cancer chemoprevention research center fakultas farmasi ugm

CANCER CHEMOPREVENTION RESEARCH CENTER
FAKULTAS FARMASI UGM
Dokumen nomor :
Mengganti nomor :
Hal. 1 dari 3
Tanggal :
Tanggal :
URAIAN
Jabatan
Paraf
DIBUAT OLEH
Staf CCRC
DIPERIKSA OLEH
Staf CCRC
DIPERIKSA OLEH
Supervisor CCRC
DISETUJU OLEH
Pimpinan CCRC
Nama
Tanggal
Ulfatul Husnaa
Dyaningtyas Dewi PP
Riris IJ
Edy Meiyanto
PROSEDUR TETAP
OPTIMASI DAPI IMUNOFLUOROSENSE
A. RIWAYAT REVISI DOKUMEN
B. TUJUAN
.
C. PENDAHULUAN
.
D. OPERASIONAL
1. Alat:
- Mikropipet 200 μl, 1,000 μl
- Pinset
2. Bahan:
- Alkohol 70% dingin
- PBS
- DAPI
3. Penanaman sel
No
Prosedur Kerja
1. Lakukan panen sel sesuai Protokol Panen Sel.
sesuai
Protokol  Jumlah sel yang dibutuhkan untuk uji
2.
Lakukan perhitungan
Perhitungan Sel
3.
Siapkan 6 well plate dan cover slip.
-
4.
Masukkan cover slip ke dalam sumuran menggunakan
pinset dengan hati-hati.
Transfer 200 μl ncubato sel tepat di atas coverslip secara
merata dan perlahan, kemudian diamkan selama 3-30
menit dalam ncubator agar sel menempel pada coverslip.
Setiap penggunaan coverslip, tulis di Kartu
stock CCRC
 Setiap akan mengisi sumuran, resuspensi sel
kembali.
 Pastikan sel sudah menempel pada coverslip
dengan mikroskop inverted
5.
sel
Perhatian
apoptosis dengan metode double staining
adalah 5x104 sel/sumuran.
 Membuat suspensi sel 5x104 sel masingmasing 1000 μl/sumuran.
CANCER CHEMOPREVENTION RESEARCH CENTER
FAKULTAS FARMASI UGM
Dokumen nomor :
Mengganti nomor :
Hal. 2 dari 3
Tanggal :
Tanggal :
4. Perlakuan Imunofluorosense Sampel pada Sel
1.
Setelah sel normal kembali, segera buat satu  Untuk imunosfluorosense menggunakan
konsentrasi sampel, yaitu pada IC50 untuk perlakuan antibodi, minimal diperlukan 3 perlakuan:
sebanyak 1000 μl.
a. Perlakuan dengan sampel.
b. Kontrol sel tanpa antibodi primer
c. Kontrol sel dengan antibodi primer.
2.
3.
4.
 Kontrol sel hanya ditambah MK.
Ambil well plate yang telah berisi sel dari inkubator CO2.
Buang semua MK dari sumuran dengan pipet Pasteur secara perlahan-lahan.
Isikan PBS masing-masing 500 μL ke dalam
sumuran untuk mencuci sel.
5.
8.
Buang PBS dari sumuran dengan pipet Pasteur secara
perlahan-lahan.
Masukkan sampel sebanyak 1000 μL ke dalam
sumuran
Masukkan 1000 μL MK untuk kontrol sel (2 kontrol
sel).
Inkubasi di dalam inkubator CO2
10.
Amati kondisi sel setelah waktu inkubasi
11.
Tambahkan etanol 70% dingin selama 15 menit pada Pastikan dalam kondisi tertutup
suhu ruang.
Buang etanol 70 % dari sumuran dengan pipet Pasteur secara perlahan.
Cuci dengan PBS
Ambil coverslip dan keringkan
Tambahkan DAPI 50-200 μl, diamkan selama 10-15
menit
Cuci dengan PBS 3 kali selama 5 menit
6.
7.
12.
13.
14.
15.
16.
Lama inkubasi tergantung dai antibodi yang
akan dilihat
Dokumentasikan dengan kamera.
17.
Ambil dan letakkan cover slip di atas object glass, tetesi dengan lem (mounting media). Tutup cover slip
dengan cover slip kotak.
18.
Amati dengan mikroskop imunofluorosens.
19.
Setiap selesai melakukan pekerjaan, lakukan sanitasi seperti pada Protokol Persiapan Kerja In Vitro di
Laboratorium.
-
CANCER CHEMOPREVENTION RESEARCH CENTER
FAKULTAS FARMASI UGM
Dokumen nomor :
Mengganti nomor :
Hal. 3 dari 3
Tanggal :
Tanggal :
5. Analisis dan Interpretasi Data
Treatment
DAPI Staining
p65-conjugate Staining
Superimposed Image
Vehicle
Dox 1/2 IC50
UA 1/2 IC50
Dox 1/2 IC50 UA 1/2 IC50
Ursolic acid suppressed elevated p65 expression induced by doxorubicin on MCF-7 cells.
Fifty thousand cells/well were incubated, followed by sample treatments for 24 hours. Concentration of 1/2 IC50
doxorubicin and 1/2 IC50 ursolic acid were used. Fixation using 70% ethanol, addition of 1% blocking serum albumin,
incubation with primary (p65) and secondary antibody were done prior to addition of DAPI. Cells were then mounted
and observed under fluorescence microscope, 400x magnification. Analysis was done qualitatively. Higher p65
expression showed by higher intensity of bright yellow-orange colour.