DAUN KELADI TIKUS - USD Repository
advertisement
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI DAUN KELADI TIKUS (Typhonium flagelliforme (Lodd.) Blume) SEBAGAI AGEN KEMOPREVENTIF TERHADAP SEL KANKER SERVIKS (HeLa) MELALUI REGULASI Bcl-2 SKRIPSI Dijalankan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) Program Studi Farmasi Disusun Oleh : Fira Elsa Septiana 138114001 FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2017 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI HALAMAN JUDUL DAUN KELADI TIKUS (Typhonium flagelliforme (Lodd.) Blume) SEBAGAI AGEN KEMOPREVENTIF TERHADAP SEL KANKER SERVIKS (HeLa) MELALUI REGULASI Bcl-2 SKRIPSI Dijalankan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) Program Studi Farmasi Disusun Oleh : Fira Elsa Septiana 138114001 FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2017 i PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PERSETUJUAN PEMBIMBING Persetujuan Pembimbing ii PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI HALAMAN PENGESAHAN iii PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PERNYATAAN KEASLIAN KARYA iv PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI v PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI HALAMAN PERSEMBAHAN Karya ini ku persembahkan kepada : Kemuliaan Tuhan Yesus Kristus Kedua orang tuaku Sahabat dan teman-teman Farmasi angkatan 2013 Dan Almamaterku, Universitas Sanatha Dharma vi PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PRAKATA Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa atas segala berkat, rahmat, dan kurnia-Nya yang telah dilimpahkan, sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi dengan judul “Daun Keladi Tikus (Typhonium flagelliforme (Lodd.) Blume) sebagai Agen Kemopreventif terhadap Sel Kanker Serviks (HeLa) Melalui Regulasi Bcl-2”. Skripsi ini disusun untuk memenuhi salah satu syarat dalam memperoleh gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Penyusunan skripsi telah banyak melibatkan berbagai pihak baik langsung maupun tidak langsung. Oleh karena itu, pada kesempatan ini, penulis ingin menyampaikan terimakasih kepada : 1. Ibu Aris Widayati, M.Si., Ph.D., Apt. selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. 2. Ibu Dr. Riris I. Jenie, M.Si., Apt., selaku pembimbing atas segala motivasi dan kesabaran dalam membimbing, mendukung, dan membantu penulisan dari awal hingga skripsi ini dapat terselesaikan. 3. Ibu Dr. Erna Tri Wulandari, M.Si., Apt., selaku Dosen Penguji yang telah memberikan saran dan kritik yang membagun hingga skripsi ini tersusun. 4. Bapak Maywan Hariono, Ph.D., Apt., selaku Dosen Penguji yang telah memberikan saran dan kritik yang membagun hingga skripsi ini tersusun. 5. Staf laboratorium Fakultas Farmasi USD, Bapak Yohanes Wagiran, Mas Bimo Widura, Staf laboratorium Parasitologi Fakultas Kedokteran UGM, Ibu Suprihatin, serta laboran lainnya yang telah membimbing dan membantu penulis dalam penelitian di laboratorium. 6. Orang tua saya, Ibu Ester Dyah Retnowati, Bapak Mariyoto, dan Bapak Hadi Prayitno. Nenek saya Inhartatiningsih dan saudara-saudara saya Deny Julian Adela, Octa Wisnu Wardana, Allysa Sukma Maharani yang selalu memberi doa, dukungan, motivasi, dan kasih sayang. Hal tersebut memicu saya menjadi semangat dan kuat sehingga penulis bisa menyelesaikan skripsi ini. vii PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 7. Orang tua rohani saya, Shari dan Beni Nugroho. Saudara saya Nathania Devina, Vanessa Lyora, Angelo Adi Gempar Persada, Srikah, Ezra Septian yang senantiasa memberikan doa, bimbingan, motivasi, kasih sayang dan semangat kepada penulis untuk menyelesaikan skripsi ini. 8. Saudara saya, Melantina Maria dan Agnes Marhilo serta semua saudara-saudara komsel USD yang telah memberikan doa, motivasi, kasih sayang dan semangat kepada penulis. 9. Teman-teman seperjuangan dan sahabat dalam penelitian Maria Nareswari dan Lela Francisca Adi Liana atas kerja sama, kebersamaan, bantuan, dan perjuangan selama penelitian ini berlangsung. 10. Sahabat saya, Liana Yudhomulyono, Amanda Anggraini, Maria Atika Sukmana, dan semua teman-teman FSM A dan FKK A angkatan 2013 atas kebersamaan selama ini. 11. Semua pihak yang tidak dapat penulis sebutkan satu-persatu yang turut membantu penulis dalam menyelesaikan skripsi ini. Penulis menyadari bahwa skripsi ini masih banyak kekurangan dan jauh dari sempurna, maka penulis mengharapkan kritik dan saran yang membangun dari semua pihak yang dapat membuat karya ini menjadi lebih baik. Mohon maaf atas segala kesalahan dan kekurangan penulis yang terdapat dalam laporan akhir skripsi ini. Akhir kata, penulis berharap penelitian ini dapat bermanfaat bagi semua pihak dan bermanfaat bagi perkembangan ilmu pengetahuan khususnya di bidang kefarmasian. Yogyakarta, 31 Januari 2017 Penulis viii PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI DAFTAR ISI HALAMAN JUDUL ...................................................................................................... i PERSETUJUAN PEMBIMBING................................................................................. ii HALAMAN PENGESAHAN...................................................................................... iii PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ...................................................................... iv LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI ....................................... v HALAMAN PERSEMBAHAN .................................................................................. vi DAFTAR ISI ................................................................................................................ ix DAFTAR TABEL ........................................................................................................ xi DAFTAR GAMBAR .................................................................................................. xii DAFTAR LAMPIRAN .............................................................................................. xiii ABSTRAK ................................................................................................................. xiv ABSTRACT .................................................................................................................. xv PENDAHULUAN ........................................................................................................ 1 METODOLOGI PENELITIAN .................................................................................... 2 Bahan Penelitian ........................................................................................................ 2 Alat Penelitian ........................................................................................................... 3 Determinasi dan Ekstraksi ......................................................................................... 3 Pembuatan Larutan Uji .............................................................................................. 3 Panen Sel ................................................................................................................... 4 Uji Sitotoksik dengan MTT ....................................................................................... 4 Uji Apoptosis dengan Flowcytometry ....................................................................... 4 Uji Imunositokimia .................................................................................................... 5 Analisis Hasil ............................................................................................................ 6 Analisis Nilai IC50.................................................................................................. 6 Analisis Uji Apoptosis ........................................................................................... 6 Analisis Uji Imunositokimia .................................................................................. 6 HASIL DAN PEMBAHASAN ..................................................................................... 7 ix PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Determinasi dan Ekstraksi Daun Keladi Tikus ......................................................... 7 Uji sitotoksik ekstrak terhadap sel kanker serviks HeLa........................................... 8 Uji Apoptosis menggunakan Flowcytometry dengan Anexin V ............................. 10 Uji Imunositokimia .................................................................................................. 13 KESIMPULAN ........................................................................................................... 15 DAFTAR PUSTAKA ................................................................................................. 16 LAMPIRAN ................................................................................................................ 20 BIOGRAFI PENULIS ................................................................................................ 31 x PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI DAFTAR TABEL Tabel 1. Hasil uji apoptosis menggunakan flowcytometry ...................................... 11 Tabel 2. Distribusi ekspresi Bcl-2 pada sel Hela..................................................... 13 xi PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI DAFTAR GAMBAR Gambar 1. Morfologi sel HeLa observasi secara mikroskopis ............................... 8 Gambar 2. Efek sitotoksik ekstrak etil asetat daun keladi tikus dan cisplatin ....... 9 Gambar 3. Induksi apoptosis ekstrak etil asetat daun keladi tikus dan cisplatin ... 11 Gambar 4. Ekspresi Bcl-2 ekstrak etil asetat daun keladi tikus dan cisplatin ....... 13 xii PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI DAFTAR LAMPIRAN Lampiran 1. Gambar tanaman keladi tikus dan proses ekstraksi .......................... 21 Lampiran 2. Pengolahan data uji MTT assay ........................................................ 22 Lampiran 3. Dokumentasi Uji Apoptosis ............................................................... 23 Lampiran 4. Dokumentasi Uji Imunositokimia...................................................... 27 Lampiran 5. Surat Keterangan hasil determinasi tanaman keladi tikus ................ 29 Lampiran 6. Surat Ethical Clearance .................................................................... 30 xiii PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI ABSTRAK Kemopreventif merupakan suatu upaya untuk mencegah, menunda, ataupun melawan perkembangan sel kanker dengan menggunakan bahan alam, sintesis, atau kombinasi dari keduanya. Salah satu bahan alam yang memiliki potensi antikanker adalah tanaman keladi tikus (Typhonium flagelliforme (Lodd.) Blume) yang dimanfaatkan sebagai terapi alternatif pada kanker. Pada penelitian sebelumnya, daun keladi tikus memiliki efek sitotoksik terhadap sel kanker serviks HeLa dan kanker kolon WiDr. Tujuan. Mengetahui potensi ekstrak etil asetat daun keladi tikus terhadap sel kanker serviks HeLa terkait aktivitas sitotoksik, induksi apoptosis dan pengaruh terhadap protein Bcl-2 yang berperan sebagai antiapoptosis. Metode. Uji sitotoksik dengan metode MTT, uji induksi apoptosis menggunakan metode flocytometry dan uji imunositokimia untuk observasi aktivitas ekstrak etil asetat daun keladi tikus dalam meregulasi protein Bcl-2. Hasil. Hasil yang diperoleh, ekstrak etil asetat daun keladi tikus memiliki aktivitas sitotoksik lemah dengan nilai IC50 640 µg/mL. Hasil uji apoptosis pada konsentrasi ½ IC50 dengan waktu inkubasi 24 jam menunjukkan bahwa sampel menginduksi kematian (apoptosis 12% dan nekrosis sekunder yang merupakan lanjutan dari apoptosis 86%) sehingga perlu observasi lebih lanjut pada waktu inkubasi kurang dari 24 jam. Hasil uji imunositokimia menunjukkan sampel menekan kuat ekspresi protein Bcl-2, sehingga kemungkinan induksi apoptosis diperantarai penekanan ekspresi protein Bcl-2. Bedasarkan hasil tersebut, potensi esktrak etil asetat daun keladi tikus sebagai agen kemopreventif masih perlu ditelusuri lebih lanjut terutama induksi kematian sel. Kata kunci: kanker serviks, Typhonium flagelliforme (Lodd.) Blume, sel HeLa, protein Bcl-2 xiv PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI ABSTRACT Chemopreventive an attempt to prevent, delay, or against the development of cancer cells using natural product, synthetic, or combination of both. Natural product that has the potential anticancer is rodent tuber (Typhonium flagelliforme (Lodd.) Blume) which is used as an alternative therapy in cancer. Previous research represent that rodent tuber leaves have a cytotoxic effect on HeLa cervical cancer cells and WiDr colon cancer cells. Objective. To determine the potential of ethyl acetate extract of rodent tuber leaves against HeLa cervical cancer cell related cytotoxic activity, induction of apoptosis and effect on protein Bcl-2 as regulator antiapoptosis. Method. Cytotoxic test was conducted using MTT assay, induction of apoptosis test using flocytometry, immunocytochemistry test to observe the activity extracts in regulating protein Bcl-2. Results. The results, ethyl acetate extract of rodent tuber leaves have a weak cytotoxic activity with IC50 values of 640 µg/mL. The result of apoptosis assay in concentration ½ IC50 with 24 hours incubation period showing that samples induce death (12% apoptosis and secondary necrosis which is the continuation of apoptosis 86%), need further observation on incubation period of less than 24 hours. The result of immunocytochemistry assay showed sampel suppresses powerfully expression of Bcl-2 protein, the possibility induction of apoptosis mediated by suppresses the expression of Bcl-2 protein. Therefore, potential of the ethyl acetate extract of rodent tuber leaves as kemopreventif agent need further exploration, especially the induction of cell death. Keywords: cervical cancer, Typhonium flagelliforme (Lodd.) Blume, HeLa cells, Bcl2 protein xv PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PENDAHULUAN Kanker merupakan keadaan sel-sel dalam tubuh mulai tumbuh tidak kendali dan dapat menyebar ke seluruh tubuh. Kanker serviks merupakan kanker yang berkembang dari sel di daerah serviks atau mulut rahim sampai bagian bawah uterus (American Cancer Society, 2016). Menurut data dari IARC 2015, prevalensi kanker serviks memiliki tingkat mortalitas dan morbiditas yang tinggi dan menduduki peringkat keempat di belahan benua Australia, Eropa, Afrika dan Asia setelah kanker payudara dan kanker kolon. Di Indonesia, prevalensi kanker serviks menduduki peringkat ketiga setelah kanker payudara (Ferlay, dkk., 2015). Sebagian besar penderita kanker serviks berobat dengan keadaan stadium lanjut sehingga mengakibatkan rendahnya angka survival (DeSantis, dkk., 2014). Penemuan obatobat kemopreventif dan alternatif banyak dilakukan untuk penelitian kanker. Kemopreventif merupakan suatu upaya untuk mencegah, menunda, ataupun melawan perkembangan sel kanker dengan menggunakan bahan alam, sintesis, atau kombinasi dari keduanya (Sharma, 2012). Beberapa obat herbal dilaporkan efektif untuk menghambat pertumbuhan sel kanker serviks dan berpotensi untuk digunakan pada terapi kanker serviks (Galluzzi, dkk., 2014). Oleh sebab itu, upaya penemuan agen kemopreventif dengan target yang spesifik perlu ditingkatkan. Kanker serviks sebagian besar disebabkan karena adanya infeksi Human Papiloma Virus (HPV). Sel kanker leher rahim yang diinfeksi HPV diketahui mengekspresikan dua onkogen, yaitu E6 dan E7. Protein E6 berikatan dengan tumor suppressor protein p53 dan mempercepat degradasi p53, serta menekan aktivitas p53. Pada keadaan ini mediator antiapoptosis (Bcl-2, Bcl-xL, Bcl-w) terinduksi, sehingga jumlahnya berlebih. Jumlah mediator antiapoptosis yang berlebih mengakibatkan proses apoptosis atau kematian sel terhambat (You, dkk., 2010). Bcl-2 (B-cell lymphoma 2) berperan dalam proses apoptosis pada sel karena Bcl-2 dapat menghambat pelepasan sitokrom C sehingga proses apoptosis terhambat (de Bruin & Medema, 2008). Dengan demikian, salah satu target molekuler dari perkembangan terapi kanker serviks adalah yang potensial adalah Bcl-2. Daun keladi tikus (Typhonium flagelliforme (Lodd.) Blume) diketahui memiliki aktivitas antikanker, detoksifikasi, antiinflamasi, antivirus dan antibakteri. Dari beberapa penelitian disebutkan bahwa daun keladi tikus dimanfaatkan sebagai terapi alternatif pada kanker payudara, kolon, paru-paru, serviks dan leukemia (Masood, dkk., 2011). Ada beberapa 1 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI kandungan kimia dalam daun keladi tikus antara lain alkaloid, flavonoid, terpenoid dan steroid. Alkaloid dan flavonoid merupakan kandungan kimia terbesar dalam daun keladi tikus (Mankaran, dkk. 2013). Dari penelitian Da’i, dkk. (2007) dilakukan uji sitotoksik dari ekstrak diklorometan, etil asetat dan etanol 98% daun keladi tikus terhadap sel HeLa. Ekstrak etil asetat daun keladi tikus memiliki nilai IC50 147,77 µg/mL. Ekstrak etil asetat daun keladi tikus memiliki efek sitotoksik paling baik dibandingkan dengan ekstrak diklorometan dan etanol 98%. Secara in vitro ekstrak etil asetat daun keladi tikus memiliki nilai IC50 yang baik dibandingkan n-hexan dan etanol pada sel leukemia yaitu 11,81 µg/mL (Katrin, dkk., 2012). Sedangkan ekstrak etanol 80% keladi tikus memiliki nilai IC50 30,19 µg/mL terhadap sel HeLa (Purwaningsih, dkk., 2014). Penelitian lebih lanjut perlu dilakukan untuk mengetahui mekanisme molekuler yang spesifik pada kanker serviks. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui potensi ekstrak etil asetat daun keladi tikus terhadap sel kanker serviks HeLa terkait aktivitas sitotoksik, induksi apoptosis dan pengaruh terhadap regulasi protein Bcl-2 yang merupakan regulator antiapoptosis. Sel kanker serviks yang digunakan untuk penelitian ini adalah sel kanker serviks HeLa yang merupakan sel epitel kanker serviks. Sel kanker serviks HeLa digunakan karena sel bersifat imortal dan dapat membelah secara tidak terbatas selama memenuhi kondisi dasar bagi sel untuk tetap hidup, selain itu sel kanker serviks HeLa dipilih karena cukup aman dan umum digunakan (Landry, dkk., 2013). Uji MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolium bromida) dilakukan untuk mengetahui aktivitas sitotoksik, uji apoptosis menggunakan metode flowcytometry untuk mengetahui induksi apoptosis dan uji imunositokimia untuk mengetahui regulasi protein Bcl-2. METODOLOGI PENELITIAN Bahan Penelitian Ekstrak etil asetat daun keladi tikus, cisplatin 10mg/10mL dari Kalbe Farma, sel kanker serviks HeLa didapat dari Laboratorium Parasitologi Fakultas Kedokteran Universitas Gadjah Mada. Bahan kimia yang digunakan adalah etil asetat teknis, media kultur DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium) 10% (Gibco), Tripsin 0,025%, PBS (Phosphat Buffer Saline), SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) 10% dalam HCl 0,01 N, DMSO (dimethylsulfoxide) (Merck) dengan konsentrasi tertinggi 0,35%, akuades, reagen Annexin V Fluos staining kit 2 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI (Roche) mengandung 100 mL binding buffer 2 mL Anexin V : 2mL propidium iodida (PI) , reagen MTT (sigma) 5 mg/mL, etanol, primary monoclonal antibody mouse anti-human Bcl-2 Oncoprotein (Dako), secondary antibody (Biocare), streptavidin, larutan DAB (diaminobenzidin), Mayerhematoxilin. Alat Penelitian Alat–alat gelas steril (Pyrex), timbangan analitik, blender, waterbath (Memmert), rotary evaporator (buchi Labortechnik AG CH-99230), oven, 96 well-plate (Iwaki), 6 wellplate (Iwaki), sentrifuge tube, inkubator CO2 (Thermo Heraeus HeraCell 150), Laminar air flow cabinet (Labconco), mikropipet, hemositometer (Neubauer), ELISA reader (Bio-Rad), kamera digital (Canon 550D), mikroskop cahaya (Olympus), mikroskop inverter (Olympus), flowcytometry (FACS Calibur). Determinasi dan Ekstraksi Tanaman keladi tikus didapatkan dari Malang, Jawa Timur dengan usia 2-6 bulan. Sebelumnya tanaman dideterminasi menggunakan buku acuan menurut Backer, 1963 dilakukan di Fakultas Biologi Universitas Gajah Mada (lampiran 5). Daun yang dipilih adalah daun tua yang berwarna hijau pekat (Nobakht, dkk., 2014) kemudian daun dipetik dan dikeringkan dalam oven dengan suhu 40-500C. Daun yang telah kering dihaluskan menggunakan blender untuk menjadi simplisia serbuk daun keladi tikus. Serbuk daun keladi tikus ditimbang sebanyak 10 gram kemudian direndam dalam 100 ml etil asetat dalam erlenmeyer bertutup dan digojok menggunakan shaker selama 24 jam. Dilakukan remaserasi dengan etil asetat seperti proses sebelumnya hingga pelarut tidak berwarna. Kemudian hasilnya ditampung dan dipekatkan menggunakan rotary vaccum evaporator (Setiawati, dkk., 2016). Pembuatan Larutan Uji Ekstrak etil asetat daun keladi tikus ditimbang sebanyak 10 mg kemudian dilarutkan kedalam 100 μl DMSO sehingga diperoleh konsentrasi larutan stok sampel adalah 100.000 μg/ mL, selanjutnya dibuat seri kadar pengenceran untuk melakukan optimasi dengan konsentrasi 1.500 μg/ mL, 750 μg/ mL, 375 μg/ mL, 187,5 μg/ mL, 94 μg/ mL, 47 μg/ mL, dan 23 μg/ mL. Cisplatin konsentrasi 10 mg/10 mL, kemudian diambil 1 ml sehingga diperoleh konsentrasi 1mg/mL atau setara dengan 1000 μg/mL. Kemudian dibuat seri kadar pengenceran untuk 3 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI melakukan optimasi dengan konsentrasi 160 μg/ mL, 80 μg/ mL, 40 μg/ mL, 20 μg/ mL, 10 μg/ mL, 5 μg/ mL dan 2,5 μg/ mL. Panen Sel Panen sel dilakukan setelah sel 80% konfluen yang terlihat monolayer dibawah mikroskop, sel yang telah diinkubasi diambil dari inkubator CO2 dan diamati kondisi sel. Media kultur DMEM 10% dibuang, kemudian sel dicuci tiga kali menggunakan PBS. Selanjutnya tambahkan 2 ml tripsin 0,025% secara merata dan diinkubasi dalam inkubator selama 3 menit. Sel dipindahkan ke dalam conical tube sampai semua sel terlepas dari plate, kemudian PBS ditambahkan sampai 10 ml untuk deaktivasi tripsin. Selanjutnya disentrifuge selama 10 menit, kemudian PBS dibuang dan ditambahkan media DMEM 10% sebanyak 1-2 ml. Sel diresuspensi menggunakan pipet, kemudian diambil sebanyak 10 μl dan dipindahkan ke hemacytometer untuk dihitung di bawah mikroskop (Nobakht, dkk., 2014; CCRCa, 2009). Uji Sitotoksik dengan MTT Uji sitotoksik dilakukan dengan cara memberi perlakuan pada sel (dengan populasi 1x106/mL) yang telah ditanam dalam 96 well-plate. Pertama, media kultur dibuang terlebih dahulu kemudian ke dalam tiap lubang diberi 100 μl seri konsentrasi sampel (1.500 μg/ mL, 750 μg/ mL, 375 μg/ mL, 187,5 μg/ mL, 94 μg/ mL, 47 μg/ mL, dan 23 μg/ mL yang telah diencerkan dalam media dan 100 μl seri konsentrasi cisplatin (160 μg/ mL, 80 μg/ mL, 40 μg/ mL, 20 μg/ mL, 10 μg/ mL, 5 μg/ mL dan 2,5 μg/ mL), pada kolom kontrol sel diberi media kultur sedangkan pada kolom kontrol media dikosongkan, lalu diinkubasi selama 24 jam dalam inkubator CO2. Setelah inkubasi 24 jam, media kultur dalam well-plate dibuang lalu ke dalam tiap lubang diberi 100 μl larutan MTT dalam media kultur dan diinkubasi selama 4 jam. Setelah 4 jam ke dalam tiap lubang diberi 100 μl reagen stopper SDS kemudian plate dibungkus dengan alumunium foil dan diinkubasi di ruang selama 24 jam. Setelah inkubasi, dilakukan pembacaan absorbansi menggunakan ELISA Reader pada panjang gelombang 595 nm (Xu, dkk., 2014; CCRCd, 2009). Uji Apoptosis dengan Flowcytometry Sel ditanam (dengan populasi 1x106/mL) dalam 2 mL media DMEM 10% di dalam 6 well-plate, kemudian diinkubasi selama 24 jam. Setelah 24 jam, sampel dengan konsentrasi ½ IC50 yang telah diencerkan dengan media 2 mL dimasukkan ke dalam tiap sumuran dan diinkubasi selama 24 jam. Setelah inkubasi, sel dalam tiap lubang diambil dengan mikropipet 4 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI dipindahkan ke conical tube. Pada well-plate diberi 1 mL PBS, kemudian diambil lagi dan dimasukkan ke conical tube. Pada well-plate diberi 1 mL tripsin 0,025% dan ditampung lagi ke dalam conical tube sampai semua sel terlepas dari plate. Setelah semua sel dipanen ditambahkan PBS sampai 10 ml dan conical tube disentrifugasi selama 10 menit. Supernatan dibuang, sisa endapan diberi PBS dingin 1 mL kemudian resuspensi campuran dan dipindahkan ke dalam micro tube sebanyak 1 mL. Campuran dalam micro tube disentrifugasi (5 menit, 5000 rpm). Micro tube yang berisi sampel dibuang supernatannya kemudian diberi reagen 100 μl Annexin V lalu diinkubasi 10 menit. Setelah inkubasi 10 menit diberi 300 μl buffer, dan sampel dianalisis mengunakan flowcytometer FACS Calibur (Huang, dkk., 2015; CCRCc, 2009). Uji Imunositokimia Sel ditanam dalam 6 well-plate diberi cover slip sebanyak 2x105 sel/mL. Setelah inkubasi 24 jam media kultur dibuang. Sel diberi perlakuan dengan memberikan 1 mL sampel dengan konsentrasi ½ IC50 yang dilarutkan dalam media dan diinkubasi 24 jam, setelah inkubasi media dibuang dan diberi PBS lalu dibuang, dilakukan dua kali kemudian difiksasi menggunakan metanol yang bertujuan untuk mempertahankan morfologi sel. Methanol dibuang dan diberi PBS 1 ml selama 5 menit. Cover slip diberi hidrogen peroksida 100 μl selama 10 menit untuk menghambat peroxidase endogen, lalu dibuang dan dicuci dengan akuades 1 ml. Selanjutnya cover slip diangkat dan dipindahkan ke kaca preparat. Cover slip diberi larutan blocking 20 μl selama 10 menit lalu dibuang untuk mencegah ikatan tidak spesifik dari antibody sekuder, diberi antibodi primer 50 μl selama 1 jam setelah itu dicuci dengan PBS tergenang selama 2 menit diulang 2 kali. Cover slip diberi antibodi sekunder 30 μl selama 20 menit dan dicuci PBS tergenang selama 2 menit diulang 2 kali. Cover slip diberi streptavidin sebanyak 30 μl selama 10 menit untuk memperjelas pewarnaan kemudian dicuci dengan PBS selama 2 menit diulang 2 kali. Lalu diberi larutan DAB 50 μl selama 7 menit sebagai pewarna coklat pada sel yang mengekspresikan protein dan dicuci menggunakan aquadest lalu dibuang. Cover slip diberi 1 tetes Mayerhematoxilin selama 3 menit untuk memberikan kontras warna atau membedakan warna sel, kemudian dicuci dengan akuades lalu dibuang. Cover slip digenangi etanol absolut dan segera dibuang, preparat dikeringkan terlebih dahulu lalu diawetkan. Pengamatan dilakukan dibawah mikroskop dengan perbesaran 400 kali (Guimaraes, dkk., 2005; CCRCb, 2009). 5 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Analisis Hasil Analisis Nilai IC50 Dari data yang diperoleh melalui uji MTT, dihitung % viabilitas sel dengan menggunakan rumus: sor ansi perlakuan sor ansi kontrol sel sor ansi kontrol media x 100% sor ansi kontrol media Setelah data % viabilitas didapatkan, dilanjutkan dengan membuat grafik antara % viabilitas sel dengan konsentrasi untuk mendapatkan nilai IC50 menggunakan program Microsoft Excel (Nobakht, dkk., 2014; CCRCc, 2009). Analisis Uji Apoptosis Pengamatan kuantitatif dilakukan dengan mengolah data menggunakan metode cellquest dan dibaca menggunakan alat flowcytometry FACS Calibur yang terhubung dengan software untuk membaca hasil analisis. Hasil yang didapatkan, kemudian dikonversikan dalam diagram warna sel. Sel yang hidup ditunjukkan dengan warna hijau (Annexin-/PI-), warna kuning menunjukkan sel mengalami early apoptosis (Annexin+/PI-), dan merah muda menunjukkan sel mengalami late apoptosis (Annexin+/PI+) (Li, dkk., 2009). Analisis Uji Imunositokimia Pengamatan secara kualitatif digunakan untuk mengetahui ekspresi protein Bcl-2. Adanya ekspresi protein Bcl-2 akan ditunjukkan dengan warna coklat pada sitoplasma (bukan inti sel). Sedangkan warna biru menunjukkan tidak adanya protein Bcl-2. Pembacaan data dilakukan dengan bantuan blind reader. Sebanyak tiga orang responden menghitung jumlah sel yang mengekspresikan Bcl-2 pada preparat. Hasil yang didapatkan berupa % rata-rata ± SD. % Ekspresi Bcl-2: X 100% Sel er arna oklat otal sel satu lapang pandang Level skoring ekspresi Bcl-2 ditentukan dengan: 0: kurang dari 5% (sangat kuat), 1+: 6% - 25% (kuat), 2+: 26% - 50% (sedang), 3+: 51% - 75% (lemah), 4+: 76% - 100% (sangat lemah) (Zhang, dkk., 2002). 6 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI HASIL DAN PEMBAHASAN Determinasi dan Ekstraksi Daun Keladi Tikus Determinasi tanaman dilakukan terlebih dahulu untuk memastikan kebenaran dari tanaman yang digunakan untuk diuji. Determinasi dilakukan untuk memastikan bahwa daun yang digunakan dalam penelitian ini benar berasal dari tanaman keladi tikus (Typhonium Flagelliforme (Lodd.) Blume). Daun dipetik dari tanaman, kemudian dicuci dan dikeringkan di dalam oven dengan suhu 40-500C. Pengeringan bertujuan untuk mengurangi kadar air di dalam daun karena air dapat menyebabkan adanya penjamuran dan mengaktifkan enzim yang dapat merusak zat aktif dalam simplisia. Simplisia ditimbang sebanyak 10 gram kemudian dilakukan maserasi menggunakan pelarut etil asetat untuk mengambil zat-zat aktif dari simplisia. Prinsip dari maserasi adalah memindahkan masa dari sel simplisia menuju cairan penyari berdasarkan derajat konsentrasi. Setiap 24 jam pelarut diganti menggunakan pelarut baru dan pelarut sebelumnya ditampung dengan tujuan menghindari kejenuhan senyawa dalam pelarut. Hasil maserasi yang sudah ditampung disaring dan dilakukan pemekatan menggunakan rotary evaporator dengan suhu 600C dilanjutkan dengan diuapkan di atas water bath dengan suhu 55-600C sampai semua pelarut menguap atau sampai bobot tetap. Hal ini dilakukan untuk memastikan bahwa sel yang mati disebabkan oleh ekstrak bukan pelarut yang tersisa. Hasil ekstraksi yang dilakukan dengan metode maserasi menggunakan pelarut etil asetat didapatkan rendemen 5,6%. Maserasi bertujuan untuk mendapatkan zat-zat aktif dari simplisia daun keladi tikus. Zat-zat aktif atau kandungan fitokimia dalam ekstrak daun keladi tikus yang diharapkan dapat tersari adalah alkaloid, flavonoid, terpenoid dan steroid sebagai kandungan terbesar dalam tanaman keladi tikus (Mankaran, dkk., 2013). Senyawa lainnya yang ada dalam keladi tikus adalah senyawa flavonoid yang diidentifikasi secara kualitatif dari ekstrak diklorometan, etil asetat dan etanol daun keladi tikus (Da’i, dkk., 2007). Per edaan usia tanaman, tempat tumbuh, waktu panen dan kondisi lingkungan dan perbedaan cara ekstraksi menyebabkan kandungan atau senyawa fitokimia dalam daun keladi tikus berbeda-beda. Dalam penelitian ini tidak dilakukan identifikasi senyawa yang ada dalam ekstrak etil asetat daun keladi tikus. Oleh karena itu, perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk mengidentifikasi kandungan kimia dalam ekstrak etil asetat daun keladi tikus. 7 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Uji sitotoksik ekstrak terhadap sel kanker serviks HeLa Metode MTT digunakan untuk menentukan viabilitas sel yang berdasarkan pada perubahan garam tetrazolium (MTT) menjadi formazan dalam mitokondria yang aktif pada sel hidup (Jo, dkk., 2015). MTT diabsorbsi ke dalam sel hidup dan dipecah melalui reaksi reduksi oleh enzim reduktase dalam rantai respirasi mitokondria menjadi formazan yang berwarna ungu. Formazan dapat dibaca absorbansinya secara spektrofotometri dengan ELISA reader pada panjang gelombang 595 nm yang merupakan panjang gelombang maksimal untuk mengamati fomazan (Ho, dkk, 2012). Uji sitotoksik dengan metode MTT dilakukan untuk mengetahui efek sitotoksik ekstrak etil asetat daun keladi tikus terhadap sel HeLa. A B C Gambar 1. Morfologi sel HeLa observasi sel secara mikroskopis. Sel HeLa (1x106 sel/mL) yang ditanam pada 96 well-plate diinkubasi selama 24 jam, kemudian diberi seri konsentrasi ekstrak etil asetat daun keladi tikus dan seri konsentrasi cisplatin dengan waktu inkubasi 24 jam. Selanjutnya diamati dibawah mikroskop dengan perbesaran 100 kali. (A) Kontrol sel HeLa, (B) Perlakuan cisplatin dengan konsentrasi 20 µg/mL, (C) Perlakuan ekstrak etil asetat daun keladi tikus konsentrasi 750 µg/mL. Keterangan gambar: sel yang ditunjuk tanda panah ( ) menunjukkan sel mengkerut, sel yang ditunjuk tanda panah putus-putus ( ) menunjukkan sel hidup. Aktivitas sitotoksik ekstrak etil asetat daun keladi tikus terhadap sel HeLa juga berpengaruh pada morfologi sel setelah diberi perlakuan selama 24 jam. Pada kelompok kontrol sel menunjukkan kepadatan sel tinggi, sel berbentuk polygonal dan menempel pada plate. Morfologi sel dengan perlakuan cisplatin dengan konsentrasi 20 µg/mL beberapa sel mengkerut yang ditandai dengan bentuk bulat tidak menempel pada plate dan kepadatan sel berkurang. Sedangkan morfologi sel dengan perlakuan etil asetat daun keladi tikus sel dengan konsentrasi 750 µg/mL banyak sel mengkerut yang ditandai dengan bentuk bulat tidak menempel pada plate serta kepadatan sel berkurang. Uji sitotoksik dilakukan untuk menentukan IC50 atau konsentrasi sampel yang mampu menghambat pertumbuhan sel sebanyak 50% yang digunakan sebagai parameter uji sitotoksik. Hasil uji sitotoksik dapat dilihat pada Gambar 2 yang menyatakan kurva hubungan antara 8 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI konsentrasi dan persen viabilitas sel. Cisplatin digunakan sebagai kontrol positif karena cisplatin merupakan salah satu obat yang digunakan dalam terapi kanker serviks. Hasil uji sitotoksik menggunakan metode MTT menunjukkan cisplatin memiliki nilai IC50 36 µg/mL sedangkan ekstrak etil asetat daun keladi tikus nilai IC50 640 µg/mL terhadap sel HeLa. Efek sitotoksik pada umumnya menunjukkan pola dose dependent yang dapat dilihat dari menurunnya viabilitas sel seiring dengan meningkatnya konsentrasi. Pada penelitian sebelumnya menyebutkan bahwa ekstrak etil asetat daun keladi tikus memiliki efek sitotoksik terhadap sel HeLa dengan nilai IC50 147,77 µg/mL (Da’i, dkk., 2007). Hal ini dapat diakibatkan karena perbedaan cara ekstraksi dan juga perbedaan sumber tanaman yang digunakan. viabilitas sel (%) 120 100 80 60 40 20 0 0 A 500 1000 1500 Ekstrak Daun Keladi Tikus (µg/mL) 2000 viabilitas sel (%) 120 100 80 60 40 20 0 B 0 20 40 60 Cisplatin (µg/mL) 80 100 Gambar 2. Efek sitotoksik ekstrak etil asetat daun keladi tikus dan cisplatin. Sel HeLa (1x106 sel/mL) yang ditanam pada 96 well-plate diinkubasi selama 24 jam, kemudian diberi seri konsentrasi ekstrak etil asetat daun keladi tikus dan seri konsentrasi cisplatin. Viabilitas sel ditentukan dengan metode MTT. (A) Viabilitas sel setelah diberi seri konsentrasi ekstrak etil asetat daun keladi tikus selama 24 jam. (B) Viabilitas sel setelah diberi seri konsentrasi cisplatin selama 24 jam. Potensi ekstrak sebagai agen sitotoksik digolongkan menjadi tiga kategori yaitu kuat (IC50 < 20 µg/mL), sedang (IC50 < 50 µg/mL) dan lemah (IC50 > 50 µg/mL) (Ellithey, dkk., 9 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 2014). Pada uji sitotoksik ekstrak daun keladi tikus menunjukkan niai IC50 yang cukup tinggi, dapat diartikan bahwa ekstrak daun keladi tikus tidak cukup toksik namun memiliki potensi untuk dikembangkan sebagai agen kemopreventif. Efek toksik yang kuat dari cisplatin sebagai obat kemoterapi mengakibatkan efek toksik terhadap sel atau jaringan normal karena tidak selektif terhadap sel kanker (Dasari & Bernard, 2014). Ekstrak etil asetat daun keladi tikus berpotensi sebagai agen kemopreventif karena tidak cukup toksik terhadap sel kanker serviks HeLa sehingga diharapkan ekstrak etil asetat daun keladi tikus tidak bersifat toksik terhadap sel normal. Namun perlu adanya penelitian lebih lanjut untuk memastikan selektivitas ekstrak etil asetat daun keladi tikus terhadap sel kanker. Efek toksik yang rendah terhadap sel kanker serviks HeLa mengakibatkan ekstrak etil asetat daun keladi tikus memiliki efikasi pengobatan yang rendah. Untuk meningkatkan efikasi penggobatan, ekstrak etil asetat daun keladi tikus dapat dikombinasikan dengan agen kemoterapi. Penggunaan kombinasi kemoterapi dapat diberikan dengan senyawa yang bersifat non-toksik atau senyawa yang memiliki efek toksik rendah dikombinasikan dengan agen kemoterapi untuk meningkatkan efikasi dengan cara mengurangi efek toksik agen kemoterapi pada sel atau jaringan normal (Hemaiswarya & Doble, 2006). Penelitian lebih lanjut perlu dilakukan untuk mengetahui efek sinergis dari kombinasi ekstrak etil asetat daun keladi tikus dan agen kemoterapi terhadap sel kanker dan selektivitas terhadap sel normal. Uji Apoptosis menggunakan Flowcytometry dengan Anexin V Mekanisme kematian sel dibedakan menjadi dua yaitu apoptosis dan nekrosis. Apoptosis atau kematian sel yang terprogram secara genetik memiliki mekanisme regulasi pergantian sel karena adanya perkembangan dan penuaan sel (Akl, dkk., 2014). Nekrosis didefinisikan sebagai kematian sel yang tidak terkontrol yang merupakan kematian sel yang secara patologik dapat mengakibatkan adanya inflamasi atau peradangan (de Bruin & Medema, 2008). Uji apoptosis dilakukan untuk mengetahui aktivitas ekstrak etil asetat daun keladi tikus dalam menginduksi kematian sel melalui jalur apoptosis terhadap sel HeLa. Uji apoptosis pada penelitian ini menggunakan flowcytometry dengan reagen Anexin V yang akan berikatan secara spesifik terhadap fosfolipid seperti fosfatidilserine yang keluar dari dalam membran sel ketika sel mengalami apoptosis (Hingorani, dkk., 2011). Secara umum, flowcytometry merupakan suatu teknik yang digunakan untuk menganalisis jenis-jenis 10 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI File: cisplatin HeLa.006 Gate: No G ate Tota l Even ts: 20000 File: KS HeLa.001 Gate: No G ate Tota l Even ts: 20000 kematian sel yang terdapat dalam suatu populasi sel. Sel ditandai dengan reagen fluoresen Quad Quad % Gated % Total UL 5.05 5.05 UR 2.50 2.50 LL 88.72 88.72 LR 3.74 3.74 UL UR LL LR kemudian dilewatkan celah sempit dan ditembak sinar UV atau laser. Sel yang telah ditandai dengan fluoresen akan memancarkan fluoresensi yang akan ditangkap oleh detektor. % Gated % Total 2.54 2.54 10.54 10.54 61.02 61.02 25.91 25.91 Fluoresensi yang ditangkap oleh detektor akan dikonversikan menjadi sebuah grafik dengan suatu program yang ada pada flowcytometry (Hayrabedyan, dkk., 2012). R3 R4 R4 File: KS HeLa.001 Gate: No G ate Tota l Even ts: 20000 Re gion % Gated % Total R1 88.28 88.28 R2 3.55 3.55 R3 2.58 2.58 R4 5.67 5.67 R2 File: KEL ADI TIKUS I HeLa APOPT.006 Gate: No G ate File: cisplatin HeLa.006 Tota l Even ts: 20000 Gate: No G ate Tota l Even ts: 20000 Quad % Gated % Total UL 86.01 86.01 Re gion % Gated % Total UR 11.58 11.58 R1 61.80 61.80 LL 2.40 2.40 R2 25.44 25.44 LR 0.01R2 0.01 R3 10.62 10.62 R4 R1 R1 A B File: KEL ADI TIKUS I HeLa APOPT.006 Gate: No G ate Tota l Even ts: 20000 R2 R1 Re gion % Gated % Total R1 2.38 2.38 R2 0.01 0.01 R3 11.79 11.79 R4 86.03 86.03 C Gambar 3. Induksi apoptosis ekstrak etil asetat daun keladi tikus dan cisplatin. Sel HeLa (1x 106/mL) yang ditanam pada 6 well-plate diinkubasi selama 24 jam, kemudian diberi ekstrak etil asetat daun keladi tikus 320 µg/mL dan cisplatin 18 µg/mL diinkubasi selama 24 jam, dan diwarnai dengan reagen annexin V dan propidium iodida (PI). Hasil dibaca menggunakan flowcytometer. (A) Kontrol sel. (B) Sel kanker serviks HeLa yang diberi cisplatin (18 µg/mL). (C) Sel kanker serviks HeLa yang diberi ekstrak etil asetat daun keladi tikus (320 µg/mL). Tabel 1. Hasil uji apoptosis menggunakan flowcytometry Total Sel (%) Radian 1 Radian 2 Radian 3 Radian 4 Sel Hidup Early Apoptosis Late Apoptosis Nekrosis Kontrol Sel 88,28 % 3,55 % 2,58 % 5,67 % Cisplatin 61,80 % 25,44 % 10,62 % 2,69 % 2,38 % 0,01 % 11,79 % 86,03 % Ekstrak etil asetat daun keladi tikus Hasil uji apoptosis dapat dilihat pada Gambar 3 dan Tabel 1. Pada kontrol sel, sel yang masih hidup sebesar 88,28%, total sel yang mengalami apoptosis 6,13% dan yang mengalami nekrosis 5,67%. Sel dengan perlakuan cisplatin menunjukkan sel yang masih 11 2.69 2.69 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI hidup 61,80%, total sel yang mengalami apoptosis 36,06% dan yang mengalami nekrosis sebesar 2,69%. Cisplatin dapat menyebabkan kematian sel dengan cara menghentikan siklus sel dan menginduksi apoptosis jika ada kerusakan sel. Cisplatin dapat menginduksi apoptosis pada sel kanker HeLa dengan cara meregulasi proses apoptosis melalui jalur dependent p53 (Kutuk, dkk., 2009). Sedangkan sel dengan perlakuan ekstrak etil asetat daun keladi tikus menunjukkan sel yang masih hidup 2,38%, total sel yang mengalami apoptosis 11,80% dan yang mengalami nekrosis sebesar 86,03%. Pada penelitian ini uji apoptosis yang dilakukan terbatas karena hanya menggunakan satu time point yaitu 24 jam untuk waktu inkubasi perlakuan sehingga kemungkinan kematian sel sudah berlanjut menjadi nekrosis. Nekrosis yang terjadi akibat perlakuan ekstrak etil asetat daun keladi tikus kemungkinan karena adanya nekrosis sekunder yang merupakan lajutan dari apoptosis. Nekrosis sekunder terjadi karena karena secara in vitro tidak ada fagositosis badan apoptosis oleh makrofag. Nekrosis sekunder juga dapat terjadi kerena perubahan morfologi sel yang semula mengalami apoptosis menjadi nekrosis karena adanya pengaruh waktu inkubasi (Demoy, dkk., 2000). Morfologi sel yang mengalami apoptosis ditandai dengan penyusutan sel secara keseluruhan, blebbing atau pembengkakan membran plasma dan pembentukan badan apoptosis (Akl, dkk., 2014). Sedangkan morfologi sel yang mengalami nekrosis tidak terkontrol, tiba-tiba sel kehilangan integritas membran dan cairan ekstraseluler keluar dari sel (Martin & Henry, 2013). Oleh karena itu, perlu diamati kematian sel yang terjadi akibat perlakuan ekstrak etil asetat daun keladi tikus dengan waktu inkubasi kurang dari 24 jam. Penelitian lebih lanjut perlu dilakukan untuk mengamati induksi apoptosis pada beberapa time point sebelum 24 jam. Kemungkinan yang lain sel menunjukkan hasil nekrosis karena adanya blebing nekrosis yang meningkatkan permeabilitas terhadap propidium iodida. Salah satu ciri dari apoptosis adalah blebbing apoptosis dan nekrosis (Fackler & Grosse, 2008) yang menyebabkan sitoplasma keluar dari sel karena adanya tekanan hidrostatik dalam sel (Charras, dkk., 2005). Blebing nekrosis menyebabkan membran sel memiliki permeabilitas yang tinggi terhadap propidium iodida sehingga dapat memberikan data sel mengalami nekrosis karena sel mengikat reagen propidium iodida (Barros, dkk., 2003). Namun pada penelitian ini tidak dilakukan pengamatan morfologi sel setelah perlakuan, penelitian lebih lanjut perlu dilakukan untuk mengamati morfologi sel setelah perlakuan. 12 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Uji Imunositokimia Proses apoptosis diregulasi oleh faktor ekstrenal dan internal. Salah satu faktor internal dari proses apoptosis adalah Bcl-2 (B-cell lymphoma 2) (de Bruin & Medema, 2008). Sel kanker serviks Hela memiliki karakteristik overekspresi Bcl-2 sehingga menghambat proses apoptosis (You, dkk., 2010). Imunositokimia merupakan teknik untuk mendeteksi protein, antigen dalam satu jaringan dengan mendeteksi adanya reaksi antigen antibodi menggunakan bantuan penanda. Antibodi spesifik akan berikatan dengan antigen yang dideteksi dengan antibodi sekunder (Chen, dkk., 2010). Pada penelitian ini uji imunositokimia terhadap protein Bcl-2 dilakukan untuk mengidentifikasi apakah kematian sel diregulasi oleh protein Bcl-2 dengan tujuan mengetahui aktivitas ekstrak daun keladi tikus dalam menghambat protein Bcl2. Sel yang mengekspresikan protein Bcl-2 ditandai dengan warna coklat pada sitoplasma sedangkan sel yang tidak mengekspresikan Bcl-2 berwarna ungu. A B C D Gambar 4. Ekspresi Bcl-2 ekstrak etil asetat daun keladi tikus dan cisplatin. Sel HeLa (2x105 sel/mL) ditanam dalam 6 well-plate yang telah diberi cover slip diinkubasi selama 24 jam. Sel diberi perlakuan dengan ekstrak etil asetat daun keladi tikus ½ IC50 dan cisplatin konsentrasi IC50, diinkubasi selama 24 jam. Ekspresi protein diamati di bawah mikroskop cahaya dengan perbesaran 400 kali. (A) Kontrol sel tanpa antibodi Bcl-2. (B) Kontrol sel dengan antibodi Bcl-2. (C) Sel kanker serviks HeLa dengan perlakuan cisplatin (36 µg/mL). (D) Sel kanker serviks HeLa dengan perlakuan ekstrak etil asetat daun keladi tikus (320 µg/mL). Keterangan gambar: (menunjukkan sel tidak mengekspresikan Bcl-2) dan mengekspresikan Bcl-2) 13 (menunjukkan sel PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Tabel 2. Distribusi ekspresi Bcl-2 pada sel Hela Kontrol sel tanpa antibody Kontrol sel dengan antibody Cisplatin Ekstrak etil asetat daun keladi tikus Lapang Pandang Ekspresi Bcl-2 Level 1 (n = 90) 0 (0%) 0 2 (n = 85) 0 (0%) 0 3 (n = 107) 0 (0%) 0 1 (n = 105) 105 (100%) 4+ 2 (n = 97) 97 (100%) 4+ 3 (n = 106) 106 (100%) 4+ 1 (n = 128) 1 (0,78%) 0 2 (n = 125) 3 (2,4%) 0 3 (n = 107) 0 0 (0%) 1 (n = 207) 16 (7,73%) 1+ 2 (n = 219) 18 (8,22%) 1+ 3 (n = 178) 17 (9,55%) 1+ Pada tabel 2 dapat dilihat bahwa pada kontrol sel HeLa tanpa antibodi tidak mengekspresikan Bcl-2 (0%) level ekspresi 0, dan untuk kontrol sel HeLa dengan antibodi 100% mengekspresikan Bcl-2 level ekspresi +4. Untuk perlakuan sel HeLa dengan cisplatin mengekspresikan Bcl-2 sebesar 0,78%; 2,4% dan 0% dengan level ekspresi 0 yang menyatakan cisplatin sangat kuat menekan ekspresi Bcl-2. Cisplatin berinteraksi dengan Bcl-2 sebagai faktor intrinsik dalam apoptosis. Cisplatin menekan Bcl-2 sebagai mediator antiapoptosis, sehingga cisplatin dapat menginduksi apoptosis (Leisching, dkk., 2015). Oleh karena itu cisplatin digunakan sebagai pembanding atau kontrol positif dalam skrining penemuan agen kemopreventif yang selektif pada regulasi ekspresi protein Bcl-2. Sel HeLa dengan perlakuan ekstrak etil asetat daun keladi tikus mengekspresikan Bcl2 sebesar 7,73%; 8,22% dan 9,55% dengan level ekspresi +1 yang menyatakan ekstrak etil asetat daun keladi tikus kuat menekan ekspresi Bcl-2. Hal tersebut juga menyatakan bahwa proses apoptosis dari sel HeLa diperantarai melalui penekanan protein Bcl-2. Ketika aktivitas protein Bcl-2 sebagai agen antiapoptosis dihambat maka proses apoptosis atau kematian sel akan meningkat (Czabotar, dkk., 2014). Pada penelitian sebelumnya ekstrak etil asetat daun keladi tikus dapat menekan ekspresi protein siklooksigenase-2 (COX-2) (Setiawati, dkk., 2016). Protein COX-2 dapat memicu proliferasi sel dengan meningkatkan produksi PGE-2 14 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI yang dapat menghambat proses apoptosis dan meningkatkan produksi agen antiapoptosis yaitu Bcl-2. Sehingga dengan adanya penekanan COX-2 dapat menekan produksi Bcl-2 (Shehzad, dkk., 2015). Pada penelitian ini perhitungan ekspresi Bcl-2 bersifat semikuantitatif, diperlukan penelitian lebih lanjut untuk mengetahui ekspresi Bcl-2 secara kuantitatif. Protein Bcl-2 mencegah terlepasnya sitokrom-C sehingga proses apoptosis tidak terjadi, dengan dihambatnya protein Bcl-2 maka sitokrom C akan terlepas dan proses apoptosis dapat terjadi (Smedt & Bultynck, 2014). Sitokrom-c berikatan dengan apoptotic protease-activating factor 1 (Apaf-1), sehingga terbentuk kompleks yang teraktivasi dari (d)ATP, dan procaspase-9. Aktivasi caspase-9 memicu aktivasi caspase-3 dan caspase-7, sehingga memicu terjadinya apoptosis (Weyhenmeyer, dkk., 2012). Adanya mediator lainnya setelah terjadi penekanan ekspresi Bcl-2 juga berpengaruh pada proses apoptosis. Penelitian lebih lanjut diperlukan untuk mengetahui regulasi mediator lainnya yang berperan dalam proses apoptosis setelah terjadi penekanan ekspresi Bcl-2. KESIMPULAN Hasil yang diperoleh, ekstrak etil asetat daun keladi tikus memiliki aktivitas sitotoksik lemah dengan nilai IC50 640 µg/mL. Hasil uji apoptosis pada konsentrasi ½ IC50 dengan waktu inkubasi 24 jam menunjukkan bahwa sampel menginduksi kematian melalui apoptosis sebesar 12% dan nekrosis sekunder yang merupakan lanjutan dari apoptosis sebesar 86%. Hasil uji imunositokimia menunjukkan sampel menekan kuat ekspresi protein Bcl-2, sehingga kemungkinan induksi apoptosis diperantarai penekanan ekspresi protein Bcl-2. Bedasarkan hasil tersebut, ekstrak etil asetat daun keladi tikus memiliki potensi sebagai agen kemopreventif namum masih perlu ditelusuri lebih lanjut terutama induksi kematian sel. Saran untuk penelitian selanjutnya perlu dilakukan identifikasi kandungan dari ekstrak etil asetat daun keladi tikus dan mengetahui selektivitas ekstrak etil asetat daun keladi tikus terhadap sel kanker. Mekanisme induksi apoptosis perlu dikonfirmasi dengan melakukan time course assay dengan waktu inkubasi kurang dari 24 jam. Selain itu penelitian lebih lanjut juga perlu dilakukan uji untuk mengetahui ekspresi protein Bcl-2 secara kuantitatif serta penelitian lebih lanjut untuk mengetahui regulasi mediator lainnya setelah terjadi penekanan ekspresi protein Bcl-2. 15 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI DAFTAR PUSTAKA Akl, H., Vervloessem, T., Kiviluoto, S., Bittremieux, M., Parys, J. B., De Smedt, H., & Bultynck, G., 2014. A dual role for the anti-apoptotic Bcl-2 protein in cancer: Mitochondria versus endoplasmic reticulum. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research, 1843(10), 2240–2252. American Cancer Society. 2016. Cancer Facts & Figures 2016. Cancer Facts & Figures 2016, 1–9. Barros, L. F., Kanaseki, T., Sabirov, R., & Morishima, S. 2003. Apoptotic and necrotic blebs in epithelial cells display similar neck diameters but different kinase dependency, d, 687– 697. Cancer Chemoprevention Research Centera, 2009. Prosedur Tetap: Panen Sel, Unversitas Gajah Mada, Yogyakarta, http://ccrc.farmasi.ugm.ac.id/en/wp-content/uploads/03.005.Panen-Sel.pdf diakses pada tanggal 1 April 2016. Cancer Chemoprevention Research Centerb, 2009. Prosedur Tetap: Pengamatan Ekspresi Protein dengan Metode Immunositokimia, Unversitas Gajah Mada, Yogyakarta, http://ccrc.farmasi.ugm.ac.id/en/wp-content/uploads/03.012.-Imunositokimia.pdf diakses pada tanggal 1 April 2016. Cancer Chemoprevention Research Centerc, 2009. Prosedur Tetap: Preparasi Sampel untuk Flowcytometry, Unversitas Gajah Mada, Yogyakarta, http://ccrc.farmasi.ugm.ac.id/wp-content/uploads/03.014.02-flowcytometry.pdf diakses pada tanggal 1 April 2016. Cancer Chemoprevention Research Centerd, 2009. Prosedur Tetap: Uji Sitotoksik Metode MTT, Unversitas Gajah Mada, Yogyakarta, http://ccrc.farmasi.ugm.ac.id/wpcontent/uploads/03.010.02-uji-sitotoksik-MTT.pdf diakses pada tanggal 1 April 2016. Charras, G. T., Yarrow, J. C., Horton, M. A., Mahadevan, L., & Mitchison, T. J. (2005). Nonequilibration of hydrostatic pressure in blebbing cells. Nature, 435(7040), 365–9. Cheever, M. A., Allison, J. P., Ferris, A. S., Finn, O. J., Hastings, B. M., Hecht, T. T., Matrisian, L. M. 2009. The prioritization of cancer antigens: A National Cancer Institute pilot project for the acceleration of translational research, Clinical Cancer Research, 15(17), 5323–5337. Czabotar, P. E., Lessene, G., Strasser, A., & Adams, J. M. 2014. Control of apoptosis by the BCL-2 protein family: implications for physiology and therapy. Nature Reviews. Molecular Cell Biology, 15(1), 49–63. 16 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Da’i M, Five A, Meiyanto E. 2007. Efek Sitotoksik Ekstrak Tanaman Keladi Tikus (Typhonium divaricatum, L.) terhadap Sel HeLa. J Farm Ind. 3 : 163-7 Dasari, S., & Bernard, P. (2014). Cisplatin in an er therapy : Mole ular me hanisms of action. European Journal of Pharmacology, 1–15. De Bruin, E. C., & Medema, J. P. 2008. Apoptosis and non-apoptotic deaths in cancer development and treatment response. Cancer Treatment Reviews, 34(8), 737–749. DeSantis, C. E., Lin, C. C., Mariotto, A. B., Siegel, R. L., Stein, K. D., Kramer, J. L., Jemal, A. 2014. Cancer treatment and survivorship statistics, 2014. CA Cancer J Clin, 64(4), 252–271. Demoy, M., Minko, T., & Kopeckova, P. 2000. Time- and concentration-dependent apoptosis and necrosis induced by free and HPMA copolymer-bound doxorubicin in human ovarian carcinoma cells, 69, 185–196. Ellithey, M. S., Lall, N., Hussein, A. A., & Meyer, D. 2014. Cytotoxic and HIV-1 enzyme inhibitory activities of Red Sea marine organisms. BMC Complementary and Alternative Medicine, 14, 77. Fackler, O. T., & Grosse, R. 2008. Cell motility through plasma membrane blebbing, 879– 884. Ferlay, J., Soerjomataram, I., Dikshit, R., Eser, S., Mathers, C., Rebelo, M., Bray, F. 2015. Cancer incidence and mortality worldwide: Sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012. International Journal of Cancer, 136(5), E359–E386. Galluzzi, L., Vacchelli, E., Bravo-San Pedro, J.-M., Buqué, A., Senovilla, L., Baracco, E. E., Kroemer, G., 2014, Classification of current anticancer immunotherapies. Oncotarget, 5(24), 12472–508. Guimaraes, M.C.M., dkk., 2005. Immunohistochemical Expression of p16INK4a and bcl-2 According to HPV Type and to the Progression of Cervical Squamous Intraepithelial Lesions. Journal of Histochemistry & Cytochemistry, 53(4), 509–16. Hayrabedyan, S., Georgiev, B., Kacheva, D., Chervenkov, M., Shumkov, K., Taushanova, P., & Kistanova, E. (2012). Flowcytometry as a method for advanced evaluation of boar semen. Comptes Rendus de L’Academie Bulgare Des Sciences, 65(4), 541–548. Hemaiswarya, S., & Doble, M. 2006. Potential synergism of natural products in the treatment of cancer. Phytotherapy Research : PTR, 20(November 2005), 239–249. Hingorani, R., Deng, J., Elia, J., McIntyre, C., & Mittar, D. 2011. Detection of Apoptosis 17 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Using the BD Annexin V FITC Assay on the BD FACSVerseTM System. BD Biosciences, August(August), 1–12. Ho, W. Y., Yeap, S. K., Ho, C. L., Rahim, R. A., & Alitheen, N. B. 2012. Development of Multicellular Tumor Spheroid, MCTS) Culture from Breast Cancer Cell and a High Throughput Screening Method Using the MTT Assay. PLoS ONE, 7(9). Huang, H., Chen, A. Y., Ye, X., Li, B., Rojanasakul, Y., Rankin, G. O., & Chen, Y. C., 2015. Myricetin inhibits proliferation of cisplatin-resistant cancer cells through a p53dependent apoptotic pathway. International Journal of Oncology, 47(4), 1494–1502. International Agency for Research on Cancer WHO (IARC), 2015, Estimated Cancer Incidence, Mortality and Prevalence, tersedia dalam www.http://globocan.iarc.fr/, diakses tanggal 15 Juli 2016. Jo, H. Y., Kim, Y., Park, H. W., Moon, H. E., Bae, S., Kim, J., Paek, S. H. 2015. The Unreliability of MTT Assay in the Cytotoxic Test of Primary Cultured Glioblastoma Cells, 24(3), 235–245. Katrin, E., Winarno, H., Susanto, & N., F., 2012, Karakteristika dan Khasiat Daun Keladi tikus, Typhonium divaricatum, L .) Decne ) Iradiasi. Jurnal Ilmiah Aplikasi Isotop Dan Radiasi, 8(1), 31–35. Kutuk, O., Arisan, E. D., Tezil, T., Shoshan, M. C., & Basaga, H. 2009. Cisplatin overcomes Bcl-2-mediated resistance to apoptosis via preferential engagement of Bak: Critical role of Noxa-mediated lipid peroxidation. Carcinogenesis, 30(9), 1517–1527. Landry, J. J. M., Pyl, P. T., Rausch, T., Zichner, T., Tekkedil, M. M., Stütz, A. M., Steinmetz, L. M., 2013, The genomic and transcriptomic landscape of a HeLa cell line. G3,Bethesda, Md.), 3(8), 1213–24. Leisching, G., Loos, B., Botha, M., & Engelbrecht, A.-M. 2015. A Nontoxic Concentration of Cisplatin Induces Autophagy in Cervical Cancer. International Journal of Gynecological Cancer, 25(3), 380–388. Li, ZF., Wang, ZD., Ji, YY., Zhang, S., Huang, C., Li J., Xia, XM. 2009. Induction of apoptosis and cell cycle arrest in human HCC MHCC97H cells with Chrysanthemum indicum extract. World J Gastroenterol September 28; 15 (36): 4538-4546. Mankaran, S., Dinesh, K., Deepak, S., & Gurmeet, S. 2013. Typhonium flagelliforme : A multipurpose plant. International research journal of pharmacy, 4(3), 45–48. Masood, A., Azmi, A. S., & Mohammad, R. M. 2011. Small molecule inhibitors of Bcl-2 family proteins for pancreatic cancer therapy. Cancers, 3(2), 1527–1549. 18 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Martin, S.J., & Henry, C.M. 2013. Distinguishing between apoptosis, necrosis, necroptosis and other cell death modalities. Molecular Cell Biology Laboratory 2013, 87-89. Nobakht, G. M., Kadir, M. a, Stanslas, J., & Charng, C. W. 2014. Cytotoxic effect of Typhonium flagelliforme extract. Journal of Medicinal Plants Research, 8(31), 1021– 1024. Purwaningsih E., Widayanti E., Suciati Y. 2014. Cytotoxic Assay of Typhonium flagelliforme Lodd Against Breast and Cervical Cancer Cell. Universa Medicina Vol. 33.No.2. Sak, K. 2012. Chemotherapy and dietary phytochemical agents. Chemotherapy Research and Practice, 2012, 282570. Sharma, R., 2012. Cancer Chemoprevention: Prevention is Better than Cure. Cancer Science Therapy, S3:e001. Shehzad, A., Lee, J., & Lee, Y. S. 2015. Autocrine prostaglandin E 2 signaling promotes promonocytic leukemia cell survival via COX-2 expression and MAPK pathway, 48(2), 109–114. Setiawati, A., Immanuel, H., & Utami, M. T. 2016. The inhibitor of (Typhonium flagelliforme (Lodd.) Blume) leaf extract on COX-2 expression of WiDr colon cancer cells. Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine, 6(3), 251–255. Smedt, H. De, & Bultynck, G. 2014. A dual role for the anti-apoptotic Bcl-2 protein in cancer: Mitochondria versus endoplasmic reticulum. BBA - Molecular Cell Research. Xu, T., dkk., 2014. Proteomic Investigation into Betulinic Acid-Induced Apoptosis of Human Cervical Cancer HeLa Cells. PLoS ONE, 9(8), 1–11. You, B. R., Moon, H. J., Han, Y. H., & Park, W. H. 2010. Gallic acid inhibits the growth of HeLa cervical cancer cells via apoptosis and/or necrosis. Food and Chemical Toxicology : An International Journal Published for the British Industrial Biological Research Association, 48(5). Zhang, H., Ph, D., Sun, X., & Ph, D. 2002. Overexpression of Cyclooxygenase-2 Correlates With Advanced Stages of Colorectal Cancer, Am J Gastroenterol, 97(4), 1–5. Weyhenmeyer, B., Murphy, A. C., Prehn, J. H. M., & Murphy, B. M., 2012. Targeting the Anti-apoptotic Bcl-2 Family Members for the Treatment of Cancer. Experimental Oncology, 34(3), 192–199. 19 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI LAMPIRAN 20 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Lampiran 1. Gambar tanaman keladi tikus dan proses ekstraksi Gambar A. Tanaman keladi tikus dipetik dan dicuci menggunakan air mengalir kemudian diangin-anginkan sebelum dimasukkan ke dalam oven Gambar B. Simplisia daun keladi tikus disari menggunakan pelarut etil asetat dengan proses maserasi dan diulang sebanyak tiga kali 21 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Lampiran 2. Pengolahan data uji MTT assay Data Konsentrasi Ekstrak Etil Asetat Daun Keladi Tikus vs Viabilitas Sel viabilitas sel (%) Konsentrasi No. (µg/mL) v1 v2 v3 rata – rata SD A 0 100,000 100,000 100,000 100,000 0,000 B 47 66,479 71,783 68,849 69,037 2,657 C 94 69,413 73,815 68,623 70,617 2,797 D 188 63,093 71,558 68,736 67,795 4,310 E 375 76,975 77,878 68,284 74,379 5,298 F 750 25,282 27,991 62,077 38,450 20,506 G 1500 7,111 10,835 4,515 7,487 3,177 Kurva Konsentrasi ekstrak vs % Viabilitas Sel 120 viabilitas sel (%) 100 80 60 40 20 0 0 200 400 600 800 1000 1200 Ekstrak Daun Keladi Tikus (µg/mL) 22 1400 1600 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Data Konsentrasi Cisplatin vs % Viabilitas Sel viabilitas sel (%) Konsentrasi No. (µg/mL) v1 v2 v3 rata - rata SD A 0 100,000 100,000 100,000 100,000 0,000 B 5 73,003 90,551 105,062 89,539 16,053 C 10 56,468 78,909 101,181 78,853 22,357 D 20 39,258 49,888 64,398 51,181 12,620 E 39 31,159 31,159 37,402 33,465 3,426 F 78 25,253 9,393 15,804 16,817 7,979 Kurva Konsentrasi Cisplatin vs % Viabilitas Sel viabilitas sel (%) 120 100 80 60 40 20 0 0 20 40 60 Cisplatin (µg/mL) 23 80 100 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Lampiran 3. Dokumentasi Uji Apoptosis File: KS HeLa.001 Gate: No G ate Tota l Even ts: 20000 Quad % Gated % Total UL 5.05 5.05 UR 2.50 2.50 LL 88.72 88.72 LR 3.74 3.74 R4 R3 File: KS HeLa.001 Gate: No G ate Tota l Even ts: 20000 R2 R1 24 Re gion % Gated % Total R1 88.28 88.28 R2 3.55 3.55 R3 2.58 2.58 R4 5.67 5.67 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI File: cisplatin HeLa.006 Gate: No G ate Tota l Even ts: 20000 Quad % Gated % Total UL 2.54 2.54 UR 10.54 10.54 LL 61.02 61.02 LR 25.91 25.91 R4 File: cisplatin HeLa.006 Gate: No G ate Tota l Even ts: 20000 R2 R1 25 Re gion % Gated % Total R1 61.80 61.80 R2 25.44 25.44 R3 10.62 10.62 R4 2.69 2.69 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI File: KEL ADI TIKUS I HeLa APOPT.006 Gate: No G ate Tota l Even ts: 20000 Quad % Gated % Total UL 86.01 86.01 UR 11.58 11.58 LL 2.40 2.40 LR 0.01 0.01 File: KEL ADI TIKUS I HeLa APOPT.006 Gate: No G ate Tota l Even ts: 20000 R2 R1 26 Re gion % Gated % Total R1 2.38 2.38 R2 0.01 0.01 R3 11.79 11.79 R4 86.03 86.03 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Lampiran 4. Dokumentasi Uji Imunositokimia Pengamatan tiga lapang pandang sel kanker serviks HeLa dalam perhitungan imunositokimia A. Kontrol sel tanpa antibodi B. Kontrol sel dengan antibodi C. Sel kanker serviks HeLa dengan perlakuan cisplatin 27 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI D. Sel kanker serviks HeLa dengan perlakuan ekstrak daun keladi tikus 28 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Lampiran 5. Surat keterangan hasil determinasi tanaman keladi tikus 29 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Lampiran 6. Ethical Clearance 30 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI BIOGRAFI PENULIS Penulis Skripsi berjudul “Daun Keladi Tikus (Typhonium flagelliforme (Lodd.) Blume) sebagai Agen Kemopreventif terhadap Sel Kanker Serviks (HeLa) Melalui Regulasi Bcl-2” memiliki nama lengkap Fira Elsa Septiana, merupakan anak pertama dari empat bersaudara pasangan Bapak Mariyoto dan Ibu Ester Dyah Retnowati. Penulis dilahirkan di Jepara, 5 September 1995. Pendidikan formal yang ditempuh penulis dimulai di TK Kartini Jepara (2000-2001). Pendidikan dilanjutkan ke SD Kanisius Jepara (2001-2007), setelah itu dilanjutkan ke SMP Negeri 1 Jepara (2007-2010), dan tingkat pendidikan menengah atas di SMA Negeri 1 Jepara (2010-2013). Pada tahun 2013, penulis melanjutkan pendidikaan pada jenjang perguruan tinggi di Fakultas Farmasi Sanata Dharma Yogyakarta. Penulis terlibat dalam berbagai kepanitian dan pengurus unit kegiatan fakultas di dalam kampus, antara lain menjadi anggota seksi acara dalam acara Donor Darah JMKI 2014, anggota seksi publikasi dekorasi dan dokumentasi dalam Seminar Nasional Interprofesional Health Care JMKI 2014, anggota seksi konsumsi dalam Pelepasan Wisuda Angkatan XXVIII tahun 2015, sebagai divisi pendamping kelompok dalam Inisiasi Sanata Dharma (INSADHA) 2015, sebagai seksi doa dan pemerhati UKF PMK Apostolos Farmasi periode 2014/2015 dan sebagai seksi ibadah dan pelayanan UKF PMK Apostolos Farmasi periode 2015/2016. Selain itu, penulis juga pernah menjadi asisten praktikum Biologi Sel dan Molekuler tahun 2015 dan 2016. 31
