terbentuk pada gel elektroforesis. Pita DNA tersebut merupakan produk amplifikasi dari RT-PCR (Reverse TranscriptionPolymerase Chain Reaction) dengan menggunakan sampel mRNA. mRNA dari sel kanker namalwa dan HL-60 setelah perlakuan merupakan subyek untuk analisis RT-PCR dengan menggunakan primer spesifik gen terhadap cdk5 dan actb. Konsentrasi pita DNA diukur dengan Bio Rad Count TM Software. Hipotesis yang mendasari penelitian ini adalah senyawa selenium yang terdapat pada ekstrak herba dan bakteri vulkanis mampu memicu peristiwa apoptosis pada kultur sel leukimia, dengan cara meningkatkan ekspresi gen regulator cdk5. Tujuan penelitian ini untuk mengetahui pengaruh ekstrak herba dan bakteri vulkanis terhadap ekspresi gen regulator apoptosis cdk5 pada kultur sel leukimia. TINJAUAN PUSTAKA Senyawa Selenium Selenium (Se) adalah unsur mikro esensial bagi manusia dan hewan yang diperoleh dari sumber makanan seperti biji-bijian, padipadian dan sayuran. Kebutuhan selenium ratarata orang dewasa 50-70 µg sehari, namun konsumsi lebih dari 500 µg sehari dapat bersifat toksik (WHO 1987). Kandungan Se pada tanaman bervariasi sekali tergantung konsentrasi Se dalam tanah. Se di dalam tanaman sebagian besar diubah menjadi Se-metionin (Se-Met). Oleh karena itu, makanan yang berasal dari tanaman sebagian besar mengandung selenoprotein dalam bentuk selenometionin. Hewan pada umumnya tidak dapat membentuk selenometionin, hewan hanya menghasilkan selenosistein (Tapiero et al. 2003). Berdasarkan penelitian terdahulu ditemukan bahwa senyawa selenium memiliki sifat antikarsinogenik dan antitumorigenik (Kim et al. 2001). Menurut Ganther (1999) hal ini disebabkan karena senyawa selenium memiliki kemampuan mencegah pertumbuhan kanker dengan berbagai mekanisme. Mekanisme senyawa selenium dalam menghambat pertumbuhan kanker, dengan cara meningkatkan terjadinya peristiwa 2 apoptosis. Menurut Gopalakrishna (2001) senyawa selenium dapat menyebabkan protein kinase C (PKC), yang mengatur pertumbuhan kanker tidak aktif. Hal ini menyebabkan penghambatan pertumbuhan dan penyebaran kanker. Selain itu senyawa selenium juga mampu menginaktifkan protein inhibitor apoptosis (NF-kB) sehingga peristiwa apoptosis dapat berlangsung pada sel kanker (Ganther 1999). Senyawa selenium dapat menyebabkan apoptosis melalui mekanisme yang berbeda yaitu dengan menghambat siklus sel pada fase S (sintesis DNA) sehingga terjadi kegagalan replikasi DNA yang mengakibatkan kerusakan fungsi mitokondria. Hal ini mengindikasikan terjadinya apoptosis karena organel mitokondria memegang peran sentral dalam peristiwa apoptosis (Ip et al. 1990). Apoptosis Apoptosis berasal dari bahasa Yunani yang berarti gugur atau rontok. Apoptosis atau kematian sel terprogram diatur secara genetik dan distimulasi oleh faktor pertumbuhan (Jalal 1999). Proses apoptosis berbeda dengan nekrosis. Apoptosis merupakan proses terprogram, dikontrol secara genetik, dan merupakan proses aktif. Sedangkan nekrosis merupakan kematian sel karena cidera, tidak terkontrol dan pasif. Sel yang nekrosis akan menumpahkan isi sel ke jaringan dan menimbulkan reaksi inflamasi Apoptosis terjadi tanpa kebocoran ataupun tumpahnya komponen sitosol ke jaringan ekstraseluler sehingga tidak menimbulkan inflamasi. Faktor inilah yang menyebabkan apoptosis menjadi target utama pengembangan terapi kanker. Gen regulator apoptosis adalah cdk5 (Cyclin dependent kinase5) merupakan kelompok cyclin dependent kinase (Cdks) karena memiliki sekuen yang homolog dengan Cdks lainnya (Tanaka T et al. 2001). Menurut (Zhang J 2002) ekspresi cdk5 memfosforilasi P53 sehingga menyebabkan protein tersebut menjadi aktif. Aktifnya p53 memicu ekspresi gen Bax dan p21 secara bergantian. Apabila gen Bax yang terekspresi, ekspresi gen p21 dihambat sehingga PROCASPASE 9 aktif menjadi caspase 9. Aktifnya CASPASE 9 memicu terjadinya proses apoptosis. Hal ini menunjukkan bahwa cdk5 dan p53 memegang peranan penting dalam mengatur peristiwa apoptosis. Kerusakan aktin sitoskeleton dapat mengakibatkan sel mengalami apoptosis. Protein yang berfungsi mempertahankan bentuk sel dan letak organel di dalam sitoplasma adalah protein beta aktin. Gen actb akan terekspresi jika ada senyawa toksin dari luar yang dapat mengganggu fosforilasi aktin sitoskeleton sehingga menyebabkan morfologi sel abnormal dan terjadi kerusakan aktin sitoskeleton (Huang 1999; White 2001). Kultur Sel Kultur sel adalah teknik menumbuhkan sel dalam media tertentu. Kultur sel dibedakan menjadi dua yaitu kultur sel lestari dan sel kanker. Sel dapat diambil dari jaringan asli atau kultur primer atau cell line atau cell strain dengan cara enzimatik atau mekanik atau kimia. Cel line adalah kultur primer yang telah disubkultur sekali. Sedangkan Cell strain adalah sel yang diseleksi dengan kloning atau secara fisik atau dengan teknik lain. Perbedaan kultur sel lestari dengan kultur sel kanker adalah kultur sel lestari diambil dari jaringan normal sedangkan kultur sel kanker diambil dari jaringan kanker (Freshney 2000). Namalwa (Gambar 1) merupakan sel Limfoma Burkitt yaitu kanker limfosit B pada manusia yang tumbuh cepat. Sel namalwa di isolasi dari seorang anak afrika yang menderita Limfoma Burkitt pada tahun 1967. Bentuk morfologi sel namalwa adalah limfoblastoid, sel tunggal atau berkelompok kecil dalam suspensi (www.DSMZ.com). Namalwa ditumbuhkan dalam media RPMI 1640 ditambah 10 % FBS (Fetal Bovine Serum) dan 10 % PSF (Pinicillin Streptomycin Fungizone). Densitas awal sel ditumbuhkan adalah 104 sel/ml. Karena kecepatan membelah sel namalwa 8 jam maka dalam waktu satu hari dapat mencapai 106 sel/ml. Apabila densitas sel sudah mencapai 106 sel/ml, sel harus segera dipecah menjadi dua flask agar sel tidak penuh. Penyimpanan sel namalwa dalam 70 % medium, 20 % FBS dan 10 % DMSO, densitas maksimum pada waktu penyimpanan adalah 5-6X106 sel/ml (www.DSMZ.com). Penyimpanan sel harus menjaga penurunan temperatur, pertama tama suhu 4 °C selama 30 menit, kemudian -20 °C selama 2 jam dan terakhir pada suhu -70 °C selama 24 jam, setelah itu baru disimpan di nitrogen cair. 3 Gambar 1 Morfologi sel Namalwa. HL-60 (Gambar 2) adalah sel leukimia akut mieloid pada manusia. Sel ini diisolasi dari saluran darah seorang wanita Caucasian berusia 35 tahun yang mengidap penyakit leukimia akut mieloid pada tahun 1976. Sel HL-60 sering digunakan sebagai organisme uji invitro, contohnya antara lain untuk melihat pengaruh DMSO, phorbol ester TPA dan reagen lainnya, menjelaskan mekanisme gen MYC (www.DSMZ.com). HL-60 tipe liar memiliki sifat yang cepat tumbuh dan mengekspresikan oncogen. Selain itu HL-60 dapat menyerupai megakariot dan prekusor eritrosit. Sel ini berbentuk bulat dan hidup tersuspensi dalam media. Sel HL-60 ditumbuhkan dalam 80 % media RPMI 1640 + 10 % FBS + 10 % PSF. HL-60 ditumbuhkan dengan densitas awal 0.5-1.0 x 106 sel/ml, setelah sel mencapai densitas 1.5-2 x 106 sel/ml sel harus dibagi agar tidak penuh. Pembagian sel ini dilakukan kurang lebih setiap 1-2 hari. Sel diinkubasi dalam inkubator CO2 pada suhu 37 °C, Rh 90 % (www.DSMZ.com). Penyimpanan sel HL-60 dengan mensuspensikan sel dalam 200-300 µl, 90 % FBS + 10 % DMSO dan dibekukan dengan menjaga penurunan temperatur. Pertama – tama pada suhu 4 °C selama 30 menit, kemudian -20 °C selama 2 jam dan terakhir pada suhu -70 °C selama 24 jam, setelah itu baru disimpan di nitrogen cair. Gambar 2 Morfologi sel HL-60. Herba Vulkanis Herba vulkanis adalah tanaman tidak berkayu yang tumbuh di tanah vulkanis. Tanah vulkanis mengandung unsur hara yang diperlukan oleh tumbuhan. Tumbuhan yang tumbuh di daerah vulkanis mengandung senyawa-senyawa yang dapat digunakan sebagai obat berbagai penyakit, seperti selenium (Se), sulfur (S), besi (Fe) dan sebagainya. Pada penelitian ini, herba vulkanis terseleksi yang digunakan yaitu ciplukan rinjani dan bawang putih rinjani. Ciplukan (Gambar 3) memiliki nama latin Physalis minima L. Ciplukan termasuk dalam divisio Spermatophyta, subdivisi Angiospermae, kelas Dicotyledoneae, ordo Solanales, famili Solanaceae, genus Physalis L, spesies Physalis minima L. Ciplukan dikenal dengan berbagai istilah: Morel berry (Inggris), Ciplukan (Indonesia), Ceplukan (Jawa), Cecendet (sunda), Yor-yoran (Madura), Lapinonat (Seram), Keceplokan (Bali), Dedes (Sasak), Leletokan (Minahasa). Ciplukan termasuk tumbuhan liar, berupa semak atau perdu yang rendah, biasanya tingginya mencapai 1 meter dan mempunyai umur kurang lebih 1 tahun. Tumbuh pada ketinggian 0-1800 m dpl, tersebar di daerah tegalan, sawah-sawah kering, serta dapat ditemukan di daerah hutan jati. Bunganya berwarna kuning, buahnya berbentuk bulat dan berwarna hijau kekuningan bila masih muda, tetapi bila sudah tua berwarma coklat dengan rasa asam manis. Buah ciplukan yang masih muda dilindungi cangkap (Suara Merdeka 2004). Tumbuhan ini memiliki efek farmakologis seperti analgetik, peluruh air seni, menetralkan racun, meredakan batuk, dan mengaktifkan fungsi kelenjar tubuh. Akar, daun, dan buah ciplukan dapat digunakan untuk mengobati diabetes. Penelitian ini menggunakan ekstrak air daun ciplukan yang tumbuh di kawasan gunung Rinjani. Bawang putih (Gambar 4) memiliki nama latin Allium sativum termasuk divisio Spermatophyta, subdivisi Angiospermae, kelas Monocotyledoneae, ordo Liliflorae, famili Liliaceae, genus Allium, spesies Allium sativum L (Syamsiah 2003). Khasiat bawang putih tergantung pada tempat tumbuhnya. Bawang putih yang tumbuh di tanah kaya selenium akan mengandung selenium yang tinggi pula sehingga dapat bermanfaat sebagai obat antipenuaan dan antikanker. Berdasarkan hasil penelitian ditemukan bahwa bawang putih mengandung senyawa selenium dalam bentuk selenoprotein yang berfungsi sebagai antioksidan dan antikanker. Gambar 3 Ciplukan (Physalis minima) rinjani. 4 Gambar 4 Bawang putih (Allium sativum) rinjani. Bakteri termofil Geobasillus Bakteri termofil memiliki karakter dapat tumbuh pada kondisi ekstrim seperti suhu, pH dan konsentrasi garam disebut sebagai ekstremofil. Bakteri termofil dapat tumbuh pada suhu diatas 45 ºC dan diantaranya dapat tumbuh diatas 80 ºC. Mikroorganisme ini dapat dengan mudah ditemukan pada daerah dengan aktivitas geotermal seperti daerah pegunungan berapi, sumber air panas, dan tempat cadangan minyak bumi dan batu bara. Beberapa organisme termofil telah diisolasi dari beberapa sumber air panas di Indonesia antara lain, sumber air panas Sileri, Cimanggu, kawah Domas, kawah Papandayan, dan kawah Wayang. Mikroorganisme termofil yang diisolasi dari kawah Wayang merupakan kelompok basil yang memiliki kekerabatan yang dekat dengan Geobasillus thermoleovorans (Indrajaya 2003). Pada penelitian ini digunakan ekstrak bakteri termofil Geobasillus 22a (Gambar 5) sebagai sumber bioaktif senyawa selenium. Bakteri diisolasi dari sumber air panas kawasan Gunung Rinjani. Bakteri termofil ini memiliki morfologi berbentuk batang dan tumbuh baik pada suhu 50 ºC. Gambar 5 Penampakan mikroskopis Geobasillus 22a difoto dengan perbesaran 1000X. menggunakan sekuens DNA dan asam amino serta informasi yang berkaitan dengannya. Contoh topik utama bidang ini meliputi basis data untuk mengelola informasi biologis, pensejajaran sekuens (sequence alignment), prediksi struktur untuk meramalkan bentuk struktur protein maupun struktur sekunder RNA, analisis filogenetik, dan analisis ekspresi gen. Beberapa bank data yang bersifat antar negara seperti GenBank (USA), EMBL (Eropa), DDBJ (Jepang) telah mengorganisir penyimpanan urutan DNA, RNA dan protein sehingga dapat diakses melalui internet. Pencarian database umumnya berdasarkan hasil pensejajaran sekuen, baik sekuen DNA maupun protein. Salah satu perangkat lunak pencari database yang paling berhasil dan umum digunakan yaitu BLAST ( Basic Local Aligment Search Tool). Perangkat lunak ini telah diadaptasi untuk melakukan pensejajaran terhadap berbagai sekuen DNA maupun protein. Hasil BLAST dapat memberikan informasi mengenai homologi suatu sekuen DNA, RNA ataupun protein (www.wikipedia.com). Pada kebanyakan aplikasi PCR, primer harus didesain agar dapat berkomplementer secara tepat dengan DNA templat. Desain primer dapat dilakukan dengan bantuan program komputer untuk hasil yang lebih efektif. Faktor yang mempengaruhi karakter primer dalam PCR seperti melting temperature (Tm) dan kemungkinan homologi antara primer dapat diprogram dalam komputer. Dalam mendesain primer harus dihindari terjadinya primer dimer dan sedapat mungkin dihindari adanya ketidaksesuaian (mismatches) antara primer dengan templat. Kadar basa G dan C dari suatu primer seharusnya dalam jumlah yang relatif besar (40-60 %) karena hal ini berpengaruh pada penentuan suhu leleh dan suhu penempelan dari PCR. Desain primer dapat dilakukan dengan menggunakan program primer3 yang bisa diakses dari internet. Isolasi mRNA Bioinformatika Bioinformatika adalah ilmu yang mempelajari penerapan teknik komputasi untuk mengelola dan menganalisis informasi biologis. Bidang ini mencakup penerapan metode-metode matematika, statistika, dan informatika untuk memecahkan masalahmasalah biologis, terutama dengan RNA (Ribonucleic Acid) adalah senyawa kimia pembawa informasi genetik yang terdiri atas monomer ribonukleosida monofosfat yang dihubungkan oleh ikatan fosfodiester. Dalam sel, RNA memiliki beberapa bentuk yaitu rRNA (Ribosomal RNA), tRNA (transfer RNA), dan mRNA (messenger RNA). rRNA merupakan komponen utama 5 penyusun ribosom yang berperan dalam sintesis rantai protein, tRNA berfungsi membawa asam amino yang sesuai dengan kodon mRNA dalam proses translasi, sedangkan mRNA merupakan model cetakan dalam proses penyusunan asam amino pada rantai polipeptida. Tahap isolasi mRNA merupakan kunci keberhasilan proses RT-PCR. Isolasi mRNA dilakukan dengan metode MicroFastTrack 2.0 mRNA Isolation Kit dari Invitrogen. Isolasi mRNA memanfaatkan karakteristik ekor poli (A) pada ujung 3’ mRNA yang dapat berikatan dengan oligo(dT) selulosa. Kuantitas mRNA dapat diketahui dengan metode spektrofotometer. Absorbsi sinar UV oleh mRNA secara optimal dicapai pada panjang gelombang 260 nm. RT-PCR (Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction) PCR merupakan suatu reaksi in vitro untuk menggandakan jumlah molekul DNA pada target tertentu dengan cara mensintesis molekul DNA baru yang berkomplemen dengan molekul DNA target tersebut dengan bantuan enzim dan oligonulkleotida sebagai primer dalam suatu thermocycler. Komponen utama pada PCR adalah: (1) DNA sampel, (2) Bufer PCR, (3) dNTPs (Deoxyoligonucleoside Triphosphates), (4) MgCl2, (5) Primer, (6) Enzim DNA polimerase. Sampel yang digunakan dapat berupa DNA genom atau genomic library. Bufer merupakan komponen yang sangat bervariasi dalam PCR. Beberapa komponen dasar dari bufer PCR ini adalah Tris-HCl dan KCl dalam pH basa. dNTPs merupakan campuran dari empat macam nukleosida (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) yang merupakan bahan dasar polimerase dengan konsentrasi optimum 10-15 μM. Konsentrasi ion Mg dalam reaksi sangat dipengaruhi pada konsentrasi dNTP. Konsentrasi MgCl2 yang optimum adalah 0.5-5.0 mM. Primer merupakan suatu oligonukleotida dengan panjang 15-30 urutan basa. Konsentrasi primer yang umum digunakan antara 0.1-1.0 µM. Taq Polimerase digunakan untuk PCR karena tahan panas sehingga memungkinkan proses penempelan dan pemanjangan dilakukan pada berbagai kondisi suhu (Newton & Graham 1994). Prinsip pelipatgandaan jumlah molekul DNA pada target yang diinginkan melalui teknik PCR adalah: (1) denaturasi, (2) penempelan (annealing), (3) pemanjangan primer (extension). Denaturasi berlangsung pada suhu di atas 92 ºC dan ditandai oleh memisahnya rantai ganda DNA menjadi dua rantai tunggal. Penempelan primer umumnya berlangsung pada suhu antara 37-65 ºC dan ditandai dengan menyatunya kembali dua untai tunggal DNA tersebut. Karena terdapat primer dalam jumlah yang jauh lebih besar dari DNA yang akan diamplifikasi maka primer akan mempunyai kesempatan yang lebih besar untuk melekat pada DNA rantai tunggal pasangannya. Pemanjangan primer berlangsung pada suhu antara 68-75 ºC dan ditandai oleh sintesis DNA dari primer tersebut mengikuti urutan nukleotida DNA rantai tunggal pasangannya (Watson 1992). RT-PCR merupakan kombinasi dari sintesis cDNA dengan PCR. Berbeda dengan PCR, sampel untuk RT-PCR berupa RNA total atau RNA yang mengandung poli (A)+. Primer yang digunakan dapat berupa primer acak, oligo (dT), atau sebuah primer spesifik, yang semuanya menggunakan enzim reverse transcriptase. RT-PCR dapat dilakukan melalui satu tahap atau dua tahap. Pada RTPCR dua tahap, sintesis cDNA dilakukan pertama kali dalam bufer RT kemudian dilanjutkan dengan PCR. Sedangkan pada RTPCR satu tahap, kedua reaksi terjadi dalam satu tabung pada mesin PCR. Hasil dari RT-PCR dianalisis dengan elektroforesis gel agarosa dengan bufer TAE (Tris-asam asetat-EDTA). Pengamatan hasil elektroforesis dengan bantuan Etidium Bromida (EtBr) dibawah sinar UV. Molekul DNA yang tersisipi EtBr dapat berfloresensi di bawah sinar UV. Jumlah molekul EtBr yang berikatan dengan DNA sebanding dengan jumlah DNA, sehingga intensitas pitapita DNA yang diamati dalam gel sebanding dengan kuantitas DNA. BAHAN DAN METODE Bahan dan Alat Bahan-bahan yang digunakan adalah ekstrak herba vulkanis (daun ciplukan dan bawang putih rinjani), ekstrak Geobasillus 22a, kultur sel kanker namalwa dan HL-60, ekstrak ragi, pepton, glukosa, agar, pinisilin, streptomisin, L-Glutamin, media RPMI 1640, FBS (Fetal Bovine Serum), PSF (Pinicillin Streptomycin Fungizone) , akuades, etanol 100 %, MicroFastTrack 2.0 mRNA Isolation Kit (Invitrogen), Phosphate Buffer Saline (PBS) pH 7.4, akuades bebas ion, etanol absolut, SuperScript one-step RT-PCR System 6 with Platinum Taq DNA Polymerase Kit (Invitrogen), primer, gel agarosa, marker 100bp Ladder, bufer TAE, EtBr. Alat-alat yang digunakan terdiri atas sentrifus 5804R dan 8000r, sentrifus Hettich EBA 8S, laminar air flow hood, inkubator CO2, flask, hemasitometer, waterbath Memmert, sonikator B.Braun Labsonic, seperangkat alat elektroforesis Bio-rad, Milton Roy Spectronic 1201, Perkin Elmer Gene Amp PCR System 2400, neraca Mettler PC4400, Rocking platform Certomat, mikroskop nikon eclipse e400, mikropipet, siringe 10 cc steril yang ujungnya terpasang jarum berukuran 21, pipet tip steril, tabung Eppendorf, shaker, autoklaf, oven, blender, microfilter 0.22 μm dan alat-alat gelas. Metode Metode penelitian dimulai dari mencari dan mengambil sekuen dari GenBank, mendesain primer, pembuatan ekstrak herba vulkanis (ciplukan dan bawang putih rinjani) dan ekstrak bakteri Geobasillus 22a, treatment sel kanker Namalwa dan HL-60 menggunakan ekstrak herba vulkanis dan ekstrak bakteri, isolasi RNA hingga uji ekspresi gen CDK5 dan ACTB melalui RT-PCR. Mencari dan Mengambil Sekuen dari GenBank Homepage diketik www.ncbi.nlm. nih.gov,/GenBank/ setelah masuk dalam homepage yang dimaksud, kata kunci nukleotida diketik ”CDK5”. Kemudian kombo search diubah menjadi nukleotida pada kotak dialog for yang masih kosong, terakhir tombol go diklik. Accesion number diklik, selanjutnya akan muncul sekuen gen CDK5 mRNA. Demikian juga untuk gen ACTB. Desain Primer Homepage diketik http://wwwgenome.wi.mit.edu/cgibin/primer/primer3ww w.cgi. Kemudian sekuen kita dikopi dan paste pada box sekuen. Klik kolom oligo dan kemudian dienter. Untuk mengetahui adanya dimer, hairpan pada primer masuk ke homepage http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ BLAST/ primer yang akan diblast dikopi dan dipaste pada box sekuen, Box database diubah menjadi nukleotida-nukleotida, kemudian klik format. Pembuatan Ekstrak Herba Vulkanis Ekstrak herba vulkanis diperoleh dengan cara maserasi dalam pelarut air. Herba vulkanis (daun ciplukan dan bawang putih rinjani) dikeringkan dalam oven bersuhu 60 ºC selama 2 hari kemudian dihaluskan hingga berbentuk bubuk. Satu gram sampel daun ciplukan dan bawang putih rinjani diekstrak dengan 5.0 ml akuades bebas ion steril dalam tabung sentrifuse dan di kocok selama 24 jam. Campuran disentrifugasi kemudian disaring dengan filter berukuran 0.22 μm. Pembuatan Ekstrak Bakteri Geobasillus 22a Bakteri Geobasillus 22a diinokulasi ke dalam 600 mL media heterotrof yang ditambah natrium selenit 10 ppm dan diinkubasi di dalam oven 50 ºC selama 5 hari. Geobasillus dikumpulkan dengan cara sentrifugasi 10000 rpm 6 menit suhu ruang. Pelet bakteri dicuci dengan 10 mL PBS sebanyak 3 kali. Pada pencucian terakhir, pelet digabung kemudian disuspensikan dalam 5 mL PBS. Selanjutnya pelet sel disonikasi selama 20 menit pada power level 50 dan duty cycle 0.7. Sel hasil sonikasi kemudian disentrifugasi dengan kecepatan yang sama. Supernatan disaring dengan filter berukuran 0.22 μm. Pembuatan Media dan Peremajaan Kultur Sel Kanker Media RPM1 1640 Gibcol BRL dengan LGlutamine ditambah 37 g NaHCO3 dan 10 ml NAA (asam amino nonesensial), kemudian dikocok dengan stirer sampai larut. Setelah homogen ditambahkan aqudes sampai 1000 ml, pHnya dibuat 7.2 kemudian disaring dengan menggunakan milipore membran. Setelah itu ditambahkan 10 ml PSF dan FBS 10 %. Kultur sel kanker Namalwa dan HL-60 diremajakan dengan menumbuhkan kultur sel dalam medium RPMI 1640 yang ditambahkan 10 % FBS kemudian diinkubasi pada inkubator CO2 dengan kondisi suhu 37 ºC, 5 % CO2 dan Rh (kelembapan) 90 % selama 24 jam. Setelah 24 jam sebagian media sel kanker namalwa dan HL-60 di buang, diganti dengan media yang baru kemudian diinkubasi kembali dalam inkubator CO2. Pergantian media dilakukan apabila sel sudah penuh. Perhitungan Sel Kanker dan Perlakuan dengan Ekstrak Kasar Herba Vulkanis Sel namalwa dan HL-60 termasuk sel yang tersuspensi dalam media, sehingga untuk menghitung jumlah sel/ml, sel dalam flask dipipet kemudian diteteskan pada hemasitometer. Sel dalam hemasitometer 7 dihitung dibawah mikroskop dengan perbesaran 10X. Sel dengan densitas dan viabilitas yang tinggi siap untuk di beri perlakuan. Pertama-tama sel disentrifus, supernatan di buang. Pelet sel di tambah 4 ml media baru dan disuspensikan. Sel dipindahkan dalam wellplate masing masing 1 ml dan ditambahkan ekstrak masing-masing 1 ml kemudian diinkubasi selama 12 jam. Isolasi mRNA Isolasi mRNA menggunakan MikroFastTrack 2.0 mRNA Isolation Kit dari invitrogen. Metode isolasi terdiri atas beberapa tahap yaitu preparasi sampel sel, isolasi mRNA, pencucian, elusi dan presipitasi mRNA. Tahap preparasi sampel, sel kanker namalwa dan HL-60 setelah diberi perlakuan dicuci dengan Phosphate Buffer Saline (PBS) bersuhu 4 ºC sebanyak 3 kali. Sel namalwa dan HL-60 masing-masing disuspensikan dan dilisis dengan menambahkan 1ml bufer lisis FastTrack 2.0 (20 μl protein degrader + 1ml stok buffer) ke pelet lalu dihomogenkan dengan pipet tip. Lisat dilewatkan pada siringe steril yang ujungnya terpasang jarum berukuran 21 sebanyak 2 kali. Tahap isolasi mRNA, lisat sel diinkubasi pada suhu 45 ºC selama 20 menit. Kemudian lisat disentrifuse 4000 rpm selama 5 menit pada suhu ruang dan sebanyak 800 μl dipindahkan ke tabung sentrifuse baru. Selanjutnya ditambahkan 55 μL larutan stok NaCl 5 M. Campuran dihomogenkan dengan membolak-balikkan tabung. Sisa DNA disingkirkan dengan melewatkan lisat pada siringe steril dengan jarum berukuran 21 sebanyak 2 kali. Lisat dituangkan ke dalam tabung oligo(dT) selulosa. Tabung ditutup dan dibiarkan selama 2 menit hingga oligo(dT) terdispersi sempurna. Tabung dikocok di atas rocking platform selama 20 menit pada suhu ruang. Selulosa oligo(dT) diperoleh melalui sentrifugasi 4000 rpm selama 5 menit pada suhu ruang. Supernatan dibuang secara hatihati. Tahap pencucian, Oligo(dT) selulosa disuspensikan dalam 1.3 mL binding buffer selanjutnya disentrifuse 4000 rpm selama 5 menit pada suhu ruang. Tahap tersebut diulang sebanyak 2 kali. Bufer disingkirkan dari selulosa. Selulosa disuspensikan kembali dalam 0.3 mL binding buffer dan dipindahkan ke spin kolom kemudian disentrifuse 4000 rpm selama 10 detik pada suhu ruang. Kolom dipindahkan dari tabung mikrosentrifuse dan cairan dalam tabung dibuang. Spin kolom ditempatkan kembali ke dalam tabung dan ditambahkan 500 μL binding buffer kemudian disentrifuse 4000 rpm 10 detik suhu ruang. Tahap ini diulang lagi sebanyak 3 kali. Selanjutnya ditambahkan 200 μL Low Salt Wash Buffer ke dalam kolom. Selulosa dan bufer dihomogenkan dengan pipet tip steril dan disentrifuse 4000 rpm 10 detik suhu ruang. Tahap elusi dan presipitasi mRNA, Spin kolom ditempatkan dalam tabung mikrosentrifus yang baru. Sebanyak 100 µl elution buffer dicampurkan ke dalam selulosa dengan menggunakan pipet tip steril. Tabung dan isinya disentrifuse 4000 rpm selama 10 detik suhu ruang. Selanjutnya ditambahkan kembali 100 µl elution buffer ke kolom, dihomogenkan dan disentrifuse lagi selama 10 detik. Kolom dipindahkan dan dalam tabung berisi 200 µl sampel mRNA. mRNA diendapkan dengan menambahkan 30 µl sodium asetat 2 M dan 600 µl etanol absolut dan 100 µl glycogen carrier 2 mg/mL lalu dibekukan dalam freezer. Sampel mRNA dicairkan dan disentrifuse 14000 rpm selama 30 menit pada 4 ºC. Supernatan (etanol) dibuang, disentrifuse singkat dan sisa etanol yang tertinggal dikeringanginkan dengan membuka tutup tabung. Pelet disuspensikan dalam 10 µl elution buffer. RT-PCR (Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction) RT-PCR menggunakan SuperScript OneStep RT-PCR System with Platinum Taq DNA Polymerase Kit (invitrogen). Reaksi terdiri atas dua tahap yaitu sintesis cDNA dan PCR dalam satu tabung dengan menggunakan primer spesifik gen yang diinginkan. Sintesis cDNA diawali dengan menyiapkan master mix dalam 2 tabung eppendorf 1.5 mL, masing-masing berisi 200 μL 2X reaksi bufer, 16 μL RT Platinum taq mix dan 156 μL dH2O bebas ion steril. Tabung pertama (a) ditambahkan primer actb forward dan actb reverse masing-masing 8 μL. Tabung kedua (b) ditambahkan primer cdk5 forward dan cdk5 reverse masing-masing 8 μL. Primer yang digunakan dalam reaksi: actb forward : 5’-CAGGATTCCATACCCA-3’ actb reverse : 3’-GAGAAGATCTGGCACC-5’ cdk5 forward : 5’-TGAGGTGGTCACACTGTGGT-3’ cdk5 reverse : 3’-CTGGTCATCGACATCATTGC-5’ 8 Selanjutnya disiapkan 16 buah tabung PCR Tabung 1 dan 2 merupakan blanko, masing-masing berisi 2 μL sampel mRNA Namalwa-akudes bebas ion, tabung 3 dan 4 berisi masing-masing 2 μL sampel mRNA Namalwa-ciplukan, tabung 5 dan 6 berisi masing-masing 2 μL sampel mRNA Namalwa-bawang putih sedangkan tabung 7 dan 8 berisi masing-masing 2 μl sampel mRNA Namalwa-bacthotermo. Untuk sel HL60-akuades bebas ion tabung 9 dan 10 masing-masing berisi 2 μL sampel mRNA yang merupakan blanko, tabung 11 dan 12 masing-masing berisi 2 sampel mRNA HL60-ciplukan, tabung 13 dan 14 masing-masing berisi 2 sampel mRNA HL-60-bawang putih, tabung 15 dan 16 masing-masing berisi sampel mRNA HL-60-bacthotermo. Tabung 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, dan 15 masing-masing ditambahkan master mix dari tabung (b) sebanyak 48 μL. Sedangkan tabung 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, dan 16 ditambahkan master mix dari tabung (a) masing-masing sebanyak 48 μL. Total volume tiap tabung menjadi 50 μL. Sampel dimasukkan dalam mesin PCR dan diset pada hold suhu 50 ºC selama 30 menit untuk sintesis cDNA. Reaksi diakhiri dengan menekan tombol stop. Kemudian masuk ke siklus PCR yang telah diprogram untuk di running. Elektroforesis dilakukan pada buffer TAE 1X dengan tegangan 90 volt selama 1.5 jam. Selesai elektroforesis gel divisualisasikan pada lampu ultraviolet (UV) dan difoto dengan kamera digital. Marker yang digunakan yaitu marker 100 bp Ladder. Intensitas pita diukur dengan Bio Rad Count TM Software. Tabel 1 Pengaturan suhu dan siklus PCR Suhu Waktu Banyaknya (ºC) mm:ss siklus predenaturasi 94 4:00 1 siklus denaturasi 94 0:30 penempelan 60 0:30 40 siklus pemanjangan 65 0:30 Pemanjangan 65 7:00 1 siklus tambahan Primer cdk5 didesain dengan mengunakan program primer3. Program primer3 menghasilkan primer cdk5 forward yaitu 5’tgaggtggtcacactgtggt’3 dan untuk primer cdk5 reverse 3’ctggtcatcgacatcattgc’5. Sedangkan untuk primer actb forward yaitu 5’caggattccataccca’3 dan primer actb reverse 3’gagaagatctggcacc’5. Tm primer cdk5 forward dan cdk5 reverse masing-masing 60.05 ºC dan 60.08 ºC. Cdk5 forward menempel pada basa nukleotida ke 541 sedangkan cdk5 reverse menempel pada 693 sehingga produk PCR berukuran 154 pasang basa. Output primer3 cdk5 tersebut memenuhi syarat dari segi panjang primer, perbedaan panjang primer, perbedaan Tm kedua primer dan komposisi basa G+C. Panjang primer cdk5 20 nukleotida sedangkan yang disyaratkan antara 18 sampai 25 nukleotida. Perbedaan panjang kedua primer 0 pb sedangkan syaratnya 3 pb. Perbedaan Tm primer cdk5 memenuhi syarat <5 ºC yaitu hanya 0.03 ºC. Komposisi basa G+C primer cdk5 dari 50-55 % memenuhi syarat 40-60 %. Tetapi pada cdk5 kiri tidak memenuhi syarat dalam hal basa ujung 3’ berupa timin. Ujung 3’ kedua primer seharusnya G atau C agar Analisis Hasil RT-PCR Analisis hasil RT-PCR dilakukan dengan elektroforesis menggunakan gel agarosa 1.5 %. Agarosa sebanyak 1,5 g dilarutkan dalam buffer TAE 1X sampai volumenya mencapai 100 ml dengan cara dipanaskan dalam microwave oven, lalu dibiarkan sampai suhunya mencapai 50-60 ºC. Kemudian larutan ditambah 3 μl EtBr hingga merata, dan segera dituangkan dalam cetakan gel. Setelah gel memadat, sisir (comb) diangkat, lalu gel dipindahkan ke tangki elektroforesis yang berisi bufer TAE 1X. Sampel hasil RT-PCR sebanyak 15 μl dicampur dengan 3 μl blue juice. Stok Marker 100bp ladder sebanyak 15 μL dicampur dengan 3 μL blue juice. Kemudian campuran tersebut dimasukkan ke dalam sumur gel HASIL DAN PEMBAHASAN Penelusuran Informasi Gen pada GenBank Sekuen gen cdk5 Homo sapiens diperoleh dari GenBank dengan nomor akses NM_004935. Gen cdk5 tersusun atas 1143 basa nukleotida. Coding sekuen dimulai dari basa ke 62 sampai 940 yang akan ditranslasikan menjadi protein CDK5 (cyclindependent kinase 5). Sedangkan sekuen gen actb diperoleh dari GenBank dengan nomor akses NM_001101. Gen actb tersusun atas 1793 basa nukleotida. Coding sekuen dimulai dari basa ke 74 sampai 1201 yang akan ditranslasikan menjadi protein ACTB. Sekuen gen cdk5 dan actb dapat dilihat pada lampiran 4 dan 5. Desain Primer 9 stabilitasnya cukup karena ikatan G-C lebih kuat daripada A-T. Selain itu juga terdapat basa komplemen sebanyak 11 pasang basa untuk primer cdk5. Adanya basa komplemen ini memungkinkan terjadinya primer dimer. Primer cdk5 yang dihasilkan diuji dengan program BLASTN untuk mengetahui adanya dimer hairpan pada primer. Hasil yang diperoleh dari program BLASTN menunjukkan bahwa primer cdk5 memiliki homologi dengan Mus musculus chromosome 5. Primer cdk5 mempunyai homologi hanya dengan satu spesies, berarti primer tersebut masih spesifik untuk gen cdk5. Peremajaaan dan Perhitungan Kultur Sel Kanker disesuaikan dengan kecepatan membelah (doubling time) sel. Pergantian media dilakukan untuk mencegah inhibisi kontak atau inhibisi karena kepadatan. Perhitungan jumlah sel dilakukan dengan mengunakan metode hitungan mikroskopis langsung yaitu metode hemasitometer. Metode hemasitometer ini merupakan metode perhitungan langsung yang sangat cepat dan tidak memerlukan banyak peralatan. Jumlah sel Namalwa dan HL-60 setelah ditumbuhkan selama 24 jam sebanyak 2,8 x 105 dan 6 x 104. Jumlah ini sudah memenuhi syarat untuk diisolasi mRNAnya. Standar jumlah sel, bahwa sel telah memenuhi syarat untuk diisolasi mRNAnya adalah 1x 102-5x106. Apoptosis pada Sel Kanker Kultur sel Namalwa dan HL-60 merupakan sel leukimia. Leukimia adalah penyakit yang disebabkan karena sumsum tulang mengalami kegagalan dalam memproduksi sel darah putih yang normal dan terjadi pertumbuhan yang tidak normal pada sel bakal (stem sel). Perbedaan sel Namalwa dan HL-60 terletak pada sel bakal yang mengalami kelainan. Sel Namalwa adalah sel leukimia yang mengalami kelainan diferensiasi dan pertumbuhan dari sel limfoid. Sedangkan HL-60 adalah sel leukimia yang mengalami kelainan diferensiasi dan pertumbuhan dari sel mieloid. Sel Namalwa dan sel HL-60 tumbuh optimal pada media RPMI 1640. Pada media RPMI 1640 ditambahkan 10 % FBS bertujuan untuk memenuhi kebutuhan protein pada pertumbuhan kultur sel. Fungsi lainnya antara lain mengontrol pertumbuhan kultur sel dan menetralisir senyawa toksin yang menganggu pertumbuhan kultur sel. Sedangkan penambahan NaHCO3 pada pembuatan media berfungsi sebagai bufer yang menjaga kestabilan pH media agar tidak terlalu asam atau terlalu basa. Sedangkan penambahan PSF berfungsi untuk mencegah pertumbuhan jamur, bakteri, khamir, dan mikrooganisme lain yang dapat menganggu pertumbuhan sel. Pergantian media pada sel namalwa dilakukan setiap 24 jam, sedangkan untuk HL-60 setiap 48 jam. Perbedaan waktu pergantian media Sel Namalwa setelah perlakuan dengan ekstrak daun ciplukan rinjani, bawang putih rinjani, dan bakteri Geobacillus 22a selama 12 jam, melalui pengamatan secara mikroskopis mengalami perubahan ukuran sel. Sel menjadi kecil atau petit, fenomena ini dapat dilihat pada Gambar 6. Petitnya sel Namalwa mengindikasikan terjadinya peristiwa apoptosis. Perlakuan penambahan ekstrak daun ciplukan rinjani, bawang putih rinjani, dan bakteri Geobacillus 22a pada sel Namalwa, menunjukkan bahwa dengan penambahan ekstrak tersebut jumlah sel yang mengalami petit meningkat dibandingkan dengan blanko. Peningkatan jumlah sel Namalwa yang mengalami petit mengindikasikan bahwa dengan penambahan ekstrak daun ciplukan rinjani, bawang putih rinjani, dan bakteri Geobacillus 22a yang memiliki senyawa selenium dapat meningkatkan peristiwa apoptosis. Pada blanko sel namalwa (Gambar 6A) menunjukkan adanya sel petit yang seharusnya menurut teori, sel kanker tidak mengalami apoptosis. Fenomena ini menunjukkan bahwa perlakuan dengan air menyebabkan konsentrasi diluar sel lebih rendah daripada didalam sel, sehingga lamanya waktu inkubasi menyebabkan sel mengalami plasmolisis. Sel yang mengalami plasmolisis akan menjadi petit. 10 (A) (B) (C) (D) Gambar 6 Foto sel namalwa setelah perlakuan dengan skala 40% : 35%. A= blanko namalwa, B= namalwa-ekstrak daun ciplukan rinjani, C= namalwa-ekstrak bawang putih rinjani D= namalwa-ekstrak bakteri Geobasillus 22a. Pada sel HL-60 setelah perlakuan (Gambar 7) dengan ekstrak daun ciplukan rinjani, bawang putih rinjani dan bakteri Geobacillus 22a, melalui pengamatan secara mikroskopis juga mengalami petit seperti pada sel namalwa. Hal ini mengindikasikan (A2) (C2) bahwa sel HL-60 juga mengalami apoptosis setelah perlakuan. Senyawa selenium yang terdapat pada ekstrak daun ciplukan rinjani, bawang putih rinjani dan bakteri Geobacillus 22a juga mampu meningkatkan sel petit pada sel HL-60. (B2) (D2) Gambar 7 Foto sel HL-60 setelah perlakuan dengan skala 40% : 35%. A2= blanko HL-60, B2= HL-60+ekstrak ciplukan rinjani, C2= HL-60+ekstrak bawang putih rinjani, D2= HL-60+ekstrak bakteri Geobasillus 22a. 11 Petitnya sel Namalwa dan HL-60 menunjukkan bahwa terjadi kerusakan fungsi mitokondria pada sel tersebut. Mitokondria berperan dalam pembentukkan energi seluler ATP. Apabila terjadi kerusakan pada mitokondria sel akan kekurangan energi seluler ATP sehingga menjadi lemah, tidak mempunyai cukup energi untuk melakukan pembelahan sel sehingga ukurannya menjadi kecil (petit). Isolasi mRNA Pada tahap preparasi sampel, sel Namalwa dan HL-60 dilisis dengan menambahkan bufer lisis yang berisi SDS dan protein/Rnase degrader. SDS merupakan sejenis deterjen sehingga akan melarutkan lipid yang merupakan komponen membran sel, sedangkan protein/RNase degrader akan memecah protein dan menginaktifkan RNase yang dapat merusak RNA. Isi sel yang lain seperti polisakarida, protein dan DNA dipisahkan dari RNA dengan melewatkan lisat pada siringe dengan jarum berukuran 21. Penambahan oligo(dT) berfungsi mengikat mRNA. Oligo(dT) akan berikatan dengan mRNA yang memiliki poli-A pada ujung OH diposisi 3’. Penambahan NaCl dan pengocokan diatas rotator berfungsi untuk mempermudah pengikatan RNA (pemekatan). Pencucian resin RNA mengunakan Binding Buffer untuk memisahkan RNA dengan DNA dan protein kontaminan yang masih terbawa. Sedangkan pencucian resin RNA menggunakan Low Salt Wash Buffer bertujuan untuk menghilangkan sisa SDS dan kontaminan RNA berupa rRNA. mRNA dielusi dari oligo(dT) dengan elution buffer. Penambahan sodium asetat, glikogen dan etanol absolut bertujuan untuk mengendapkan mRNA kemudian disimpan dalam -80 °C sampai membeku. mRNA hasil isolasi ini digunakan sebagai sampel untuk RT-PCR. templat dengan pemanasan 94 ºC selama 30 detik. Primer spesifik gen cdk5 dan actb menempel pada pita cDNA pada pemanasan 60 ºC selama 30 detik. Proses pemanjangan oleh Platinum taq Polimerase berlangsung pada suhu 65 ºC selama 30 detik. Proses ini terus berulang sampai 40 siklus. Pada akhir proses amplifikasi diberikan pemanjangan tambahan pada suhu 65 ºC selama 7 menit. Setelah selesai RT-PCR, produk RT-PCR dielektroforesis untuk melihat hasil ekspresi gen cdk5 dan actb pada gel agarosa 1.5 %. Hasil elektroforesis dari sampel sel Namalwa ditunjukkan pada Gambar 8. Dari sana dapat dilihat bahwa sample 1, 3, dan 7 merupakan ekspresi gen cdk5 yang ditunjukkan oleh pita amplikon berukuran 154 pb. Dan sampel 2,4,8 merupakan ekspresi gen actb yang ditunjukkan oleh pita amplikon berukuran 650 pb. Pada perlakuan dengan air, ekstrak daun ciplukan rinjani dan bakteri Geobasillus 22a menyebabkan gen actb dan cdk5 pada sel Namalwa terekspresi. Peristiwa tersebut menunjukkan terjadinya apoptosis pada sel Namalwa. Sedangkan sel Namalwa yang diberi perlakuan dengan ekstrak bawang putih rinjani tidak mengekspresikan gen actb maupun gen cdk5. Pengamatan secara visual pada agarosa tidak dapat membedakan secara jelas perbedaan intensitas ekspresi gen cdk5. Oleh karena itu diperlukan analisis intensitas pita secara semikuantitatif. Intensitas pita cdk5 secara semikuantitatif disajikan pada Gambar 9. Dari diagram tersebut terlihat ekspresi cdk5 dengan perlakuan ekstrak Geobasillus 22a (GB-cdk5) lebih tinggi dibandingkan dengan perlakuan ekstrak daun ciplukan rinjani (CRcdk5) tetapi keduanya lebih tinggi dibandingkan blanko. 1 2 Ekspresi Gen cdk5 dan actb 800 pb Ekspresi gen cdk5 dan actb dapat dilihat dengan mengunakan RT-PCR. Pertama-tama dilakukan pembuatan cDNA dari templat mRNA lalu dilanjutkan dengan amplifikasi DNA menggunakan PCR. Pembentukan pita cDNA oleh enzim reverse transcriptase pada suhu inkubasi 50 ºC selama 30 menit, selanjutnya enzim dinonaktifkan dengan pemanasan 94 ºC selama 4 menit. cDNA dipisahkan dari 600 pb 3 4 5 6 7 8 100 pb Gambar 8 Pola pita ekspresi gen atcb dan cdk5 pada sel Namalwa setelah perlakuan . Mk = marker, 1 = blanko cdk5, 2 = blanko actb, 3 = CRcdk5, 4 = CR-actb, 6 = BP–actb, 7 = GB-cdk5, 8 = GB–actb. 12 1 0.8 2 3 4 5 6 7 8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 800 pb 0.2 0.1 600 pb 0 Blanko-CDK5 CR-CDK5 GB-CDK5 SAMPEL Gambar 9 Intensitas Ekspresi Gen cdk5 setelah Perlakuan pada Sel Namalwa. Ekstrak bakteri Geobasillus 22a mampu meningkatkan ekspresi gen cdk5 hingga 37.83% sedangkan ekstrak daun ciplukan rinjani hanya 30.81%. Sehingga dapat diambil kesimpulan bahwa ekstrak bakteri Geobasillus 22a 7.02% lebih efektif meningkatkan ekspresi gen cdk5 dibandingkan ekstrak daun ciplukan rinjani pada sel Namalwa. Perlakuan dengan ekstrak bawang putih rinjani pada sel Namalwa tidak mengekspresikan gen cdk5. Hal ini bisa disebabkan karena perlakuan dengan ekstrak bawang putih rinjani tidak mempengaruhi gen cdk5 tetapi mempengaruhi gen yang lain pada sel Namalwa. Atau dapat juga disebabkan karena perlakuan dengan ekstrak bawang putih rinjani pada sel Namalwa tidak mempengaruhi mekanisme apoptosis tetapi mempengaruhi mekanisme lain pada sel Namalwa. Dari Gambar 10 dapat dilihat bahwa sampel 2 dan 8 merupakan ekspresi gen actb pada sel HL-60 yang ditunjukkan oleh pita amplikon berukuran 650 pb. Perlakuan dengan air dan ekstrak bakteri Geobasillus 22a pada sel HL-60 dapat memicu ekspresi dari gen actb. Dari hasil elektroforesis sampel sel HL-60 yang difoto dengan kamera digital tidak terlihat pita gen cdk5. Namun setelah dilakukan analisis intensitas pita secara semikuantitatif dengan Bio Rad Count TM Software, terdapat ekspresi dari gen cdk5. Hal ini disebabkan karena pengambilan foto dengan kamera digital langsung diatas sinar UV, hasilnya tidak terlalu jelas. Hasil intensitas pita cdk5 pada sel HL-60 secara semikuantitatif disajikan pada Gambar 11. 100 pb Gambar 10 Pola pita ekspresi gen actb dan cdk5 pada sel HL-60 setelah perlakuan. Mk = marker, 1 = blanko cdk5, 2 = blanko actb, 3 = CR-cdk5, 4 = CR- actb, 5 = BP-cdk5, 6 = BP-actb, 7 = GB-cdk5, 8 = GB-actb. 1 Intensitas Ekspresi gen CDK5 In te n si tas Ek spre si Ge n C DK5 0.9 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 Blanko CDK5 CR - CDK5 BP - CDK5 GB - CDK5 Sampel Gambar 11 Intensitas Ekspresi cdk5 setelah Perlakuan pada Sel HL-60. Intensitas ekspresi gen cdk5 paling tinggi pada perlakuan dengan ekstrak daun ciplukan rinjani dan paling rendah pada perlakuan dengan ekstrak bawang putih rinjani. Tetapi ketiga sampel memiliki intensitas ekspresi gen cdk5 lebih tinggi dari pada blanko. Ekstrak daun ciplukan rinjani mampu menaikkan ekspresi gen cdk5 sebesar 72.32%. Sedangkan ekstrak bakteri Geobasillus 22a mampu menaikan ekspresi cdk5 sebesar 67.94% dan pada ekstrak bawang putih rinjani sebesar 9.97%. Pada sel HL-60 ekspresi gen cdk5 ditingkatkan secara efektif dengan ekstrak daun ciplukan rinjani. Penambahan ekstrak herba dan bakteri vulkanis mampu meningkatkan ekspresi gen cdk5 pada sel namalwa dan HL-60. Pada sel namalwa, ekspresi cdk5 mengalami peningkatan paling tinggi pada perlakuan dengan ekstrak bakteri Geobasillus 22a, hal ini menunjukkan bahwa ekstrak bakteri Geobasillus 22a dapat lebih memicu terjadinya peristiwa apoptosis. Fenomena ini menunjukkan bahwa konsentrasi selenium yang tinggi mampu memicu apoptosis lebih efektif pada sel namalwa. Sedangkan pada sel HL-60 ekstrak daun ciplukan rinjani lebih memicu peristiwa apoptosis dibandingkan 13 dengan ekstrak yang lain walaupun konsentrasi seleniumnya paling rendah. Peristiwa ini menunjukkan adanya senyawa selenium lain yang lebih efektif memicu apoptosis dengan konsentrasi rendah. Persentase peningkatan ekspresi gen cdk5 pada sel HL-60 lebih tinggi dibandingkan pada sel Namalwa, hal ini bukan disebabkan karena perbedaan jumlah awal sel yang digunakan. Tetapi nilai peningkatan ekspresi gen cdk5 pada sel Namalwa dan HL-60 dibandingkan dengan ekspresi gen actb yang berfungsi sebagai kontrol positif. Mekanisme Apoptosis Daun ciplukan rinjani, bawang putih dan bakteri Geobasillus 22a yang diekstrak dengan air ternyata mampu menarik lebih banyak spesies selenium. Dari hasil penelitian sebelumnya, ekstrak air tersebut mengandung spesies selenoprotein berupa selenometionin. Selenometionin adalah prekursor untuk pembentukan metilselenol yang merupakan metabolit aktif untuk memicu peristiwa apoptosis kultur sel kanker. Metilselenol memicu apoptosis pada kultur sel leukimia (Namalwa dan HL-60). melalui peningkatan ekspresi cdk5 dalam waktu 12 jam masa inkubasi. Kemampuan ekstrak herba dan bakteri vulkanis dalam meningkatkan ekspresi gen cdk5 dan actb dapat dilihat pada Gambar 12. Protein beta aktin adalah protein yang berfungsi mempertahankan bentuk sel dan letak organel di dalam sitoplasma. Protein ini disandikan oleh gen actb. Ekspresi dari gen actb dipicu oleh ekstrak herba dan bakteri vulkanis. Ekspresi gen actb akan berhenti apabila ekstrak herba dan bakteri vulkanis mampu mengganggu fosforilasi aktin sitoskeleton. Ekstraseluler SENYAWA SELENIUM Beta aktin Protein G Intraseluler Adenilat Siklase cAMP tinggi Fosforilasi P53 Ekspresi Gen cdk5 Ca2+ Tinggi Banyak kehilangan energi Ekspresi Gen bax Aktifasi CASPASE Petit APOPTOSIS Gambar 12 Mekanisme Apoptosis melalui Ekspresi Gen cdk5 dan actb (White et al.2001, Charis et al.2003, Zhang et al. 2002). 14 Dalam sitoplasma sel, ekstrak herba dan bakteri vulkanis akan memfosforilasi protein G. Protein G yang aktif akan menstimulasi adenilat siklase dan meningkatkan kadar cAMP dalam sel. Tingginya kadar cAMP akan meningkatkan ekspresi gen cdk5. Peningkatan ekspresi gen cdk5 akan memfosforilasi protein P53. Protein P53 aktif akan memicu ekspresi gen bax, ekspresi gen bax dapat mengaktivasi caspase yang bertugas memotong DNA (fragmentasi DNA) pada sel namalwa dan HL-60, sehingga sel Namalwa dan HL-60 mengalami apoptosis. Kadar cAMP yang terlalu tinggi akan meningkatkan kadar Ca2+ dalam sel, hal ini mengakibatkan protein caspase menjadi aktif. Protein ini yang bertanggungjawab memotong DNA (fragmentasi DNA) sehingga terjadi proses apoptosis pada sel Namalwa dan HL60. Kadar Ca2+ yang tinggi disebabkan karena terbukanya saluran Ca2+ pada membran sel. Kadar Ca2+ yang terlalu tinggi dalam sel akan mengakibatkan sel banyak kehilangan energi seluler (ATP), Sel yang kekurangan ATP akan menjadi lemah, tidak mempunyai cukup energi untuk melakukan pembelahan sel sehingga ukurannya menjadi kecil (petit). Sel petit merupakan indikasi terjadinya apoptosis pada sel Namalwa dan HL-60. SIMPULAN DAN SARAN Saran Penelitian lanjutan diperlukan untuk membuktikan bahwa memang benar gen cdk5 dan actb yang diekspresikan, akibat perlakuan dengan ekstrak herba dan bakteri vulkanis, selain itu dilakukan pencarian mekanisme lain yang dipengaruhi oleh ekstrak bawang putih rinjani pada sel Namalwa. DAFTAR PUSTAKA Charis CH, Charilaos TH, Michael K. 2003 Apoptosis in Heart Failure. Hellenic J Cardiol. 44: 56-70. Freshney RI. 2000. Culture of Animal Cells. New York: Wiley-Liss. Ganther HE. 1999. Selenium metabolism, selenoproteins and mechanisms of cancer prevention: complexities with thioredoxin reductase. Carcinogenesis 20(9):16571666. Gopalakrishna R, Gundimeda U. 2001. Protein Kinase C as a molecular target for cancer prevention by selenocompounds. J.Nutr Cancer. 40(1):55-63 Indrajaya, Warganegara FM, Akhmaloka. 2003. Isolasi dan identifikasi mikroorganisme termofil isolat kawah Wayang. J Mirobiol Ind: 53-56. Simpulan Ekstrak daun ciplukan rinjani, bawang putih rinjani, dan bakteri Geobasillus 22a yang memiliki senyawa selenium dapat memicu proses apoptosis pada kultur sel kanker darah putih (Leukimia) dengan meningkatkan ekspresi gen cdk5. Peningkatan ekspresi gen cdk5 pada sel Namalwa paling tinggi terdapat pada sel yang diberi perlakuan dengan ekstrak bakteri Geobasillus 22a yaitu mencapai 37.83%. Sedangkan pada sel HL-60 peningkatan ekspresi cdk5 paling tinggi terdapat pada sel yang diberi perlakuan dengan ekstrak daun ciplukan rinjani yaitu mencapai 72.32%. Pada sel Namalwa perlakuan dengan ekstrak bawang putih rinjani tidak mengekspresikan gen cdk5. Tapi pada sel HL-60 dengan perlakuan bawang putih rinjani hanya mampu meningkatkan ekspresi gen cdk5 sebesar 9.97% Ip C, Hayes C, Budnick RM, Ganther HE. 1991. Chemical form of selenium, critical metabolites, and cancer prevention. Journal Cancer Research 51: 595-600. Jalal EA. 1999. Apoptosis dan dasar molecular kematian sel terprogram. Journal Kedokteran YARSI 7(1): 35-41. Jiang C, Kim KH, Wang Z, Lu J. 2004. Methyl selenium-induced vascular endothelial apoptosis is executed by caspases and principally mediated by p38 MAPK pathway. Nutr Cancer 49(2):17483. Kim YS, Milner J. 2001. Molecular targets for selenium in cancer prevention. Nutr Cancer. 40(1): 50-4. 15 Koolman J, Rohm KH, Wirth J. 2000. Atlas Berwarna dan Teks Biokimia. Wanandi SI, penerjemah; Sadikin M, editor.. Jakarta: Hipokrates. Terjemahan dari: Color Atlas of Biochemistry. Madeo F et al. 2002. Apoptosis in khamir: a new model system with application in cell biology and medicine. Curr. Genet. 41: 208-216. Meijer L, Jezequel, Roberge M. 2003. The role of cyclin-dependent kinases in apoptosis. Progress in Cell Cycle Research. 5: 453-459. Newton CR, Graham A. 1994. PCR. UK: Bios Scientific Publisher. Syamsiah I S, Tajudin. 2003. Khasiat dan Manfaat Bawang Putih Raja Antibiotik Alami. Jakarta:Agromedia Pustaka. Tanaka T 2001. Neuronal Cyclin-Dependent Kinase 5 Activity Is Critical for Survival. The Journal of Neuroscience. 21 (2):550558. Tapiero H, Townsend DM, Tew KD. 2003. The antioxidant role of selenium and seleno-compounds. J.Biomed Pharmacother. 57(3-4):134-144. Watson JD, Gilman M, Witkowski J, Zoller M. 1992. Recombinant DNA. 2nd ed. New York: WH Freeman. White SR, Williams P, Wojcik KR, Sun S, Hiemstra PS, Rabe KF, Dorscheid DR. 2001. Initiation of apoptosis by actin cytoskeletal derangement in human airway epithelial cells. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 24: 282-294. WHO. 1987. Selenium Environmental Health Criteria 58. Geneva: WHO. Youn BW, Fiala ES, Sohn OS. 2001. Mechanisms of organoselenium compounds in chemoprevention: effects on transcription factor-DNA binding. Nutr Cancer 40(1): 28-33. Zhang J, Krishnamurthy PK, Johnson G V W. 2002. Cdk5 phosphorylates p53 and regulates its activity. Journal of Neurochemistry 81(2) 307. 17 Lampiran 1 Metode Penelitian. Daun ciplukan rinjani dan bawang putih rinjani Bakteri Geobasillus 22a Dikeringkan, dihaluskan inkubasi 50ºC 5 hari sentrifuse bubuk simplisia Pelet dalam PBS Ekstraksi dengan akuades bebas ion Maserasi selama 24 jam, Sentrifuse Ekstraksi dengan sonikasi Sentrifuse pelet pelet pelet Supernatan Supernatan Perlakuan ke sel Namalwa dan HL-60 Selama 12 jam Pengamatan mikroskopis Sel petit Isolasi mRNa RT-PCR Pengukuran produk PCR elektroforesis gel Agarosa 1,5% Pengukuran intensitas pita DNA 18 Lampiran 2 Perlakuan sel Namalwa Sel Namalwa dengan densitas 2.8x105 1ml sel Namalwa + 1ml akuades bebas ion 1ml sel Namalwa + 1ml ekstrak ciplukan rinjani 1 ml sel Namalwa + 1ml ekstrak bawang putih Inkubasi 12 jam dalam inkubator CO2 pada suhu 37°C/Rh = 90% Isolasi mRNA 1 ml sel Namalwa + 1ml ekstrak bakteri geobasillus 22a 19 Lampiran 3 Perlakuan sel HL-60 Sel HL-60 dengan densitas 6x104 1ml sel HL-60 + 1ml akuades bebas ion 1ml sel HL-60 + 1ml ekstrak ciplukan rinjani 1 ml sel HL-60 + 1ml ekstrak bawang putih Inkubasi 12 jam dalam inkubator CO2 pada suhu 37°C/Rh = 90% Isolasi mRNA 1 ml sel HL-60 + 1ml ekstrak bakteri geobasillus 22a 20 Lampiran 4 Isolasi mRNA dengan MicroFastTrack 2.0 Kit MicroFastTrack 2.0 Kit Kultur sel Kanker Lisis dengan detergen dan RNA/Protein Degrader Pengikatan dengan oligo(dT) selulosa Pencucian dengan Low Salt Wash Buffer Elusi dalam spin kolom mRNA untuk sintesis cDNA, RT-PCR 21 Lampiran 5 Sekuen gen cdk5 1: NM_004935. Homo sapiens cycl...[gi:38454327] LOCUS NM_004935 1143 bp mRNA linear PRI 06-NOV-2005 DEFINITION Homo sapiens cyclin-dependent kinase 5 (CDK5), mRNA. ACCESSION NM_004935 VERSION NM_004935.2 GI:38454327 KEYWORDS . SOURCE Homo sapiens (human) ORGANISM Homo sapiens Eukaryota; Metazoa; Chordata; Craniata; Vertebrata; Euteleostomi; Mammalia; Eutheria; Euarchontoglires; Primates; Catarrhini; Hominidae; Homo. REFERENCE 1 (bases 1 to 1143) AUTHORS Rademakers,R., Sleegers,K., Theuns,J., Van den Broeck,M., Bel Kacem,S., Nilsson,L.G., Adolfsson,R., van Duijn,C.M., Van Broeckhoven,C. and Cruts,M. TITLE Association of cyclin-dependent kinase 5 and neuronal activators p35 and p39 complex in early-onset Alzheimer's disease JOURNAL Neurobiol. Aging 26 (8), 1145-1151 (2005) PUBMED 15917097 REMARK GeneRIF: role of the CDK5 molecular complex in the genetic etiology of early-onset Alzheimer disease; a yet unknown functional variant in CDK5 or in a nearby gene might lead to increased susceptibility for early-onset Alzheimer disease REFERENCE 2 (bases 1 to 1143) AUTHORS Luo,S., Vacher,C., Davies,J.E. and Rubinsztein,D.C. TITLE Cdk5 phosphorylation of huntingtin reduces its cleavage by caspases: implications for mutant huntingtin toxicity JOURNAL J. Cell Biol. 169 (4), 647-656 (2005) PUBMED 15911879 REMARK GeneRIF: These data predict that the ability of cdk5 phosphorylation to protect against htt cleavage, aggregation, and toxicity is compromised in cells expressing toxic fragments of htt. REFERENCE 3 (bases 1 to 1143) AUTHORS Hamdane,M., Bretteville,A., Sambo,A.V., Schindowski,K., Begard,S., Delacourte,A., Bertrand,P. and Buee,L. TITLE p25/Cdk5-mediated retinoblastoma phosphorylation is an early event in neuronal cell death JOURNAL J. Cell. Sci. 118 (PT 6), 1291-1298 (2005) PUBMED 15741232 REMARK GeneRIF: an early event in neuronal cell death is p25/Cdk5-mediated retinoblastoma phosphorylation REFERENCE 4 (bases 1 to 1143) AUTHORS Rosales,J.L., Ernst,J.D., Hallows,J. and Lee,K.Y. TITLE GTP-dependent secretion from neutrophils is regulated by Cdk5 JOURNAL J. Biol. Chem. 279 (52), 53932-53936 (2004) PUBMED 15492003 REMARK GeneRIF: data suggest that Cyclin-dependent kinase 5 (Cdk5)-Cdk5 Activator p35 is required to elicit the maximum GTP-induced secretory response from neutrophils . FEATURES Location/Qualifiers source 1..1143 /organism="Homo sapiens" /mol_type="mRNA" /db_xref="taxon:9606" /chromosome="7" /map="7q36" 1..1143 gene /gene="CDK5" /note="synonym: PSSALRE" /db_xref="GeneID:1020" /db_xref="HGNC:1774" 22 Lanjutan lampiran 5 CDS STS /db_xref="HPRD:00449" /db_xref="MIM:123831" 62..940 /gene="CDK5" /EC_number="2.7.1.-" /note="go_function: ATP binding [goid 0005524] [evidence IEA]; go_function: nucleotide binding [goid 0000166] [evidence IEA]; go_function: transferase activity [goid 0016740] [evidence IEA]; go_function: protein-tyrosine kinase activity [goid 0004713] [evidence IEA]; go_function: cyclin-dependent protein kinase activity [goid 0004693] [evidence TAS] [pmid 8090221]; go_process: cell cycle [goid 0007049] [evidence IEA]; go_process: cell division [goid 0051301] [evidence IEA]; go_process: cell proliferation [goid 0008283] [evidence TAS] [pmid 8090221]; go_process: protein amino acid phosphorylation [goid 0006468] [evidence IEA]" /codon_start=1 /product="cyclin-dependent kinase 5" /protein_id="NP_004926.1" /db_xref="GI:4826675" /db_xref="GeneID:1020" /db_xref="HGNC:1774" /db_xref="HPRD:00449" /db_xref="MIM:123831" /translation="MQKYEKLEKIGEGTYGTVFKAKNRETHEIVALKRVRLDDDDEGV PSSALREICLLKELKHKNIVRLHDVLHSDKKLTLVFEFCDQDLKKYFDSCNGDLDPEI VKSFLFQLLKGLGFCHSRNVLHRDLKPQNLLINRNGELKLADFGLARAFGIPVRCYSA EVVTLWYRPPDVLFGAKLYSTSIDMWSAGCIFAELANAGRPLFPGNDVDDQLKRIFRL LGTPTEEQWPSMTKLPDYKPYPMYPATTSLVNVVPKLNATGRDLLQNLLKCNPVQRIS AEEALQHPYFSDFCPP" 967..1092 /gene="CDK5" /standard_name="SGC30025" /db_xref="UniSTS:4723" ORIGIN 1 tgcaacgccg gggccagagt cttaaaaccg agggcccgca ggggtccccg cggccgccgc 61 gatgcagaaa tacgagaaac tggaaaagat tggggaaggc acctacggaa ctgtgttcaa 121 ggccaaaaac cgggagactc atgagatcgt ggctctgaaa cgggtgaggc tggatgacga 181 tgatgagggt gtgccgagtt ccgccctccg ggagatctgc ctactcaagg agctgaagca 241 caagaacatc gtcaggcttc atgacgtcct gcacagcgac aagaagctga ctttggtttt 301 tgaattctgt gaccaggacc tgaagaagta ttttgacagt tgcaatggtg acctcgatcc 361 tgagattgta aagtcattcc tcttccagct actaaaaggg ctgggattct gtcatagccg 421 caatgtgcta cacagggacc tgaagcccca gaacctgcta ataaacagga atggggagct 481 gaaattggct gattttggcc tggctcgagc ctttgggatt cccgtccgct gttactcagc 541 tgaggtggtc acactgtggt accgcccacc ggatgtcctc tttggggcca agctgtactc 601 cacgtccatc gacatgtggt cagccggctg catctttgca gagctggcca atgctgggcg 661 gcctcttttt cccggcaatg atgtcgatga ccagttgaag aggatcttcc gactgctggg 721 gacgcccacc gaggagcagt ggccctctat gaccaagctg ccagactata agccctatcc 781 gatgtacccg gccacaacat ccctggtgaa cgtcgtgccc aaactcaatg ccacagggag 841 ggatctgctg cagaaccttc tgaagtgtaa ccctgtccag cgtatctcag cagaagaggc 901 cctgcagcac ccctacttct ccgacttctg tccgccctag gccccgggac ccccggcctc 961 caggctgggg cctggcctat ttaagccccc tcttgagagg ggtgagacag tgggggtgcc 1021 tggtgcgctg tgctccagca gtgctgggcc cagccggggt ggggtgcctg agcccgaatt 1081 tctcactccc tttgtggact ttatttaatt tcataaattg gctcctttcc cacagtcaaa 1141 aaa 23 Lampiran 6 Sekuen Gen actb 1: NM_001101 Homo sapiens acti...[gi:5016088] LOCUS NM_001101 1793 bp mRNA linear PRI 05-MAY-2006 DEFINITION Homo sapiens actin, beta (ACTB), mRNA. ACCESSION NM_001101 VERSION NM_001101.2 GI:5016088 KEYWORDS . SOURCE Homo sapiens (human) ORGANISM Homo sapiens Eukaryota; Metazoa; Chordata; Craniata; Vertebrata; Euteleostomi; Mammalia; Eutheria; Euarchontoglires; Primates; Haplorrhini; Catarrhini; Hominidae; Homo. REFERENCE 1 (bases 1 to 1793) AUTHORS Ou,H., Shen,Y.H., Utama,B., Wang,J., Wang,X., Coselli,J. and Wang,X.L. TITLE Effect of nuclear actin on endothelial nitric oxide synthase expression JOURNAL Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 25 (12), 2509-2514 (2005) PUBMED 16210567 REMARK GeneRIF: beta-actin is a transcription factor stimulates eNOS expression; and the transcriptional effect appears to be 27nt-dependent JOURNAL Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75 (3), 1106-1110 (1978) PUBMED 274701 COMMENT REVIEWED REFSEQ: This record has been curated by NCBI staff. The reference sequence was derived from X00351.1 and X63432.1. On Jun 8, 1999 this sequence version replaced gi:4501884 Summary: Beta actin is one of six different actin isoforms which have been identified. ACTB is one of the two nonmuscle cytoskeletal actins. Actins are highly conserved proteins that are involved in cell motility, structure and integrity. Alpha actins are a major constituent of the contractile apparatus. COMPLETENESS: complete on the 3' end. FEATURES Location/Qualifiers source 1..1793 /organism="Homo sapiens" /mol_type="mRNA" /db_xref="taxon:9606" /chromosome="7" /map="7p15-p12" gene 1..1793 /gene="ACTB" /note="synonym: PS1TP5BP1" /db_xref="GeneID:60" /db_xref="HGNC:132" /db_xref="HPRD:00032" /db_xref="MIM:102630" CDS 74..1201 /gene="ACTB" /go_component="actin filament; cytoskeleton; TIP60 histone acetyltransferase complex [pmid 10966108]" /go_function="ATP binding; nucleotide binding; protein binding [pmid 15527767]; structural constituent of cytoskeleton" 24 Lanjutan lampiran 6 /note="beta cytoskeletal actin; PS1TP5-binding protein 1" /codon_start=1 /product="beta actin" /protein_id="NP_001092.1" /db_xref="GI:4501885" /db_xref="CCDS:CCDS5341.1" /db_xref="GeneID:60" /db_xref="HGNC:132" /db_xref="HPRD:00032" /db_xref="MIM:102630" /translation="MDDDIAALVVDNGSGMCKAGFAGDDAPRAVFPSIVGRPRHQGVM VGMGQKDSYVGDEAQSKRGILTLKYPIEHGIVTNWDDMEKIWHHTFYNELRVAPEEHP VLLTEAPLNPKANREKMTQIMFETFNTPAMYVAIQAVLSLYASGRTTGIVMDSGDGVT HTVPIYEGYALPHAILRLDLAGRDLTDYLMKILTERGYSFTTTAEREIVRDIKEKLCY VALDFEQEMATAASSSSLEKSYELPDGQVITIGNERFRCPEALFQPSFLGMESCGIHE TTFNSIMKCDVDIRKDLYANTVLSGGTTMYPGIADRMQKEITALAPSTMKIKIIAPPE RKYSVWIGGSILASLSTFQQMWISKQEYDESGPSIVHRKCF" ORIGIN 1 cgcgtccgcc ccgcgagcac agagcctcgc ctttgccgat ccgccgcccg tccacacccg 61 ccgccagctc accatggatg atgatatcgc cgcgctcgtc gtcgacaacg gctccggcat 121 gtgcaaggcc ggcttcgcgg gcgacgatgc cccccgggcc gtcttcccct ccatcgtggg 181 gcgccccagg caccagggcg tgatggtggg catgggtcag aaggattcct atgtgggcga 241 cgaggcccag agcaagagag gcatcctcac cctgaagtac cccatcgagc acggcatcgt 301 caccaactgg gacgacatgg agaaaatctg gcaccacacc ttctacaatg agctgcgtgt 361 ggctcccgag gagcaccccg tgctgctgac cgaggccccc ctgaacccca aggccaaccg 421 cgagaagatg acccagatca tgtttgagac cttcaacacc ccagccatgt acgttgctat 481 ccaggctgtg ctatccctgt acgcctctgg ccgtaccact ggcatcgtga tggactccgg 541 tgacggggtc acccacactg tgcccatcta cgaggggtat gccctccccc atgccatcct 601 gcgtctggac ctggctggcc gggacctgac tgactacctc atgaagatcc tcaccgagcg 661 cggctacagc ttcaccacca cggccgagcg ggaaatcgtg cgtgacatta aggagaagct 721 gtgctacgtc gccctggact tcgagcaaga gatggccacg gctgcttcca gctcctccct 781 ggagaagagc tacgagctgc ctgacggcca ggtcatcacc attggcaatg agcggttccg 841 ctgccctgag gcactcttcc agccttcctt cctgggcatg gagtcctgtg gcatccacga 901 aactaccttc aactccatca tgaagtgtga cgtggacatc cgcaaagacc tgtacgccaa 961 cacagtgctg tctggcggca ccaccatgta ccctggcatt gccgacagga tgcagaagga 1021 gatcactgcc ctggcaccca gcacaatgaa gatcaagatc attgctcctc ctgagcgcaa 1081 gtactccgtg tggatcggcg gctccatcct ggcctcgctg tccaccttcc agcagatgtg 1141 gatcagcaag caggagtatg acgagtccgg cccctccatc gtccaccgca aatgcttcta 1201 ggcggactat gacttagttg cgttacaccc tttcttgaca aaacctaact tgcgcagaaa 1261 acaagatgag attggcatgg ctttatttgt tttttttgtt ttgttttggt tttttttttt 1321 tttttggctt gactcaggat ttaaaaactg gaacggtgaa ggtgacagca gtcggttgga 1381 gcgagcatcc cccaaagttc acaatgtggc cgaggacttt gattgcacat tgttgttttt 1441 ttaatagtca ttccaaatat gagatgcatt gttacaggaa gtcccttgcc atcctaaaag 1501 ccaccccact tctctctaag gagaatggcc cagtcctctc ccaagtccac acaggggagg 1561 tgatagcatt gctttcgtgt aaattatgta atgcaaaatt tttttaatct tcgccttaat 1621 acttttttat tttgttttat tttgaatgat gagccttcgt gccccccctt cccccttttt 1681 gtcccccaac ttgagatgta tgaaggcttt tggtctccct gggagtgggt ggaggcagcc 1741 agggcttacc tgtacactga cttgagacca gttgaataaa agtgcacacc tta 25 Lampiran 7 Primer cdk5 Primer3 Output WARNING: Numbers in input sequence were deleted. No mispriming library specified No hyb oligo mishyb library specified Using 1-based sequence positions tm gc% any 3' seq OLIGO start len LEFT PRIMER 541 20 60.05 55.00 7.00 3.00 tgaggtggtcacactgtggt RIGHT PRIMER 694 20 60.08 50.00 4.00 2.00 ctggtcatcgacatcattgc HYB OLIGO 604 20 59.96 55.00 6.00 2.00 gtccatcgacatgtggtcag SEQUENCE SIZE: 1143 INCLUDED REGION SIZE: 1143 PRODUCT SIZE: 154, PAIR ANY COMPL: 4.00, PAIR 3' COMPL: 2.00 1 tgcaacgccggggccagagtcttaaaaccgagggcccgcaggggtccccgcggccgccgc 61 gatgcagaaatacgagaaactggaaaagattggggaaggcacctacggaactgtgttcaa 121 ggccaaaaaccgggagactcatgagatcgtggctctgaaacgggtgaggctggatgacga 181 tgatgagggtgtgccgagttccgccctccgggagatctgcctactcaaggagctgaagca 241 caagaacatcgtcaggcttcatgacgtcctgcacagcgacaagaagctgactttggtttt 301 tgaattctgtgaccaggacctgaagaagtattttgacagttgcaatggtgacctcgatcc 361 tgagattgtaaagtcattcctcttccagctactaaaagggctgggattctgtcatagccg 421 caatgtgctacacagggacctgaagccccagaacctgctaataaacaggaatggggagct 481 gaaattggctgattttggcctggctcgagcctttgggattcccgtccgctgttactcagc 541 tgaggtggtcacactgtggtaccgcccaccggatgtcctctttggggccaagctgtactc >>>>>>>>>>>>>>>>>>>> 601 cacgtccatcgacatgtggtcagccggctgcatctttgcagagctggccaatgctgggcg ^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^ 661 gcctctttttcccggcaatgatgtcgatgaccagttgaagaggatcttccgactgctggg <<<<<<<<<<<<<<<<<<<< 721 gacgcccaccgaggagcagtggccctctatgaccaagctgccagactataagccctatcc 781 gatgtacccggccacaacatccctggtgaacgtcgtgcccaaactcaatgccacagggag 841 ggatctgctgcagaaccttctgaagtgtaaccctgtccagcgtatctcagcagaagaggc 901 cctgcagcacccctacttctccgacttctgtccgccctaggccccgggacccccggcctc 961 caggctggggcctggcctatttaagccccctcttgagaggggtgagacagtgggggtgcc 1021 tggtgcgctgtgctccagcagtgctgggcccagccggggtggggtgcctgagcccgaatt 1081 tctcactccctttgtggactttatttaatttcataaattggctcctttcccacagtcaaa 1141 aaa KEYS (in order of precedence): >>>>>> left primer <<<<<< right primer ^^^^^^ hyb oligo ADDITIONAL OLIGOS tm start len gc% any 3' seq 1 LEFT PRIMER 140 20 59.94 50.00 4.00 1.00 catgagatcgtggctctgaa RIGHT PRIMER 364 20 60.07 55.00 5.00 3.00 ctcaggatcgaggtcaccat HYB OLIGO 272 20 59.78 55.00 4.00 1.00 cacagcgacaagaagctgac PRODUCT SIZE: 225, PAIR ANY COMPL: 5.00, PAIR 3' COMPL: 3.00 2 LEFT PRIMER 462 20 60.07 50.00 4.00 2.00 taaacaggaatggggagctg RIGHT PRIMER 694 20 60.08 50.00 4.00 2.00 ctggtcatcgacatcattgc HYB OLIGO 604 20 59.96 55.00 6.00 2.00 gtccatcgacatgtggtcag PRODUCT SIZE: 233, PAIR ANY COMPL: 4.00, PAIR 3' COMPL: 2.00 26 Lanjutan lampiran 7 3 LEFT PRIMER 604 20 59.96 55.00 6.00 2.00 gtccatcgacatgtggtcag RIGHT PRIMER 840 20 60.11 50.00 3.00 0.00 ctccctgtggcattgagttt HYB OLIGO 675 20 60.08 50.00 4.00 1.00 gcaatgatgtcgatgaccag PRODUCT SIZE: 237, PAIR ANY COMPL: 4.00, PAIR 3' COMPL: 0.00 4 LEFT PRIMER 675 20 60.08 50.00 4.00 1.00 gcaatgatgtcgatgaccag RIGHT PRIMER 840 20 60.11 50.00 3.00 0.00 ctccctgtggcattgagttt HYB OLIGO 734 20 59.83 60.00 5.00 1.00 gagcagtggccctctatgac PRODUCT SIZE: 166, PAIR ANY COMPL: 5.00, PAIR 3' COMPL: 3.00 Statistics con too in in no tm tm high high high sid many tar excl bad GC too too any 3' poly end ered Ns get reg GC% clamp low high compl compl X stab ok Left 8914 0 0 0 487 0 1199 5392 0 8 0 187 1641 Right 8838 0 0 0 408 0 1276 5268 1 3 6 194 1682 Hyb 11206 0 0 0 608 0 1377 6991 0 0 1 0 2229 Pair Stats: considered 284, unacceptable product size 266, high end compl 1, ok 17 primer3 release 1.0 (primer3_www_results.cgi v 0.4) 27 Lampiran 8 Hasil Pengukuran Intensitas Pita cdk5 pada Namalwa No Sampel 1 2 3 4 5 6 7 C CDK5 C Aktin CR CDK5 CR Aktin Bact.CDK5 Bact.Aktin Dark Adj. Vol. ODu*mm2 27.565 18.273 22.062 18.065 21.180 18.480 35.611 Perhitungan intensitas ekspresi cdk5 8.046 Blanko X 100% = 46.41% 17.338 13.549 Ciplukan X 100% = 77.22% 17.546 14.431 Bactothermo X 100% = 84.24% 17.131 Area mm2 Mean value ODu 51.911 51.911 51.911 51.911 51.911 51.911 51.911 -8.046 -17.338 -13.549 -17.546 -14.431 -17.131 0.000 0.531 0.352 0.425 0.348 0.408 0.356 0.686 28 Lampiran 9 Hasil Pengukuran Intensitas Pita cdk5 pada sel HL-60 No Sampel 1 2 3 4 5 6 7 8 9 C CDK5 C.Aktin CR CDK5 CR Aktin BP CDK5 BP Aktin Bact CDK5 Bact Aktin Dark Adj. Vol. ODu*mm2 31.770 17.650 18.584 17.442 33.378 38.491 19.103 17.131 35.922 Perhitungan intensitas ekspresi cdk5 -3.841 Blanko X 100% = 21.39% -17.961 -17.027 Ciplukan X 100% = 93.71 % -18.169 -2.233 Bawang putih X 100% = 31.36% -7.120 -16.508 Bacthotermo X 100% = 89.33% -18.480 Area mm2 Mean value ODu 51.911 51.911 51.911 51.911 51.991 51.991 51.911 51.911 51.911 -3.841 -17.961 -17.027 -18.169 -2.233 -7.120 -16.508 -18.480 0.000 0.612 0.340 0.358 0.336 0.642 0.548 0.368 0.330 0.692 29 Lampiran 10 Prosedur pembuatan beberapa larutan. Larutan microFastTrack 2.0 Lysis Buffer 1. Jika stock buffer mempunyai endapan putih, larutan dipanaskan hingga 65ºC sampai larut. 2. 20 µl Protein/Rnase Degrader ditambahkan ke dalam 1 ml stock buffer untuk tiap isolasi. Larutan Phosphate Buffer Saline (PBS) 137 mM NaCL 2,7 mM KCl 10 mM Na2 HPO4 1,8 mM KH2PO4 1. Untuk 1 liter larutan ditambahkan: 8 g NaCl 0,20 g KCl 1,44 g Na2 HPO4 0,24 g KH2PO4 ke dalam 800 ml air destilata dan dicampur hingga larut. 2. pH diatur menjadi 7,4 dengan 1 N HCl hingga volume akhir menjadi 1000 ml. PBS dapat disimpan pada suhu ruang atau pada 4ºC. Larutan stok TAE 50X Stok buffer TAE 50X dibuat dari campuran 242 g tris base, 57,1 mL asam asetat glasial, 100 mL EDTA pH 8 kemudian ditambahkan H2O hingga volume akhir menjadi 1 liter. Buffer kerja TAE 2X dibuat dari pengenceran stok TAE 50X. Stok Marker 100bp Ladder Stok marker berisi campuran 10 μL 100bpLadder, 40 μL Elution Buffer, dan 5 μL blue juice.
