24 IV HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1 Susunan DNA Primer HSP 70

24
IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Susunan DNA Primer HSP 70
Pengamatan yang dilakukan untuk mengetahui seberapa besar ekspresi gen
HSP 70 yang muncul pada sampel itik saat pengukuran menggunakan PCR harus
didapatkan susunan DNA yang spesifik terlebih dahulu yaitu dengan mencari DNA
primer, pencarian DNA primer dapat dilakukan dengan menggunakan situs
National Center for Biotechnolgy Information (NCBI) dengan situs aksesnya
adalah ncbi.nlm.nih.gov (Lampiran 4).
Hasil yang diperoleh dari pencarian tersebut adalah DNA Primer yang
dapat dilihat pada tabel 12, tabel tersebut menunjukan produk DNA primer yang
dapat digunakan untuk mencari DNA target pada sampel darah itik, Proses
pencarian gen HSP dilakukan dengan mencari sequence DNA HSP yang spesifik
pada DNA Map (Lampiran 5) menggunakan primer - BLAST (Basic Local
Alignment Search Tool) di situs NCBI. DNA yang diperoleh terdiri dari 10 DNA
primer (Lampiran 6) kemudian dipilih dengan mempertimbangkan desain primer
yang sesuai.
Tabel 1. Data DNA Primer HSP 70
Gen
HSP 70
kDA
ID
Primer Set 5’ – 3’
Tm
NW_004677311.1
F : 5’-TCCAGAAGTTCGGCATTTCTCA-3’
59,96
R : 5’-GGAGAAACTCTGCAACCCGA-3’
59,97
Sumber : ncbi.nlm.nih.gov
Keterangan : ID
: ID gen squence HSP
Tm
: Temperatur
25
Pengamatan HSP dalam penelitian ini perlu dilakukan karena HSP
merupakan bagian dari molekul chaperone yang akan muncul ketika itik mengalami
stres panas, stres panas tersebut dapat timbul akibat kondisi kandang penelitian
yang minim air juga tempertur yang panas, Kondisi suhu yang panas dapat
menyebabkan melemahnya ikatan hidrogen
sehingga lipatan protein menjadi
terbuka atau terdenaturasi. Chaperone bekerja dengan cara mengikat dan memberi
tenaga pada protein tersebut mengubahnya menjadi konformasi yang tepat
(Moyes, 2006).
DNA HSP pada itik dapat muncul akibat stres yang disebabkan oleh adanya
dampak radikal bebas (Van Milgen, 2003) yang disebabkan oleh stres psikis dan
suhu (Franco-Jimenez dkk., 2007), hal ini sesuai dengan pendapat Milne dkk.
(2012) yang menyatakan bahwa ekspresi gen HSP akan meningkat akibat cekaman
stres yang distimulasi oleh radikal bebas.
4.2 Pengaruh pemberian minyak buah Makasar terhadap ekspresi RNA
Tabel 2. Hasil pengamatan Jumlah Ekspresi Gen HSP
Ulangan
Perlakuan
1
2
3
4
5
6
rata-rata
K
BJA
BJB
BJC
-----------------------------------ng/mL----------------------------3,546
3,104
2,548
2,427
3,718
2,967
2,614
2,397
3,854
3,171
2,672
2,392
3,415
3,073
2,582
2,356
4,003
2,956
2,736
2,418
3,946
3,164
2,525
2,355
3,75±0,23
3.07±0.09
2.61±0,08
2.39±0,03
Data yang diperoleh dari hasil analisis laboratorium pada Tabel 6
menunjukan nilai dimana jumlah ekspresi gen HSP paling tinggi terdapat pada
perlakuan K= 0 µL tanpa pemberian MBM dengan rata – rata Ekspresi HSP sebesar
26
3,75 ng/ml, sedangkan ekspresi gen HSP paling kecil terdapat pada kelompok itik
yang diberi perlakuan MBM sebanyak 200 µL. Kemudian untuk mengetahui
perbedaan antar perlakuan maka dilakukan analisis stastistik dengan dilakukan uji
contrast orthogonal (Lampiran 3).
Pada itik tanpa pemberian MBM K=0 µL, akan menunjukan jumlah
ekspresi gen HSP yang paling tinggi, mekanisme timbulnya jumlah ekspresi gen
HSP terjadi ketika beban stres berlebih baik karena suhu maupun oleh psikis
(kehilangan kebiasaan berendam di air) menyebabkan sistem syaraf pusat (CNS)
aktif secara terus menerus dalam mengirimkan sinyal kepada target-target organ
untuk melakukan homoestasis (Franco-Jimenez dkk., 2007; Tan dkk., 2010).
Hormon merupakan salah satu senyawa penyinalan yang akan memberikan efek
serangkaian reaksi (kaskade sinyal) kepada organ target (Tan dkk., 2010).
Pemeliharaan penelitian dilakukan dengan menempatkan itik pada kondisi
minim air akibatnya itik menjadi stres sehingga akan berdampak pada bagian
seluler yang menimbulkan potensi bioenergetik berlebihan (Won dkk., 2012). Pada
kondisi tersebut menyebabkan terjadi proses reduksi dan oksidasi molekul dan ion
H meningkat tajam. Sehingga ternak mengalami stres psikis dan hipoxia (Burdick
dkk., 2011), kondisi demikian diikuti dengan adanya peningkatan aktivitas enzim
citokrom dan ATPase (Araujo dkk.,
1998) dan (Uppu dkk.,
peningkatan radikal bebas (OH-, O2-, H2O2) (Turrens, 2003).
2010) serta
27
Tabel 3. Signifikansi Jumlah Ekspresi Gen HSP
Perlakuan
BJC
BJB
BJA
K
Keterangan : BJA
BJB
BJC
Rata - rata
2.39
2.61
3.07
3.75
*Signifikansi
a
b
c
d
: Pemberian minyak 100 µL
: Pemberian minyak 150 µL
: Pemberian minyak 200 µL
*Abjad yang berbeda (a,b,c dan d) pada kolom signifikansi
menunjukan perbedaan yang sangat nyata antar perlakuan (P < 0,01)
Berdasarkan hasil analisis Anova polinomial orthagonal (Lampiran 1) dapat
diketahui bahwa pemberian minyak buah makasar sebanyak 100 µL, 150 µL dan
200 µL dapat memberi pengaruh yang sangat nyata terhadap ekspresi gen mRNA
(P < 0,01). jumlah ekspresi HSP antar perlakuan dengan pemberian dosis MBM 0
µL, 100 µL, 150 µL dan 200 µL secara berurutan adalah 3,75 ng/mL , 3,07 ng/mL
, 2,61 ng/mL , 2,39 ng/mL. Faktor penyebab penurunan ekpresi mRNA HSP
disebabkan karena pemberian minyak buah makasar yang mengandung asam lemak
linoleat.
Linoleat pada minyak buah makasar tersebut berfungsi sebagai
antioksidan yang dapat menurunkan radikal bebas.
Penelitian yang dilakukan telah menunjukan bahwa pemberian MBM dapat
menurunkan tingkat radikal bebas yang menyebabkan meningkatnya ekspresi HSP
pada itik, mekanisme penurunan radikal bebas dilakukan dengan cara aktivitas
antioksidan merespon dan melakukan pertahanan dengan menyerang radikal bebas
melalui pengikatan ion OH-. O2- dan H2O2 dengan ikatan hidroxil pada asam lemak
linoleat (Long dkk., 2012).
28
Hasil uji contrast orthogonal (Lampiran 2) menunjukan adanya perbedaan
antar perlakuan. Perbedaan tersebut dapat disederhanakan pada tabel 2 yang
menunjukan adanya perbedaan sangat nyata antar perlakuan, nilai tertinggi yang
menunjukan ekspresi gen HSP terdapat pada ternak tanpa perlakuan K = 0 µL,
sedangkan nilai ekspresi gen HSP yang paling rendah terdapat pada perlakuan
dengan pemberian minyak buah makasar sebanyak 200 µL. Pada pengamatan tabel
menunjukan adanya penurunan jumlah ekspresi HSP ketika dosis pemberian MBM
bertambah.
Jumlah Ekpresi mRNA
Jumlah Ekspresi HSP
4.00
3.50
3.00
2.50
2.00
1.50
1.00
y = -0.0091x + 3.635
R² = 0.9524
0.50
0.00
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Jumlah Pemberian BJ
Ilustrasi 3. Jumlah Ekspresi mRNA HSP
Pada ilustrasi 3. Dapat diketahui bahwa pemberian MBM terhadap ekspresi
gen mRNA HSP merupakan linear yang bersifat negative sehingga jumlah ekspresi
mRNA gen HSP akan semakin menurun dengan setiap bertambahnya jumlah dosis
MBM yang diberikan.
Pada data pengamatan dapat dilihat bahwa itik yang diberi 0 nl MBM
menunjukan ekspresi gen HSP yang tinggi disebabkan itik mengalami stres psikis
dan fisiologik (Franco-Jimenez dkk., 2007; Tan dkk., 2010). Produktivitas itik
yang dipelihara dalam kondisi tersebut dapat menurun secara drastis, hal tersebut
29
disebabkan selama heat shock sel akan melakukan peningkatan sintesis dari
beberapa HSP. Sel tersebut dapat memberhentikan proses transkripsi dan translasi
dari gen - gen lainnya membagi sumber daya biosintetik untuk sintesis HSP
(Moyes, 2006).