UJI AKTIVITAS ANTIBAKTERI EKSTRAK METANOL GANGGANG

UJI AKTIVITAS ANTIBAKTERI EKSTRAK METANOL GANGGANG MERAH
(Gracilaria verrucosa) TERHADAP BEBERAPA BAKTERI PATOGEN GRAM
POSITIF DAN GRAM NEGATIF
Skripsi
Diajukan Untuk Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Far).
Oleh
Muhamad Irwan Prima
NIM: 107102001564
PROGRAM STUDI FARMASI
FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN
UNIVERSITAS ISLAM NEGRI SYARIFHIDAYATULLAH
JAKARTA
2012
i
ii
iii
iv
ABSTRAK
UJI AKTIVITAS ANTIBAKTERI EKSTRAK METANOL GANGGANG
MERAH (Gracilaria verrucosa) TERHADAP BEBERAPA BAKTERI
PATOGEN GRAM POSITIF DAN GRAM NEGATIF
Telah dilakukan penelitian uji aktivitas antibakteri ektrak metanol ganggang
merah Gracilaria verrucosa terhadap tiga bakteri patogen gram positif dan tiga
bakteri patogen gram negatif. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui
aktivitas antibakteri dari ekstrak metanol ganggang merah (Gracilaria verrucosa)
terhadap bakteri gram positif (Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis,
Streptococcus pneumoniae) dan bakteri gram negatif (Escherichia coli,
Pseudomonas aeruginosa, Proteus mirabillis). Sampel ganggang merah
(Gracilaria verrucosa) dimaserasi dengan pelarut metanol kemudian dilakukan uji
aktivitas antibakteri dengan metode difusi cakram yang dibandingkan dengan
kontrol positif amoksisilin. Hasil dari penelitian ini menunjukan bahwa ekstrak
metanol Gracilaria verrucosa tidak memiliki aktivitas antibakteri terhadap bakteri
uji pada konsentrasi 100, 1000, 10.000, dan 100.000 µg/ml.
Kata kunci : Ganggang merah, Gracilaria verrucosa, Antibakteri, Bakteri gram
positif, Bakteri gram negatif.
v
ABSTRACT
ANTIBACTERIAL ACTIVITY OF METHANOL EXTRACTS OF RED
ALGAE (Gracilaria verrucosa) TO SOME PHATOGEN GRAM-POSITIVE
AND GRAM-NEGATIVE BACTERIA
The antibacterial activity of methanol extract of red algae (Gracilaria verrucosa)
was tested to some phatogen Gram-positive and some Gram-negative bacteria.
The aim of this research is to know further antibacterial activity from metanolic
extract of red algae (Gracilaria verrucosa) against Gram-positive bacteria
(Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Streptococcus pneumoniae) and Gramnegative bacteria (Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Proteus mirabillis).
Sample was macerated with methanol and tested its antibacterial activity by disc
diffusion method. The result of this reseach showed that methanol extract of red
algae (Gracilaria verrucosa) has not activity against some phatogen Grampositive and Gram-negative bacteria at concentrations 100, 1000, 10.000, dan
100.000 µg/ml.
Key words : Red Algae, Gracilaria verrucosa, Antibacterial, Gram-positive
bacteria, Gram-negative bacteria
vi
KATA PENGANTAR
Segala puji dan Syukur kehadirat Allah SWT karena atas limpahan
nikmat, karunia dan rahmat-Nya penulis dapat menyelesaikan skripsi ini. Salawat
serta salam semoga tercurah kepada Nabi Muhammad SAW, keluarga, sahabat
dan pengikut-Nya yang telah membawa umat-Nya dari zaman kegelapan hingga
zaman yang kaya akan Ilmu Pengetahuan dan kemajuan teknologi seperti
sekarang ini.
Skripsi ini disusun untuk memenuhi salah satu syarat menempuh ujian
akhir guna mendapatkan gelar Sarjana Farmasi pada Program Studi Farmasi
Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.
Adapun judul skripsi ini adalah “Uji aktivitas antibakteri ekstrak metanol
ganggang merah Gracilaria verrucosa terhadap beberapa bakteri patogen
gram positif dan gram negatif”.
Penyusunan skripsi ini tidak terlepas dari bantuan berbagai pihak, maka
dalam kesempatan ini perkenankanlah penulis mengucapkan terima kasih kepada :
1.
Prof. DR. (hc) dr. M.K. Tadjuddin, Sp. And selaku Dekan Fakultas
Kedokteran dan Ilmu Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah.
2.
Drs. Umar Mansur, M.Sc selaku Ketua Program Studi Farmasi UIN Syarif
Hidayatullah.
3.
Prof. Dr. H Chairul, Apt selaku dosen pembimbing I (pertama) yang telah
meluangkan
waktu,
tenaga
dan
membimbing dan memotivasi kami.
vii
buah
pikirannya
untuk
mendidik,
4.
Dr. Ismiarni Komala, M.Sc, Apt selaku dosen pembimbing II (kedua) yang
telah meluangkan waktu, tenaga dan buah pikirannya untuk mendidik,
membimbing dan memotivasi kami.
5.
Orang tua saya yakni Bpk H. Wawan Kustiawan dan Ibu Hj. Elly Holiah serta
Saudara kandung saya yakni Yudha dan Robby yang telah memberikan
semangat, motifasi dan doa kepada kami sehingga tugas akhir ini dapat
disusun dan penelitian pun telah dilaksanakan
6.
Teman-teman seperjuangan selama di farmasi yakni Muhardi, Ibel, Lutfi,
Intan, Regi, Dimas, Bhanu, Kaniya, Fanny, dan Edriansyah. Juga teman
seperjuangan di Lab. Mikrobiologi, Aisyah, Zelin, Fajri, dan Selvy.
7.
Tidak lupa untuk Putri Tsaniah Amalia yang selalu memberi semangat dalam
penelitian.
8.
Teman - teman satu Kelas Farmasi B yang tetap kompak, peduli, setia kawan,
saling dapat merasakan satu sama lain dan teman-teman Farmasi angkatan
2007 yang ikut serta membantu selama penelitian ini.
9.
Kak Eris, Kak Rahmadi, S.Si, Kak Niken, S.Si, Kak Novi, S.Si, Kak Yopi
Mulyana, S.Far, Kak Tiwi, S.Far dan Kak Lisna Fauzia, S.Far yang telah
meluangkan waktu dan tenaganya untuk menyediakan tempat (laboratorium),
menyiapkan alat-alat dan bahan-bahan yang dibutuhkan selama penelitian.
10. Dosen - dosen Farmasi dan Staf akademik Program Studi Farmasi Fakultas
Kedokteran dan Ilmu Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah
yang telah
memberikan saran dan dukungannya terhadap penelitian yang kami
laksanakan.
viii
11. Dan kepada semua pihak yang telah membantu penulis selama penyusunan
skripsi ini yang tidak dapat disebutkan namanya satu persatu.
Penulis menyadari bahwa dalam penyusunan skripsi ini masih terdapat
kekurangan dan masih jauh dari kesempurnaan seperti pribahasa berikut “Tidak
ada gading yang tak retak” Oleh karena itu, penulis menerima saran, masukan dan
kritik dari para pembaca untuk memperbaiki kemampuan menulis pada
kesemapatan berikutnya.
Jakarta, Mei 2012
Penulis
ix
DAFTAR ISI
Halaman Judul...................................................................................
i
Lembar Persetujuan Skripsi .............................................................
ii
Lembar Pernyataan............................................................................ iii
Abstrak .............................................................................................. iv
Abstract .............................................................................................
v
Kata Pengantar .................................................................................. vi
Daftar Isi ........................................................................................... viii
BAB I PENDAHULUAN
1.1. Latar Belakang ......................................................................
1
1.2. Perumusan Masalah ..............................................................
2
1.3. Tujuan Penelitian ...................................................................
3
1.4. Hipotesis ................................................................................
3
1.5. Manfaat Penelitian ................................................................
3
BAB II TINJAUAN PUSTAKA
2.1. Gracilaria verrucosa ............................................................
4
2.1.1. Deskripsi ....................................................................
5
2.1.2. Kandungan kimia .......................................................
6
2.1.3. Manfaat Tumbuhan ....................................................
6
2.2. Ekstraksi ...............................................................................
6
2.3. Tinjauan tentang bakteri ........................................................ 12
2.3.1. Morfologi bakteri ....................................................... 12
2.3.2. Pertumbuhan bakteri .................................................. 13
x
2.4. Bakteri Uji ............................................................................. 13
2.5. Antibakteri ............................................................................ 21
2.5.1. Mekanisme kerja antibakteri ...................................... 21
2.5.2. Penentuan Aktivitas Antibakteri ................................ 23
2.6 Antibakteri Pembanding ....................................................... 25
2.7 Kerangka Konsep .................................................................. 27
BAB III METODE PENELITIAN
3.1. Tempat dan waktu penelitian ................................................ 28
3.2. Alat dan bahan ..................................................................... 28
3.3. Prosedur Kerja ....................................................................... 29
3.3.1. Persiapan Bahan Untuk Ekstraksi ............................... 29
3.3.2. Ekstraksi dengan Pelarut Organik ............................... 30
3.3.3. Pemeriksaan Karakteristik Ekstrak ............................. 30
3.3.4. Penapisan Fitokimia ................................................... 31
3.3.5. Sterilisasi Alat dan Bahan .......................................... 34
3.3.6. Pembuatan Media Pertumbuhan ................................ 34
3.3.7. Pembuatan Stok Bakteri ............................................. 35
3.3.8. Pembuatan Suspensi Bakteri ...................................... 35
3.3.9. Pembuatan Larutan Uji .............................................. 35
3.3.10. Pengujian Aktivitas Antibakteri ............................... 36
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Hasil........................................................................................ 37
4.1.1 Determinasi Sampel ..................................................... 37
4.1.2 Penapisan Fitokimia ..................................................... 37
xi
4.1.3 Pembuatan Ekstrak ....................................................... 38
4.1.4 Uji Aktivitas Antibakteri .............................................. 38
4.2 Pembahasan ........................................................................... 39
BAB V KESIMPULAN
5.1 Kesimpulan ............................................................................ 43
5.2 Saran ....................................................................................... 43
Daftar Pustaka .... .............................................................................. 44
Lampiran
..... .............................................................................. 50
xii
DAFTAR GAMBAR
Gambar 1. Gracilaria verrucosa ....................................................... 47
Gambar 2. Ekstrak Gracilaria verrucosa.......................................... 47
Gambar 3. Hasil Penapisan fitokimia ............................................... 48
Gambar 4. Staphylococcus aureus .................................................... 50
Gambar 5. Bacillus subtilis ............................................................... 50
Gambar 6. Streptococcus pneumoniae .............................................. 50
Gambar 7. Proteus mirabillis ............................................................ 51
Gambar 8. Escherichia coli ............................................................... 51
Gambar 9. Psudomonas Aeruginosa ................................................. 51
xiii
DAFTAR TABEL
Tabel 1. Karakteristik ekstrak dan uji penapisan fitokimia............... 35
Tabel 2. Hasil uji aktivitas antibakteri ............................................. 36
xiv
BAB I
PENDAHULUAN
1.1. Latar Belakang
Penyakit infeksi atau penyakit yang disebabkan oleh mikroorganisme
merupakan penyakit yang banyak ditemukan dalam masyarakat. Menurut laporan
WHO penyakit infeksi ini menjadi penyebab kematian terbesar pada anak-anak dan
dewasa dengan jumlah kematian lebih dari 13 juta jiwa setiap tahun, menempati
urutan kedua (25%) setelah kardiovaskular (31%) dari 53,9 juta kasus penyebab
kematian di dunia dan menjadi penyebab kematian utama pada anak dibawah umur
4 tahun (WHO 1999).
Infeksi dapat diobati dengan menggunakan antibiotik. Antibiotik adalah
senyawa kimia yang dihasilkan oleh fungi dan bakteri tanah, yang memiliki khasiat
mematikan atau menghambat pertumbuhan kuman, sedangkan toksisitasnya bagi
manusia relatif kecil. Akan tetapi penggunaan antibiotik secara besar-besaran untuk
terapi dan profilaksis adalah faktor utama terjadinya resistensi (Tjay et al., 2002).
Oleh karena itu perlu dicari alternatif pengobatan infeksi di samping menggunakan
antibiotik yaitu dengan pemanfaatan obat - obat dari bahan alam.
Ganggang adalah sumber bahan alam yang berpotensial untuk dikembangkan
di bidang farmasi (Soegiarto, 1978). Berdasarkan penelitian terdahulu diketahui
bahwa ganggang merah mengandung senyawa seperti karagenan sebagai antivirus
(Neushul, 1990), kainic acid sebagai antihelminthik (Nadler, 1979), aglutinin
1
2
sebagai antijamur (Melo et al.,2006) serta bromophenol sebagai antibakteri (Xu et
al,.2002).
Rhodophyceae merupakan jenis rumput laut yang mempunyai nilai ekonomis
penting karena dari famili ini dapat menghasilkan karagenan dan agarosa. Selain itu
studi tentang aktivitas antibakteri pada ganggang merah telah banyak dilakukan.
Contohnya pada Cystoclonium purpureum dimana diketahui bahwa C. purpureum
mengandung α-carotene, trans-phytol, ubiquinol-9, lutein, dan fucoxantine (Findlay,
1985) yang merupakan asam lemak yang berperan sebagai antibakteri. Selain itu,
studi aktivitas antibakteri pada ganggang merah Gracilaria verrucosa telah diteliti
memiliki aktivitas antibakteri terhadap Pseudomonas syringae pada fase etil asetat
(Kumar et al.,2008).
Ganggang merah G. verrucosa telah diketahui mengandung asam lemak jenuh
dan tak jenuh (Khotimchenko, 2005), steroid (Idler, 1968), prostaglandin
(Nevshupova, 1999), glikolipid (Son, 1990), polisakarida (Sasikumar et al.,1999),
hemaglutinin (Kakita, Kamishima 1997, 1999), kolesterol, glukosida, (Aydogmus,
2008), juga fenolik (Lidya, 2008).
Berdasarkan permasalahan diatas, maka dilakukan penelitian aktivitas
antibakteri ekstrak metanol dari G. verrucosa terhadap 3 bakteri patogen gram positif
(Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Streptococcus pneumoniae) dan 3 bakteri
gram negatif (Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Proteus mirabillis)
dengan menggunakan amoksisilin sebagai antibiotik pembanding.
3
1.2.Perumusan Masalah
Apakah ekstrak metanol G. verrucosa memiliki potensi sebagai
antibakteri dengan penghambatan terhadap pertumbuhan bakteri gram positif
(Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Streptococcus pneumoniae) dan
gram negatif (Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Proteus mirabillis)
?
1.3 Hipotesis
Ekstrak metanol G. verrucosa mempunyai aktivitas antibakteri
terhadap beberapa bakteri gram positif (Staphylococcus aureus, Bacillus
subtilis, Streptococcus pneumoniae) dan gram negatif (Escherichia coli,
Pseudomonas aeruginosa, Proteus mirabillis).
1.4 Tujuan Penelitian
Menguji aktivitas antibakteri ekstrak metanol G. verrucosa terhadap
beberapa bakteri gram positif (Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis,
Streptococcus
pneumoniae)
dan
gram
negatif
(Escherichia
coli,
Pseudomonas aeruginosa, Proteus mirabillis).
1.5 Manfaat Penelitian
Manfaat dari penelitian ini adalah untuk memperoleh informasi ilmiah
mengenai aktivitas antibakteri ekstrak metanol G. verrucosa terhadap beberapa
bakteri patogen dalam rangka pemanfaatannya sebagai obat alternatif pengganti
terapi antibiotik dalam pengobatan penyakit infeksi bakteri.
BAB I I
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Gracilaria verrucosa
Berdasarkan ilmu taksonomi, klasifikasi ganggang merah Gracilaria
verucossa adalah sebagai berikut :
Dunia : plantae
Filum : Rhodophyta
Kelas : Rhodophyceae
Bangsa : Gigartinales
Suku : Gracilariaceae
Marga : Gracilaria
Jenis : Gracilaria verrucosa (HUDSON)
4
5
2.1.1 Deskripsi
Nama lokal dari G. verrucosa adalah bulung rambut (Bali) dan sango-sango
(Sulawesi). Tumbuhan ini memiliki ciri-ciri thallus silindris, halus, licin, pinggir
bergerigi, membentuk rumpun radial seperti umbi tanaman jahe, percabangan
berseling tidak beraturan dan memusat kearah pangkal. Ukuran thalus panjang 25cm
dan diameter thalus 0,5 - 1,5mm. Tumbuh melekat pada substrat batu, umumnya di
daerah terumbu karang. Di perairan laut, Gracilaria hidup di daerah litoral dan
sublitoral sampai kedalam tertentu yang masih dapat ditembus oleh cahaya matahari.
Beberapa jenis hidup di perairan keruh, sungai atau tempat yang sering terjadi
pengadukan yang tinggi akibat pencampuran air tawar dan air laut (Suhardimansyah,
2004).
Pertumbuhan maksimum Gracilaria diperoleh pada kisaran salinitas 15-38
ppt, sedangkan kisaran salinitas optimum berkisar 15-24ppt. Suhu air yang baik
untuk pertumbuhan Gracilaria antara 20-28 oC. Dengan kisaran pH 6-9 dan
kedalaman air antara 0,5-1,0 m. Untuk menunjang pertumbuhannya, Gracilaria
melakukan fotosintesis maka diperlukan ketersediaan unsur hara dalam perairan.
Unsur hara tersebut akan masuk ke dalam tubuh melalui proses difusi sehingga akan
meningkatkan laju pertumbuhan (Anggadiredja et al ,2006 ; Aslan,1998).
Ciri – ciri umum ganggang merah jenis G. verrucosa antara lain thalli
tersusun oleh jaringan yang kuat dengan cartiloginous, warna merah ungu, kelabu
kehijau-hijauan, bercabang-cabang mencapai tinggi 1 sampai 3 dm. Garis tengah
cabang berkisar antara 0,5 sampai 2,0 mm. Tipe percabangan alternate, kadang-
6
kadang hampir dichotomous dengan perulangan lateral. Bentuk cabang silindris dah
meruncing diujung cabang (Soegiarto et al.,1978).
2.1.3. Kandungan Kimia
Ganggang merah G. verrucosa telah diketahui mengandung asam
lemak
seperti
digalactosyldiacylglycerides,
phosphatidyl
cholines
(PC),
monogalactosyl diacylglyderides (MGDG), dan sulfoquinovosyldiacylglycerides
(Khotimchenko, 2005), cholesterol (Doyle & Patterson, 1972), prostaglandin seperti
PGA2, PGE2, PGF2, dan 15-keto-PGE2 (Nevshupova, 1999., Imbs et al.,2001),
polisakarida (Sasikumar, Rao, & Rengasamy, 1999) glikolipid seperti 1,2-diacyl-3O-[α-D-galactopyranosyl-(1″
palmitate-oleate-arachidonate
→
6′)-O-β-D-galactopyranosyl]
5:1:4)
dan
1,2-diacyl-3-O-
glycerol
(acyl:
(6′-sulpho-α-D-
quinovopyranosyl) glycerol (acyl: myristate-palmitate-arachidonate 4:15:1) (Son,
1990), hemagglutinin seperti H-GVH dan L-GVH (Kakita, Kamishima, 1997,1999),
glukosida
seperti
(24R)-5α-stigmast-9-(11)-en-3α-D-glucopyranoside
dan
palmitoleic acid (Aydogmus, 2008 ) juga fenolik (Lydia, 2008).
2.1.4. Manfaat tumbuhan
Di Indonesia rhodophyceae merupakan jenis ganggang yang mempunyai
nilai ekonomis penting karena dari kelompok ini dapat menghasilkan karaginan dan
agarosa. G.verrucosa biasa dijadikan sebagai bahan makanan seperti bahan dasar
pembuatan nori.
7
2.2 Ekstraksi
Ekstraksi adalah proses penarikan komponen/zat aktif suatu simplisia
dengan menggunakan pelarut tertentu. Pemikiran metode ekstraksi senyawa
bukan atom dipergunakan oleh beberapa faktor, yaitu sifat jaringan tanaman,
sifat kandungan zat aktif serta kelarutan dalam pelarut yang digunakan. Prinsip
ekstraksi adalah melarutkan senyawa polar dalam pelarut polar dan senyawa non
polar dalam senyawa non polar. Secara umum ekstraksi dilakukan secara
berturut-turut mulai dengan pelarut non polar (n-heksan) lalu pelarut yang
kepolarannya menengah (diklor metan atau etil asetat) kemudian pelarut yang
bersifat polar (metanol atau etanol).
Ekstraksi digolongkan ke dalam dua bagian besar berdasarkan bentuk
fase yang diekstraksi yaitu ekstraksi cair-cair dan ekstraksi cair padat, ekstraksi
cair padat terdiri dari beberapa cara yaitu maserasi, perkolasi dan ekstraksi
sinambung.
Metode ekstraksi dapat dibedakan menjadi Infundasi, Maserasi, Perkolasi
dan Penyarian berkesinambungan. Dari keempat cara tersebut sering dilakukan
modifikasi untuk memperoleh hasil yang baik (Hargono, 1986)
1. Infundasi
Infus adalah sediaan cair yang dibuat dengan menyari simplisia
dengan air pada suhu 90ºC selama 15 menit.
Infundasi adalah proses penyarian yang umumnya digunakan untuk
menyari zat kandungan aktif yang larut dalam air dari bahan-bahan nabati.
Penyarian dengan cara ini menghasilkan sari yang tidak stabil dan mudah
tercemar oleh kuman dan kapang. Oleh sebab itu sari yang diperoleh dengan
8
cara ini tidak boleh disimpan lebih dari 24 jam. Cara ini sangat sederhana dan
sering digunakan oleh perusahaan obat tradisional. Dengan beberapa
modifikasi, cara ini sering digunakan untuk membuat ekstrak.
2. Maserasi
Maserasi merupakan cara penyarian yang sederhana. Maserasi
dilakukan dengan cara merendam serbuk simplisia dalam cairan penyari.
Maserasi digunakan untuk penyarian simplisia yang mengandung zat aktif
yang mudah larut dalam cairan penyari, tidak mengandung zat yang mudah
mengembang dalam cairan penyari, tidak mengandung benzoin, stirak dan
lain-lain.
Cairan penyari yang digunakan dapat berupa air, etanol, air-etanol
atau pelarut lain. Bila cairan penyari digunakan air maka untuk mencegah
timbulnya kapang, dapat ditambahkan bahan pengawet, yang diberikan pada
awal penyarian.
Keuntungan cara penyarian dengan maserasi adalah cara pengerjaan
dan peralatan yang digunakan sederhana dan mudah diusahakan. Kerugian
cara maserasi adalah pengerjaannya lama dan penyariannya kurang
sempurna.
Maserasi dapat dilakukan modifikasi, misalnya :
a. Digesti
Digesti adalah cara maserasi dengan menggunakan pemanasan lemah,
yaitu pada suhu 40-50oC. Cara maserasi ini hanya dapat dilakukan untuk
simplisia yang zat aktifnya tahan terhadap pemanasan.
9
b. Maserasi dengan mesin pengaduk
Penggunaan mesin pengaduk yang berputar terus menerus, waktu
proses maserasi dapat dipersingkat menjadi 6 sampai 24 jam.
c. Remaserasi
Cairan penyari dibagi dua. Seluruh serbuk simplisia dimaserasi
dengan cairan penyari pertama, sesudah dienap tuangkan dan diperas,
ampas dimaserasi lagi dengan cairan penyari yang kedua.
d. Maserasi Melingkar
Maserasi dapat diperbaiki dengan mengusahakan agar cairan penyari
selalu bergerak dan menyebar. Dengan cara ini penyari selalu mengalir
kembali secara berkesinambungan melalui serbuk simplisia dan
melarutkan zat aktifnya.
e. Maserasi Melingkar Bertingkat
Pada maserasi melingkar penyarian tidak dapat dilaksanakan secara
sempurna, karena pemindahan massa akan berhenti bila keseimbangan
telah terjadi. Masalah ini dapat diatasi dengan maserasi melingkar
bertingkat (M.M.B.).
3. Perkolasi
Perkolasi adalah cara penyarian yang dilakukan dengan mengalirkan
cairan penyari melalui serbuk simplisia yang telah dibasahi.
Prinsip perkolasi adalah sebagai berikut:
Serbuk simplisia ditempatkan dalam suatu bejana silinder, yang
bagian bawahnya diberi sekat berpori. Cairan penyari dialirkan dari atas ke
10
bawah melalui serbuk tersebut, cairan penyari akan melarutkan zat aktif selsel yang akan dilalui sampai mencapai keadaan jenuh. Gerak ke bawah
disebabkan oleh kekuatan gaya beratnya sendiri dan cairan diatasnya,
dikurangi dengan daya kapiler yang cenderung untuk menahan.
Kekuatan yang berperan pada perkolasi antara lain: gaya berat,
kekentalan, daya larut, tegangan permukaan, difusi, osmosa, adhesi, daya
kapiler dan daya geseran (friksi).
Perkolasi dapat dilakukan modifikasi, misalnya :
a. Reperkolasi
Untuk menghindari kehilangan minyak atsiri pada pembuatan sari,
maka cara perkolasi diganti dengan cara reperkolasi. Pada perkolasi
dilakukan pemekatan sari dengan pemanasan. Pada reperkolasi tidak
dilakukan pemekatan. Reperkolasi dilakukan dengan cara : simplisia
dibagi dalam beberapa perkolator, hasil perkolator pertama dipisahkan
menjadi perkolat I dan sari selanjutnya disebut susulan II. Susulan II
digunakan untuk menyari perkolator II. Hasil perkolator kedua
dipisahkan menjadi perkolat II dan sari selanjutnya disebut susulan II.
Pekerjaan tersebut diulang sampai mendapat perkolat yang diinginkan.
b. Perkolasi Bertingkat
Digunakan untuk memperbaiki cara perkolasi bila diperoleh perkolat
yang encer. Serbuk simplisia yang hampir tersari sempurna, sebelum
dibuang, disari dengan cairan penyari yang baru. Penyarian akhir serbuk
11
simplisia dengan menggunakan cairan penyari yang baru, diharapkan
agar serbuk simplisia tersebut dapat tersari sempurna.
4. Penyarian Berkesinambungan
a. Sokhletasi
Sokhletasi
merupakan
metoda
ekstraksi
cara
panas
yang
menggunakan alat sokhlet, pada keadaan ini sample dan pelarut berada
dalam keadaan terpisah. Pengekstrak sokhlet hanya diperlukan untuk
mendapatkan senyawa yang tidak terbatas pada kelarutan pada pelarut
dan pengotor yang tidak larut pada pelarut yang digunakan. Jika
menginginkan senyawa yang mempunyai kelarutan yang tinggi dalam
pelarut kemudian filtrasi dapat digunakan untuk memisahkan senyawa
dari zat yang tidak larut.
Keuntungan :
1. Cairan penyari yang diperlukan lebih sedikit, dan secara langsung
diperoleh hasil yang lebih tepat.
2. Serbuk simplisia disari oleh cairan penyari yang murni, sehingga
dapat menyari zat aktif lebih banyak.
3. Penyarian dapat diteruskan sesuai dengan keperluan, tanpa
menambah volume cairan penyari.
Kerugian :
1. Larutan dipanaskan terus menerus, sehingga zat aktif yang tidak
tahan pemanasan tidak cocok. Ini dapat diperbaiki dengan
menambahkan peralatan untuk mengurangi tekanan udara.
12
2. Cairan penyari dididihkan terus menerus, sehingga cairan penyari
yang baik harus murni atau cairan azeotrop.
b. Destilasi uap
Destilasi uap dapat dipertimbangkan untuk menyari serbuk
simplisia yang mengandung komponen yang mempunyai titik didih
tinggi
pada
tekanan
udara
normal.
Pada
pemanasan
biasa
kemungkinan akan terjadi kerusakan zat aktifnya. Untuk mencegah
hal tersebut maka penyarian dilakukan dengan destilasi uap.
Dengan adanya uap air yang masuk, maka tekanan
kesetimbangan uap zat kandungan akan diturunkan menjadi sama
dengan tekanan bagian di dalam suatu sistem, sehingga produk akan
terdestilasi dan terbawa oleh uap air yang mengalir. Destilasi uap
bukan semata-mata suatu proses penguapan pada titik didihnya, tetapi
suatu proses perpindahan masa ke suatu media yang bergerak. Uap
jenuh akan membasahi permukaan bahan, melunakkan jaringan dan
menembus ke dalam melalui dinding sel, dan zat aktif akan pindah ke
rongga uap air yang aktif dan selanjutnya akan pindah ke rongga uap
yang bergerak melalui antar fase. Proses ini disebut hidrodifusi.
2.3.Tinjauan Tentang Bakteri
2.3.1. Morfologi Bakteri
Bakteri termasuk dalam golongan prokariota, yang strukturnya lebih
sederhana dari eukariota, kecuali bahwa struktur dinding sel prokariota lebih
komplek dari eukariota. Morfologi bakteri dapat dibagi dalam tiga bentuk
13
utama, yaitu kokus, batang dan spiral. Dengan diameter umumnya 1 – 10 µm.
bakteri yang patogen pada manusia biasanya tumbuh dengan baik pada 37 0C
(Staf Pengajar FKUI, 1993).
2.3.2. Pertumbuhan Bakteri
Istilah
pertambahan
umum
digunakan
untuk
bakteri
dan
mikroorganisme lain dan biasanya mengacu pada perubahan dalam jumlah
sel (pertambahan total massa sel) dan bukan perubahan individu organisme.
Inokulum hampir selalu mengandung ribuan organisme, pertumbuhan
menyatakan pertambahan jumlah dan atau massa melebihi yang ada di
inokulum asalnya. Selama fase pertumbuhan seimbang (balanced gowth),
pertambahan massa bakteri berbanding lurus (proporsional) dengan
pertambahan komponen selular yang lain seperti DNA, RNA dan protein
(Pelczer et al., 1998)
Mikroorganisme sering tumbuh dan bereproduksi ketika mineral dan
sumber energi, karbon, nitrogen, phosphor, dan sulpur disuplai serta kondisi
lingkungan yang mendukung (Prescott et al., 2002).
2.4. Bakteri Uji
1. Staphylococcus aureus
Taksonomi :
Domain: Bacteria
Kerajaan: Eubacteria
14
Filum: Firmicutes
Kelas: Bacilli
Ordo: Bacillales
Famili: Staphylococcaceae
Genus: Staphylococcus
Spesies: S. aureus
Nama binomial : Staphylococcus aureus (Rosenbach 1884)
Staphylococcus aureus merupakan bakteri yang sering ditemukan
sebagai flora normal pada kulit dan selaput lendir manusia. S. aureus
merupakan salah satu bakteri Gram Positif berbentuk bulat yang hidup
dalam saluran saluran pengeluaran lendir dari tubuh manusia dan hewan
seperti hidung, mulut dan tenggorokan dan dapat dikeluarkan pada waktu
bersin atau batuk.
Bakteri ini berbentuk sferis, menggerombol dengan susunan yang
tidak teratur dengan diameter 0,8-1,0 µm.
Jenis-jenis Staphylococcus aureus di laboratorium tumbuh dengan
baik dalam kaldu biasa pada suhu 37
0
C. Batas- batas untuk
pertumbuhannya ialah 15 0C dan 40 0C. Dengan pertumbuhan optimum 35
0
C dan suasana aerob. Koloninya berbentuk bulat, diameter 1-22mm,
15
cembung buram, mengkilat dan konsistensinya lunak. Warna khas ialah
kuning keemasan (Staf Pengajar FKUI. 1993).
2. Bacillus subtilis
Taksonomi :
Kingdom: Bacteria
Phylum: Firmicutes
Class: Bacilli
Order: Bacillales
Family: Bacillaceae
Genus: Bacillus
Species: B. subtilis
Binomial name : Bacillus subtilis (Frankland & Frankland 1887)
Menurut
Buchanan
dan
Gibbons
(1974)
dalam
Bergey’s
of
Determinative Bacteriology, B. subtilis termasuk genera Bacillus,
organisme basil tunggal, berbentuk batang pendek (rod) biasanya dalam
bentuk rantai panjang. Umumnya mempunyai ukuran lebar 1,0 µm – 1,2
µm dan panjang 3 µm – 5µm , Gram positif , aerob, suhu pertumbujan
maksimum 37 - 480C dan minimum 5 – 200C dan pH pertumbuhan 5,5 –
8,5. B.subtilis bersifat kosmopolit, suhu pertumbuhan optimum 300C. B.
16
subtilis merupakan saprofit ringan yang tidak berbahaya yang lazim
terdapat dalam tanah, air, udara dan tumbuh-tumbuhan sernamampu
membentuk endospora yang tahan panas (Jawetz et al. 1996).
3. Streptococcus pneumoniae
Taksonomi :
Domain: Bacteria
Phylum: Firmicutes
Class: Cocci
Order: Lactobacillales
Family: Streptococcaceae
Genus: Streptococcus
Species: S. pneumoniae
Binomial name : Streptococcus pneumonia (Klein 1884)
Streptococcus pneumoniae adalah sel gram positif berbentuk bulat
telur atau seperti bola yang dapat menyebabkan berbagai macam penyakit
salah satunya adalah pneumonia. Pengobatan pneumonia dapat dilakukan
dengan memberikan antibiotic penisilin G atau V atau oral, sedang yang
tidak kuat diberi sefalosporin.
17
Streptococcus pneumoniae adalah sel gram positif berbentuk bulat
telur atau seperti bola, secara khas terdapat berpasangan atau rantai
pendek. Bagian ujung belakang tiap pasangan sel secara khas berbentuk
tombak (runcing tumpul), tidak membentuk spora dan tidak bergerak
tetapi galur yang ganas berkapsul, menghasilkan α-hemolisis pada agar
darah dan akan terlisis oleh garam empedu dan deterjen (Jawetz et al.
1996).
4. Escherichia coli
Taksonomi :
Domain: Bacteria
Filum: Proteobacteria
Kelas: Gammaproteobacteria
Ordo: Enterobacteriales
Famili: Enterobacteriaceae
Genus: Escherichia
Spesies: E. coli
Nama binomial : Escherichia coli (Migula 1895)
Bakteri Escherichia coli merupakan bakteri enterik yang berbentuk
batang pendek dengan ukuran 0,5 µm x 3,0 µm negatif Gram, tidak
18
berspora, gerak positif dengan flagel peritrikh. Koloni bakteri umumnya
basah, halus, keabu-abuan, permukaannya licin. Hemolisis tipe beta. Pada
perbenihan cair tumbuh secara difusi. Jenis perbenihan yang dipakai untuk
isolasi bakteri enterik adalah diferensial, selektif dan persemaian.
Escherichia coli adalah bakteri oportunitis yang banyak ditemukan
didalam usus besar manusia sebagai flora normal. Bakteri ini dapat
menyebabkan infeksi primer pada usus misalnya diare pada anak dan
travelersdiarrhea, dan juga dapat menimbulkan infeksi pada jaringan
tubuh lain diluar usus (Staf Pengajar FKUI, 1993).
5. Pseudomonas aeruginosa
Taksonomi :
Kerajaan: Bacteria
Filum: Proteobacteria
Kelas: Gamma Proteobacteria
Ordo: Pseudomonadales
Famili: Pseudomonadaceae
Genus: Pseudomonas
Spesies: Pseudomonas aeruginosa
19
Pseudomonas aeruginosa berbentuk batang dengan ukuran sekitar
0,6 x 2 µm. Bakteri ini terlihat sebagai bakteri tunggal, berpasangan, dan
terkadang membentuk rantai yang pendek. P. aeruginosa termasuk bakteri
gram negatif. Bakteri ini bersifat aerob, katalase positif, oksidase positif,
tidak
mampu
memfermentasi
tetapi
dapat
mengoksidasi
glukosa/karbohidrat lain, tidakberspora, tidak mempunyai selubung (sheat)
dan mempunyai flagel monotrika (flagel tunggal pada kutub) sehingga
selalu bergerak.
Bakteri ini dapat tumbuh di air suling dan akan tumbuh dengan baik
dengan adanya unsur N dan C. Suhu optimum untuk pertumbuhan P.
aeruginosa adalah 42oC.
P.aeruginosa mudah tumbuh pada berbagai
media pembiakan karena kebutuhan nutrisinya sangat sederhana. Di
laboratorium, medium paling sederhana untuk pertumbuhannya digunakan
asetat (untuk karbon) dan ammonium sulfat (untuk nitrogen) (Jawetz,
1996).
6. Proteus mirabilis
Taksonomi:
Kingdom: Bacteria
Phylum: Proteobacteria
Class: Gamma Proteobacteria
20
Order: Enterobacteriales
Family: Enterobacteriaceae
Genus: Proteus
Species: P. mirabilis
Binomial name : Proteus mirabilis (Hauser, 1885)
Setelah tumbuh selama 24-48 jam pada media padat, kebanyakan sel
seperti tongkat, panjang 1-3 m dan lebar 0,4-0,6 m, walaupun pendek
dan gemuk bentuknya kokus biasa. Dalam kultur muda yang
mengerumun di media padat, kebanyakan sel panjang, bengkok, dan
seperti filamen, mencapai 10, 20, bahkan sampai panjang 80 m. dalam
kultur dewasa, organisme ini tidak memiliki pengaturan karakteristik :
mereka mungkin terdistribusi tunggal, berpasangan atau rantai pendek.
Akan tetapi, dalam kultur muda yang mengerumun, sel-sel filamen
membentang dan diatur konsentris seperti isobar dalam diagram angin
puyuh. Kecuali untuk varian tidak berflagella dan flagella yang
melumpuhkan, semua jenis dalam kultur muda aktif bergerak dengan
flagella peritrik. Flagella tersebut terdapat dalam bnayak bentuk
dibanding
kebanyakan
enterobakter
lain,
normal
dan
bentuk
bergelombang kadang-kadang ditemukan bersama dalam organisme sama
dan bahkan dalam flagellum yang sama. Bentuk flagellum juga
dipengaruhi pH media.
21
2.5 Antibakteri
Antimikroba adalah senyawa kimia yang dapat membunuh atau
menghambat pertumbuhan mikroorganisme. Berdasarkan jenis mikroorganisme
yang dimatikan atau dihambat pertumbuhannya, antimikroba terbagi menjadi
antibakteri, antifungi, antivirus, dan protozoa.
Antibakteri adalah zat yang membunuh bakteri atau menekan
pertumbuhan dan reproduksi mereka. Obat yang digunakan untuk membasmi
mikroba penyebab infeksi manusia, ditentukan harus memiliki sifat toksisitas
selektif setinggi mungkin. Berdasarkan toksisitas selektif, ada antimikroba yang
bersifat
menghambat
pertumbuhan
mikroba
dikenal
sebagai
aktivitas
bakteriostatik, dan ada yang bersifat membunuh mikroba, dikenal sebagai
aktivitas bakterisid. Kadar minimal yang diperlukan untuk menghambat
pertumbuhan mikroba atau membunuhnya, masing-masing dikenal sebagai kadar
hambat minimal (KHM) dan kadar bunuh minimal (KBM). Antimikroba tertentu
dapat meningkat aktivitasnya dari bakteriostatik menjadi bakterisid bila kadar
antimikrobanya ditingkatkan melebihi KHM. (Ganiswara dkk,1995).
2.5.1 Mekanisme Kerja Antimikroba (Jawetz, 1996; Pratiwi, 2008)
Antimikroba berdasarkan struktur kimia dan mekanisme aksi dikelompokan
menjadi :
b. Agen yang menghambat sintesis dinding sel bakteri. Antimikroba ini
merusak lapisan peptidoglikan yang menyusun dinding sel bakteri gram
positif maupun gram negatif. Mekanisme kerjanya adalah dengan mencegah
22
ikatan silang peptidoglikan pada tahap akhir sintesis dinding sel, yaitu dengan
cara menghambat protein pengikat penisilin (penicillin binding protein),
protein ini merupakan enzim damlam membrane plasma bakteri yang secara
normal terlibat dalam penambahan asam amino yang berikatan silang dengan
peptidoglikan dinding sel bakteri dinding sel bakteri. Termasuk didalamnya
golongan β-laktam (misalnya, penisilin).
c. Agen
yang
bekerja
langsung
membran
plasma
mikroorganisme,
meningkatkan permeabilitas dan menyebabkan kebocoran sel intraselular.
Membran plasma bersifat semipermiabel dan mengendalikan transport
berbagai metabolit kedalam dan luar sel. Adanya gangguan atau kerusakan
struktur pada membran plasma sebagai penghalang (barrier) osmosis dan
mengganggu sejumlah proses biosintesis yang diperlukan dalam membran.
Termasuk didalamnya detergen seperti polymyxin; polyene agen antijamur
(misalnya, nistatin dan amfoterisin B) yang mengikat dinding sterol; dan
lipopeptide daptomycin;
d. Agen yang mengganggu fungsi ribosom subunit 30S atau 50S secara
reversible menghambat sintesis protein, yang umumnya adalah bakteriostatik
(misalnya,
kloramfenikol,
amoksisilin,
eritromosin,
klindamisin,
streptogramis, dan linezolid) dan bakterisidal(misalnya aminoglikosida);
e. Agen
yang
mempengaruhi
metabolisme
asam
nukleat
bakteri.
Penghambatannya pada sintesis asam nukleat berupa penghambatan terhadap
transkripsi asam nukleat dan replikasi mikroorganisme, seperti rifamycins
(misalnya, ripamfisin dan rifabutin) yang menghambat RNA polymerase dan
quinolon yang menghambat topoisomerase; dan
23
f. Antimetabolit, yaitu substansi yang secara kompetitif menghambat metabolit
mikroorganisme, karena memiliki struktur yang mirip dengan substrat normal
bagi enzim metabolism. Termasuk didalamnya trimetoprim dan sulfonamide,
yang menghambat enzim penting metabolism folat.
2.5.2 Penentuan Aktifitas Antimikroba
Potensi dari suatu antimikroba diperkirakan dengan membandingkan
penghambatan pertumbuhan terhadap mikroorganisme yang sensitif dari hasil
penghambatan suatu konsentrasi antibiotic uji dibandingkan dengan antibiotik
refrensi. Bahan refrensi yang digunakan dalam pengujian adalah zat yang
aktivitasnya terlah diketahui dengan mengacu pada Standar Internasional yang
telah sesuai (Anonim, 2001).
Penentuan aktivitas antimikroba dapat dilakukan dengan dua metode,
yaitu metode difusi dan metode dilusi. Pada metode difusi termasuk
didalamnya medote disk diffusion (tes Kirby & Baur), E-test, ditch-plate
technique, cup-plate technique. Sedangkan pada metode dilusi termasuk
didalamnya metode dilusi cair dan dilusi padat (Pratiwi, 2008).
a. Metode difusi diantaranya :
1) Metode disc diffusion (tes Kirby & Bauer) piringan yang berisi agen
antimikroba diletakkan pada media agar yang telah ditanami
mikrooorganisme yang akan berdifusi pada media agar tersebut. Area
jernih mengidikasikan adanya hambatan pertumbuhan mikroorganisme
oleh agen antimkroba pada permukaan agar.
24
2) Metode E-test digunakan untuk mengestimasi KHM (kadar hambat
minimum), yaitu konsentrasi minimal suatu agen antimikroba untuk
dapat menghambat pertubuhan mikroorganisme. Pada metode ini
digunkan strip plastic yang mengandung agen antimikroba dari kadar
terendah hingga tertinggi dan diletakkan pada permukaan media agar
yang telah ditanami mikroorganisme. Pengamatan dilakukan pada area
jernih yang ditimbulkannya yang menunjukkan kadar agen antimikroba
yang, menghambat pertumbuhan mikroorganisme pada media agar.
3) Ditch-plate technique. Pada metode ini sample uji berupa agen
antimikroba yang diletakkan
pada parit yang dibuat dengan cara
memotong media agar dalam cawan petri pada bagian tengah secara
membujur dan mikroba uji digoreskan kearah parit yang berisi agen
antimikroba.
4) Cup-plate technique. Metode ini serupa dengan metode disc diffusion,
dimana dibuat sumur pada media agar yang telah ditanami dengan
mikroorganisme dan pada sumur tersebut diberi agen antimikroba yang
akan diuji.
b. Metode dilusi diantaranya:
1) Metode dilusi cair/broth dilution test (serial dilution). Metode ini
digunakan untuk mengukur Konsentrasi Hambat Minimum (KHM) dan
Kadar Bunuh Minimum (KBM). Cara yang dilakukan adalah dengan
membuat seri pengenceran agen antimikroba pada medium cair yang
ditambahkan dengan mikroba uji. Larutan agen mikroba pada kadar
terkecil yang terlihat jernih tanpa adanya pertumbuhan mikroba uji
25
ditetapkan sebagai KHM. Larutan yang ditetapkan sebagai KHM tersebut
selanjutnya dikultur ulang pada media cair tanpa penambahan mikroba uji
ataupun antimikroba, dan diinkubasi selama 18-24 jam. Media cair yang
ditetapkan terlihat jernih setelah diinkubasi ditetapkan sebagai KBM.
2) Metode dilusi padat (solid dilution test). Metode ini serupa dengan
metode dilusi cair namun menggunakan media padat (solid). Keuntungan
metode ini adalah satu konsentrasi agen antimikroba yang diuji dapat
digunakan untuk menguji beberapa mikroba uji.
2.6
Antibakteri Pembanding (Farmakope Indonesia, 1995)
Karakteristik amoksisilin yang digunakan sebagai antibakteri pembanding
adalah sebagai berikut:
1. Rumus Bangun
:
2. Rumus Kimia
: C16H19N3OS
3. Nama Lain
: (2S,5R,6R)- 6-{[(2R)-2-amino- 2-(4-hydroxyphenyl)-
acetyl]amino}- 3,3-dimethyl- 7-oxo- 4-thia- 1-azabicyclo[3.2.0]heptane2-carboxylic acid
4. Pemerian
: serbuk hablur, kuning, tidak berbau.
5. Kelarutan
: sukar larut dalam air; mudah larut dalam larutan asam
encer dan dalam larutan alkali hidrosida; sukar larut dalam ethanol;
praktis tidak larut dalam kloroform dan dalam eter.
26
6. Penyimpanan
terkendali.
:Dalam wadah tertutup rapat, pada suhu kamar
27
2.7 Kerangka Konsep
Pemanfaatan ganggang secara tradisional sebagai bahan
pangan dan obat-obatan telah dilakukan oleh masyarakat
(Nontji,2002)
Penelitian terdahulu menunjukkan potensi
antibakteri dari fase etil asetat Gracilaria
verrucosa (Kumar et al, 2008).
Ekstrak Kental Gracilaria
verrucosa
Penapisan Fitokimia
Penentuan diameter hambat
Uji Aktivitas Antibakteri
Penentuan KHM dan KBM
Analisi Mekanisme Penghambatan
Antibakteri
Analisis Kebocoran Protein
dan Asam Nukleat
Analisis Kerusakan Sel
Analisis Kebocoran Ion
Logam Ca2+ dan K+
BAB III
METODE PENELITIAN
3.1 Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan dari bulan September 2011 sampai dengan Januari
2012 di Laboratorium Pharmacy Drugs Development and Reseach (PDR),
Laboratorium Mikrobiologi FKIK UIN-Jakarta.
3.2 Alat dan Bahan
a. Alat
Peralatan gelas, timbangan analitik, rotavaporator, desikator, oven, krustang,
hot plate, tabung reaksi, plat tetes, spatula, pipet, erlenmayer, gelas ukur,
tissue, jarum ose, tabung reaksi, rak tabung reaksi, tabung sentrifuse,
sentrifuse, cawan petri, shacker, gunting, vortex, autoklaf, inkubator, lampu
spritus, timbangan analitik, kertas saring whatman no.52, kapas steril,
mikropipet, lemari pendingin, spektrofotometri UV-VIS, Laminar Air Flow
(LAF).
b. Bahan
1) Bahan uji
Bahan uji yang digunakan adalah rumput laut G. verrucosa yang
didapat dari tambak di desa Tenjo Ayu Kecamatan Tirtayasa Serang –
Banten.
28
29
2) Bakteri uji
Bakteri uji yang digunakan adalah bakteri Staphylococcus aureus
ATCC 25923, Basillus
subtilis, Streptococcus pneumoniae ATCC
96924, Escherichia coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa
ATCC 27853, Proteus mirabillis
yang didapat dari Laboraturium
Mikrobiologi dan Parasitologi FKIK UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.
3) Antibakteri Pembanding
Antibakteri pembanding yang digunakan adalah amoksisilin
4) Bahan Kimia
Bahan-bahan kimia yang digunakan diantaranya: Mueller Hinton Agar
(MHA), Blood Agar Base, Nutrient Agar, Nutrient Broth, Vitamin K,
NaCl, FeCl3, metanol, alkohol, Dimetilsulfoksida (DMSO), serbuk
Mg, HCl, pereaksi dragendorff, pereaksi meyer, kloroform, natrium
sulfat anhidrat, asam asetat anhidrat, H2SO4, aquadest.
3.3 Prosedur Kerja
3.3.1
Penyiapan simplisia G. verrucosa
Bahan berupa rumput laut G. verrucosa sebanyak 35 Kg
didapat dari tambak di desa Tenjo Ayu Kecamatan Tirtayasa dalam
keadaan basah, kemudian dicuci bersih dengan air mengalir, kemudian
dibilas dengan aquadestilat. Rumput laut G. verrucosa ini kemudian
dikeringkan dengan cara diangin-anginkan pada suhu ruang dan terhindar
dari sinar matahari langsung. Simplisia kering kemudian dihaluskan
menggunakan blender sehinga diperoleh serbuk rumput laut 500 gram.
30
3.3.2
Ekstraksi dengan Pelarut Organik
Serbuk rumput laut G. verrucosa sebanyak 500 g dimaserasi
dengan menggunakan metanol selama 5 hari dengan mengganti pelarut
setiap 24 jam, kemudian disaring dengan menggunakan kapas dan kertas
saring. Tiap-tiap filtrat dipisahkan dari pelarutnya pada suhu 500C
dengan menggunakan vacuum rotary evaporator, sehingga diperoleh
ekstrak kental rumput laut G. verrucosa sebanyak 28 gram.
3.3.3
Pemeriksaan Karakteristik Ekstrak (Depkes RI, 2000)
a. Organoleptik
Pengujian ini dilakukan dengan mengamati bentuk, warna, bau, dan
rasa dari ekstrak yang dihasilkan
b. Rendemen ekstak
Rendemen ekstrak etanol rumput laut G. verrucosa dihitung dengan
membandingkan bobot awal simplisia dengan bobot akhir ekstrak yang
dihasilkan.
% Rendemen =
Bobot ekstrak yang dihasilkan
x 100%
Bobot awal simplisia
c. Susut pengeringan
Pemeriksaan ini dilakukan dengan cara menimbang ekstrak sebanyak
±0.5g dan dimasukan kedalam botol timbang bertutup yang
sebelumnya telah ditara. Kemudian dimasukan kedalam oven pada
suhu 105 0C sehingga diperoleh bobot yang relatif tetap.
% Susut pengeringan =
b−c
x 100%
b−a
31
Keterangan :
a = bobot cawan kosong
b = bobot sampel dan cawan sebelum dikeringkan dalam oven
c = bobot sampel dan cawan setelah dikeringkan dalam oven
3.3.4
Penapisan Fitokimia
Pemerikasaan kandungan kimia dalam rumput laut (Harbone, 1984),
diantaranya:
a. Identifikasi golongan alkaloid
Sejumlah tertentu serbuk/ekstrak G. verrucosa dilembabkan dengan 5
ml ammonia 30%, digerus dalam mortir, kemudian ditambahkan 20 ml
kloroform dan digerus kembali dengan kuat, campuran tersebut disaring
dengan kertas saring, filtrat berupa larutan organik diambil (sebagai larutan
A), sebagian dari larutan A (10 ml) diekstraksi dengan 10 ml larutan HCl
1:10 dengan pengocokan dalam tabung reaaksi, ambil larutan bagian atasnya
(larutan B). larutan A diteteskan beberapa tetes pada kertas saring dan
disemprot atau ditetesi dengan pereaksi Dragendorff, terbentuk warna merah
ataupun jingga pada kertas saring menunjukan adanya senyawa alkaloid.
Larutan B dibagi dalam dua tabung reaksi, ditambahkan masing-masing
pereaksi Dragendorff dan Mayer, terbentuk endapan merah bata dengan
pereaksi Dragendorff dan endapan putih dengan pereaksi Mayer menunjukan
adanya senyawa golongan alkaloid.
32
b. Identifikasi golongan flavonoid
Sejumlah tertentu serbuk/ekstrak G. verrucosa ditambahkan 100 ml
aquadest panas, dididihkan selama 15 menit, saring dengan kertas saring,
diperoleh filtrat yang akan digunakan sebagai larutan percobaan. Kedalam 5
ml larutan percobaan ( dalam tabung reaksi ), ditambahkan serbuk atau
lempeng magnesium secukupnya dan 1 ml HCl pekat, tambahkan 5 ml
amilalkohol, dikocok dengan kuat, biarkan hingga memisah, terbentuk warna
dalam larutan amilalkohol menunjukan adanya senyawa flavonoid.
c. Identifikasi senyawa saponin
Sebanyak 10 ml larutan percobaan yang diperoleh dari percobaan
golongan flavonoid, dimasukan kedalam tabung reaksi dan dikocok secara
vertikal selama 10 detik, kemudian dibiarkan selama 10 menit, terbentuk
busa yang stabil dalam tabung reaksi menunjukan adanya senyawa golongan
saponin, bila ditambahkan 1 tetes HCl 1% (encer) busa tetap stabil.
d. Identifikasi golongan tanin
Sebanyak tertentu serbuk/ekstrak ditambahkan 100 ml aquadest,
didihkan selama 15 menit, dinginkan dan saring dengan kertas saring dan
filtrat dibagi dua bagian. Kedalam filtrat pertama ditambahkan larutan Ferri
(III) klorida 1%, terbentuk warna biru tua atau hijau kehitaman menunjukan
adanya senyawa golongan tanin. Kedalam filtrat yang kedua ditambahkan 15
ml pereaksi Stiasny (Formaldehid 30% : HCl pekat = 2:1), dipanaskan di atas
penanggas aquadest, terbentuk endapan warna merah muda menunjukan
adanya tanin katekuat. Selanjutnya endapan disaring, filtrat dijenuhkan
33
dengan natrium asetat, ditambahkan beberapa tetes larutan Ferri (III) kloridaa
1%, terbentuk warna biru tinta menujukan adanya tanin galat.
e. Identifikasi golongan steroid dan triterpenoid
Sejumlah tertentu serbuk/ekstrak G. verrucosa dimaserasi dengan 20
ml eter selama 2 jam (dalam wadah dengan penutup rapat), disaring dan
diambil filtratnya, 5 ml dari filtrat tersebut diuapkan dalam cawan penguap
hingga diperoleh residu/sisa, kedalam residu ditambahkan 2 tetes asam asetat
anhidrat dan 1 tetes asam sulfat pekat (pereaksi Libermann-Buchard),
terbentuk warna hijau atau merah menunjukan adanya senyawa golongan
steroid atau triterpenoid.
f. Identifikasi golongan kuinon
Sejumlah tertentu serbuk/ekstrak G. verrucosa ditambahkan 100 ml
air panas, dididihhkan selama 5 menit, saring. Ambil 5 ml larutan, masukkan
ke dalam tabung reaksi tambahkan beberapa tetes Natrium hidroksida 1 N,
terbentuk warna merah menunjukkan adanya senyawa golongan kuinon.
g. Identifikasi golongan minyak atsiri
Sejumlah tertentu serbuk/ekstrak G. verrucosa dimasukkan ke dalam
tabung reaksi (volume 20 ml), tambahkan 10 ml pelarut petroleum eter. Pada
mulut tabung dipasang corong yang diberi lapisan kapas yang telah dibasahi
dengan air, kemudian disaring dengan kertas saring. Filtrat yang diperoleh
diuapkan pada cawan penguap, residu yang berbau aromatik menunjukkan
adanya senyawa golongan minyak atsiri.
34
3.3.5
Sterilisasi Alat dan Bahan
Sterilisasi dilakukan dengan menggunakan autoklaf pada suhu 121 0C
selama 15-20 menit, semua alat dan bahan sebelum disterilisasi dibungkus
terlebih dahulu dengan kertas minyak. Untuk bahan yang terbuat dari karet
seperti karet pipet tetes disterilisasi dengan cara direbus. Untuk larutan uji
disterilkan dengan cara melakukan pengerjaannya di dalam laminar air flow
yang sebelumnya telah disterilisasi dengan alkohol 70 %, kemudian
disterilkan dengan lampu UV yang telah dinyalakan 15 menit sebelum
digunakan.
3.3.6
Pembuatan Media Pertumbuhan
a. Nutrient Agar
Pada pembiakan bakteri menggunakan media digunakan Nutrient agar
(NA). Serbuk NA sebanyak 23 gram dilarutkan dalam 1 liter aquadest
dan dipanaskan hingga semuanya larut. Lalu disterilkan dalam autoklaf
pada suhu 121oC selama 15 menit.
b. MHA (Mueller Hinton Agar)
Serbuk MHA sebanyak 38 gram dilarutkan dalam 1 liter aquadest,
kemudian dipanaskan sampai mendidih sehingga semuanya larut,
kemudian disterilkan dengan autoklaf pada suhu 121 0C selama 15 menit.
c. Blood Agar Base (BAB)
Serbuk blood agar base sebanyak 40 gr dilarutkan dalam 1 liter
aquadest. Kemudian disterilkan dalam autoklaf pada suhu 1210C selama
15 menit. Setelah suhu sekitar 400C ditambahkan 5% darah domba steril.
35
3.3.7
Pembuatan stok bakteri
Bakteri diinokulasi pada medium Blood Agar Base untuk
bakteri Streptococcus pneumoniae, sedangkan medium MHA untuk
Staphylococcus aureus , B. subtilis, E. coli, Pseudomonas aeruginosa,
Proteus mirabillis dengan cara menggoreskan bakteri menggunakan
jarum ose pada permukaan agar, kemudian semua biakan bakteri
diinkubasi pada suhu 37 oC selama 24 jam.
3.3.8
Pembuatan Suspensi Bakteri
Biakan bakteri yang telah berumur 24 jam diambil beberapa ose
kemudian di suspensikan kedalam larutan NaCl 0.9% dan di ukur
kekeruhannya dengan menggunakan metode turbidimetri dengan
standar 0,5 Mc Farland (diperkirakan 1,5 x 108 sel bakteri/ml).
3.3.9
Pembuatan Larutan Uji
Pada pengujian aktivitas antibakteri menggunakan metode difusi
cakram, larutan uji dibuat dengan melarutkan ekstrak metanol G.
verrucosa menggunakan metanol dengan konsentrasi ekstrak G.
verrucosa yang digunakan adalah 0,1 mg/ml, 1 mg/ml, 10 mg/ml, dan
100 mg/ml. Pada penentuan Konsentrasi Hambat Minimum dan
Konsentrasi Bunuh Minimum menggunakan metode dilusi cair.
Larutan uji dibuat dengan melarutkan ekstrak metanol G. verrucosa
dengan aquadest. Konsentrasi yang digunakan adalah 0,01 mg/ml, 0,1
mg/ml, 1 mg/ml, dan 10 mg/ml.
36
3.3.10 Pengujian Aktivitas Antibakteri (Rhimou et al, 2010).
Pengujian aktivitas antibakteri dari ekstrak metanol G. verrucosa
dilakukan dengan metode difusi menggunakan kertas cakram. Kertas
cakram yang digunakan memiliki diameter lingkaran 6 mm.
Media Blood Agar Base untuk bakteri S. pneumonia dan medium
MHA untuk bakteri Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Escherichia
coli, Pseudomonas aeruginosa, Proteus mirabillis yang masih berbentuk
cairan dimasukkan ke dalam cawan petri masing-masing sebanyak
±20ml dan dibiarkan memadat pada suhu kamar. Setelah agar memadat
suspensi bakteri sebanyak 100 µl di sebar kepermukaan agar secara
merata dengan menggunakan lidi kapas steril.
Kertas cakram steril kemudian ditetesi dengan larutan uji sebanyak 20
µl kemudian didiamkan selama 2 jam (Rhimou et al, 2010) agar
pelarutnya menguap kemudian diletakan diatas permukaan agar. Untuk
kontrol negatif kertas cakram ditetesi dengan metanol dan kontrol positif
menggunakan cakram amoksisilin pada setiap bakteri uji. Masing –
masing cawan petri kemudian diinkubasi dalam keadaan posisi terbalik
pada suhu 370C selama 24 jam. Aktivitas antibakteri diamati berdasarkan
pengukuran diameter daerah hambat atau daerah bening yang terbentuk
disekeliling kertas cakram dikurangi dengan diameter cakram. Pengujian
dilakukan 3 kali pengulangan.
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 HASIL
4.1.1
Determinasi Sampel
Dari hasil identifikasi sampel yang dilakukan di LIPI Oceanografi
diketahui
bahwa sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah
rumput laut Gracillaria verrucosa (Lampiran 1).
4.1.2
Penapisan Fitokimia
Dari proses ekstraksi yang dilakukan didapatkan karakteristik ekstrak dan
hasil penapisan fitokimia, diantaranya.
Tabel 1. Karakteristik ekstrak dan uji penapisan fitokimia
Karakteristik ekstrak
Hasil
Rendemen
3.6 %
Susut Pengeringan
0.89 %
Warna
Hijau kecoklatan
Bau
Khas
Flavonoid
Negatif (-)
Alkaloid
Negatif (-)
Saponin
Positif (+)
Tanin
Negatif (-)
Steroid dan triterpenoid
Positif (+)
Minyak atsiri
Negatif (-)
37
38
4.1.3
Pembuatan ekstrak
Hasil ekstraksi serbuk rumput laut (Gracilaria verrucosa) sebanyak 500
gram dengan pelarut metanol adalah sebanyak 28 gram ekstrak kental
dengan rendemen ekstrak sebesar 3,6%.
4.1.4
Uji Aktivitas Antibakteri
Hasil uji aktivitas antibakteri ekstrak metanol G. verrucosa pada berbagai
konsentrasi :
Tabel 2. Hasil uji aktivitas antibakteri ektrak metanol G. verrucosa
terhadap enam bakteri uji.
Diameter Zona Hambat ( mm )
Konsentrasi
Ekstrak
Rata-rata
S. aureus
B. subtilis
S. pneumoniae
E. coli P. aeruginosa
100µg/ml
-
-
-
-
-
-
1000µg/ml
-
-
-
-
-
-
10000µg/ml
-
-
-
-
-
-
100000µg/ml
-
-
-
-
-
-
Kontrol (-)
-
-
-
-
-
-
Kontrol (+)
51
40
42
28
51
Kontrol (-) : metanol
Kontrol (+) : amoksisilin
Penentuan nilai KHM dan nilai KBM dari ekstrak metanol G.
verrucosa terhadap bakteri uji tidak dilakukan karena pada uji diameter
P. mirabilis
23
39
hambat tidak ditemukan diamater hambat. Oleh karena itu, pengujian aktivitas
antibakteri seperti kebocoran protein dan asam nukleat, kebocoran ion Ca2+
dan ion K+ serta analisis kerusakan sel tidak dilakukan.
4.2 PEMBAHASAN
Sampel uji yang digunakan dalam penelitian ini diperoleh dari tambak di
Desa Tenjo Ayu Kecamatan Tirtayasa Serang – Banten. Berdasarkan hasil
determinasi yang dilakukan di Pusat Penelitian Oseanografi LIPI Jakarta,
menunjukan bahwa tanaman yang digunakan dalam penelitian ini adalah
Gracilaria verrucosa dengan famili Gracilariaceae (lampiran 1).
Serbuk simplisia G. verrucosa selanjutnya diidentifikasi dengan cara
penapisan fitokimia yang menunjukan bahwa pada sampel uji terdapat kandungan
kimia dari golongan senyawa saponin, steroid dan triterpenoid (Tabel 1). Saponin
adalah senyawa aktif yang kuat dan menimbulkan busa jika dikocok dalam air
sehingga bersifat seperti sabun dan mempunyai kemampuan antibakterial (Zuhud,
et al., 2001). Saponin dapat meningkatkan permeabilitas membran sel bakteri
sehingga dapat mengubah struktur dan fungsi membran, menyebabkan denaturasi
protein membran sehingga membran sel akan rusak dan lisis (Siswandono, 1995).
Pada penelitian ini metode ekstraksi yang digunakan adalah metode
maserasi. Metode ini dipilih karena proses pengerjaannya yang mudah, peralatan
yang digunakan sederhana, serta tidak merusak senyawa yang terkandung dalam
sampel uji. Prinsip dari metode maserasi adalah mengekstrak zat aktif dengan cara
merendam serbuk simplisia dalam larutan penyari yang sesuai pada temperatur
40
kamar. Pelarut yang digunakan dalam proses maserasi ini adalah metanol.
Pemilihan metanol sebagai pelarut dikarenakan metanol dapat melarutkan hampir
semua metabolit sekunder pada sampel uji, baik senyawa yang bersifat polar
maupun nonpolar sehingga dapat mengekstrak G. verrucosa secara optimal.
Metanol dapat digunakan sebagai kontrol pelarut pada uji aktivitas antibakteri
(Dash, et al., 2011).
Pengujian aktivitas antibakteri bertujuan untuk mengetahui sensitivitas
bakteri terhadap sampel uji. Metode pengujian aktivitas antibakteri yang
digunakan pada penelitian ini adalah metode difusi cakram. Pada metode ini
sensivitas bakteri terhadap sampel uji ditunjukan dengan terbentuknya zona
bening disekitar kertas cakram yang menandakan daerah hambatan pertumbuhan
bakteri.
Pada penelitian ini menggunakan 6 bakteri patogen yang berasal dari gram
positif dan gram negatif. Bakteri patogen yang digunakan adalah Staphylococcus
aureus, Bacillus subtilis, Streptococcus pneumoniae yang termasuk golongan
bakteri gram positif serta Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Proteus
mirabillis yang termasuk golongan bakteri gram negatif.
Pada pengujian diameter zona hambat, bakteri diinokulasikan pada media
MHB untuk bakteri Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Escherichia coli,
Pseudomonas aeruginosa, dan Proteus mirabillis, serta media agar darah untuk
bakteri Streptococcus pneumoniae selama 24 jam dengan suhu 37oC. Sebelum
diinokulasikan pada medium agar, semua bakteri uji diukur kepadatannya
menggunakan spektrofotometri dan disesuaikan dengan larutan standar McFarland
0.5. Pengukuran dilakukan pada panjang gelombang 625 nm dengan absorbansi
41
sebesar 0.08 – 0.1 A (setara dengan larutan McFarland 0.5 = 1-2 x108 cfu/ml)
(Schwable, et al., 2007).
Selanjutnya dibuat larutan uji dengan cara melarutkan ekstrak kental
dengan metanol dan dibuat konsentrasi 100, 1000, 10.000, dan 100.000 µg/ml.
Untuk kontrol negatif digunakan metanol. Sedangkan untuk kontrol positif
digunakan amoksisilin.
Pemilihan amoksisilin sebagai kontrol positif karena amoksisilin
merupakan antibiotik turunan penisilin yang mempunyai spektrum kerja luas, dan
mekanisme kerjanya menghambat sintesis dinding sel bakteri (Setiabudy, 2007).
Zona hambat yang ditunjukan oleh kontrol positif adalah sebesar 51 mm untuk
Staphylococcus aureus, 40 mm untuk Bacillus subtilis, 42 mm untuk
Streptococcus pneumoniae, 28 mm untuk Escherichia coli, 51 mm untuk
Pseudomonas aeruginosa, dan 23 mm untuk Proteus mirabillis.
Dari tabel hasil uji aktivitas antibakeri (tabel 2) pada penelitian ini dapat
dilihat bahwa ekstrak metanol G. verrucosa tidak memiliki aktivitas antibakteri
terhadap 3 bakteri gram positif (Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis,
Streptococcus pneumoniae) dan 3 bakteri gram negatif (Escherichia coli,
Pseudomonas aeruginosa, Proteus mirabillis). Hal ini dapat dilihat dari tidak
terbentuknya zona hambat pada medium agar dengan berbagai konsentrasi yang
digunakan yakni 0,1 mg/ml, 1 mg/ml, 10 mg/ml, dan 100 mg/ml. Hasil yang
berbeda ditunjukan pada penelitian sebelumnya bahwa ektrak G. verrucosa
memiliki aktivitas antibakteri terhadap Pseudomonas syringae pada fase etil asetat
(Kumar et al., 2008).
42
Perbedaan hasil yang didapat pada penelitian ini dimungkinkan karena
pada senyawa yang terdapat pada ekstrak metanol G. verrucosa yang memiliki
aktifitas antibakteri sangat kecil jumlahnya. Sedangkan pada penelitian ini, sampel
uji yang digunakan adalah crude ekstrak dari G. verrucosa yang artinya masih
terdapat banyak sekali senyawa lain yang terkandung dalam sampel uji seperti
metabolit primernya yaitu polisakarida sebesar 32.4% (Satari, 1997). Selain itu,
dikarenakan perbedaan sumber ganggang merah yang digunakan menjadi
penyebab tidak ditemukannya aktivitas antibakteri pada penelitian ini. Meskipun
pada penapisan fitokimia yang dilakukan menunjukan terdapat senyawa saponin
yang diduga dapat memberikan aktivitas antibakteri.
Melihat hasil uji aktivitas antibakteri dengan metode difusi cakram yang
tidak
menunjukan
adanya
hambatan
terhadap
3
bakteri
gram
positif
(Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Streptococcus pneumoniae) dan 3
bakteri gram negatif (Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Proteus
mirabillis), maka penentuan nilai KHM dan KBM serta pengujian mekanisme
antibakteri dari ekstrak G. verrucosa ini tidak dilanjutkan. Sehingga dapat
disimpulkan bahwa ekstrak metanol G. verrucosa tidak memiliki aktivitas
antibakteri.
BAB V
KESIMPULAN
5.1 KESIMPULAN
Ekstrak metanol Gracilaria verrucosa tidak memiliki aktivitas
antibakteri terhadap 3 bakteri gram positif (Staphylococcus aureus, Bacillus
subtilis, Streptococcus pneumoniae) dan 3 bakteri gram negatif (Escherichia
coli, Pseudomonas aeruginosa, Proteus mirabillis).
5.2 SARAN
Perlu adanya penelitian lebih lanjut tentang kandungan kimia pada
Gracilaria verrucosa yang terdapat di Indonesia sehingga dapat dicari
aktivitas biologis lainnya.
43
Daftar Pustaka
Anggadiredja, J. T., Zatnika, A., Purwoto, H. dan Istini, S. 2006. Rumput Laut.
Jakarta : Penebar Swadaya
Aslan, M. 1998. Budidaya Rumput Laut . Kanisius. Yogyakarta.
Aydogmus, Zeynep. 2008. Studies on chemical constituents of Gracilaria verrucosa.
Natural Product Research. 22, (18):1589–1596.
Buchanan, R.E. and Gibbons, N.E. 1974. Bergey’s manual of determinative bacteriol
ogy(Eighth edition), The Williams and Wilkins Co., Baltimore, pp.747 ‐ 842.
Chia, M,. Lin., Preston, J.K., Weii, C.I., 2000. Antibacterial mechanism of alyl
isothiocyanate. Journal of Food Protection.
Cox, S.D., Mann, C.M., Markham, J.L., Bell, H.C., Gustafson, J.E. 2000. The mode
of antibacterial action the essential oil of melaluea alternifolia (tea tree oil).
Journal of Application Microbiology.
Dash, BK., S Sultana, N Sultana. 2011. Antibacterial Activities of Methanol and
Acetone Extracts of Fenugreek (Trigonella foenum) and Coriander
(Coriandrum sativum). Life Sciences and Medicine Research, Volume 2011:
LSMR-27
Depkes RI. 2000. Parameter Standard Umum Ekstrak Tumbuhan Obat. Direktorat
Jendral Pengawasan Obat dan Makanan: Jakarta.
Depkes RI. 1989. Pemanfaatan Tanaman Obat, Edisi III. Jakarta: Direktorat Jendral
Pengawasan Obat dan Makanan.
44
45
Doyle, P.J., & Patterson, G.W. 1972. Sterols of some Chesapeake Bay algae.
Comparative Biochemistry and Physiology. Part B, Biochemistry &
Molecular biology, 41: 355–358.
Findly, John A., Ashok D. Patil. 1986. Antibacterial constituents of the red alga
cystoclonium purpureum. Phytochemistry 25(2). pp. 548-550.
Ganiswara. 1995. Farmakologi dan Terapi. Edisi 4. Jakarta: Universitas Indonesia
Press
Hargono, Djoko. 1986. Sediaan Galenika. Departemen Kesehatan Republik
Indonesia. Jakarta .
Holt, J.G., Krieg, N.R., Sneathm, P.H.A., Staley, J.T. and Williams, S.T. (1994)
Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, 9th edn. Baltimore, MD:
Williams and Williams.
Imbs , Andrey B., Anna V. Vologodskaya, Natalia V. Nevshupova, Svetlana V.
Khotimchenko, Edouard A. Titlyanov. 2001. Response of prostaglandin
content in the red alga Gracilaria verrucosa to season and solar irradiance.
Phytochemistry 58: 067–1072.
Jawetz, Ernest.1995. Mikrobiologi untuk profesi kesehatan. Hal 140-143. Jakarta:
EGC
Jawetz, Ernest.1995. Mikrobiologi untuk profesi kesehatan. Hal 299-303. Jakarta:
EGC
Jeul. 1995. Speciment preparation method for Scanning Electron Microscope. Jeol
Aplication Note. Tokyo.
46
Kakita, H., Fukuoka, S., Obika, H., Li, Z.F., & Kamishima, H. 1997. Purification and
properties of a high molecular weight hemagglutinin from the red alga,
Gracilaria verrucosa . Botanica Marina, 40:241–247.
Kakita, H., Fukuoka, S., Obika, H., & Kamishima, H. 1999. Isolation and
characterisation of a fourth hemagglutinin from the red alga, Gracilaria
verrucosa , from Japan. Journal of Applied Phycology, 11: 49–56.
Khotimchenko, S.V. 2005. Lipids from the Marine Alga Gracilaria verrucosa .
Chemistry of Natural Compounds, 41: 285–288.
Khotimchenko, S.V. 2006. Variations in lipid composition among different
developmental stages of (Rhodophyta). Botanica Marina, 49 : 34–38.
Lydia, Ninan Lestario.2008.Antioxidant activity and total phenolic content of red
seaweed ( Gracilaria verrucosa). J.Teknol. dan industri pangan , Vol.XIX
No.2.
Melo, V.M.M, Cordeiro, R.A, Gomes, M.V, Carvalho, A.F.U. 2006. Effect of
Proteins (Agglutinins) from the Red Seaweed Hypnea musciformis (Wulfen)
Lamouroux on the Growth of Human Pathogen Yeasts. Brazilian archives of
biology and technology. 6 : pp. 915-921
Miksusanti., Jennie, B. S. L., Panco, B. dan Trimulyadi, G., 2008, Kerusakan
Dinding Sel Escherichia coli K1.1 oleh Minyak Atsiri Temu Kunci
(Kaempferia pandurata), Berita Biologi 9(1):1-8
Nadler , J. Victor .1979. Kainic Acid: Neurophysiological And Neurotoxic Actions.
Life Sciences, 24 : 289-300.
47
Neushul , Michael, 1990. Antiviral carbohydrates from marine red algae.
Hydrobiologia. 204/205: 99-104.
Nevshupova, N.V. 1999. Prostaglandin composition
of
red alga Gracilaria
verrucosa . Biologiya Morya, 25: 142–143.
Newman, David J , 2003. Natural Products as Sources of New Drugs over the
Period 1981-2002. J. Nat. Prod. 66:1022-1037
Nontji, Anugerah. 2002. Laut Nusantara. Penerbit Djambatan. Jakarta.
Noor, R.R. 2001. Scanning Electron Microscope. Laboraturium pemuliaan dan
Genetika ternak. Fakultas Peternakan. IPB
Padmakumar K, Ayyakkannu K .1997. Seasonal variation of antibacterial and
antifungal activities of the extracts of marine algae from Southern coast of
India. Bot. Mar. 40: 507-515
Pelczer et al. 1998. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jilid 1. Jakarta: UI-Press.
Pelczer et al. 1998. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jilid 2. Jakarta: UI-Press.
Pratiwi, Silvia T. 2008. Mikrobiologi Farmasi. Erlangga. Jakarta.
Ravikumar S, Anburajan L, Ramanathan G, Kaliaperumal N .2002. Screening of
seaweed extracts against antibiotic resistant post operative infectious
pathogens. Seaweed. Indian Journal of Marine Sciences. (24)1: 95-99.
Rhimou, Bouhlal., Hassane, R., Jose, M., Nathalie, B. 2010. The antibacterial
potential of the seaweeds (Rhodophyceae) of the strait of Gibraltar and the
48
Mediterranean Coast of Morocco. African Journal Of Biotechnology. 9(38):
6365-6372
Satari, Rachmaniar. 1997. Isolasi dan Identifikasi Polisakarida dari Rumput Laut.
Rangkuman Hasil Penelitian Produk Alami Laut Indonesia LIPI Puslitbang
Oseanologi.
Sasikumar, C., Rao, V.N.R., & Rengasamy, R. (1999). The effect of environmental
factors on the qualitative and quantitative characteristics of agar from the
marine red alga Gracilaria verrucosa (Gracilariales, Rhodophyta). Indian
Journal of Marine Sciences, 28: 270–273.
Schwable, Richard, et al,. 2007. Antimicrobial Suspectibility Testing Protocols. New
York : CRC Press.
Setiabudy R. 2007. Farmakologi dan Terapi Edisi 5. Jakarta : Departemen
Farmakologi dan Terapeutik FKUI.
Sirait, M. et al.1979. Farmakofe Indonesia, Edisi III. Direktorat Jendral Pengawasan
Obat dan Makanan: Jakarta.
Soegiarto, A., Sulistijo, W.S. Atmadja dan H. Mubarak. 1978. Rumput Laut (algae);
Manfaat, potensi dan usaha budidaya, SDE 46 LON-LIPI Jakarta, 61 pp.
Soesilo,S. Et al.1995. Farmakofe Indonesia, Edisi IV. Direktorat Jendral Pengawasan
Obat dan Makanan: Jakarta.
Son , Byeng Wha.1990. Glikolipids from Gracilaria verrucosa. Phytochemistry, 29,
Issue 1, Pages 307-309
49
Staf Pengajar FKUI. 1993. Mikrobiologi Kedokteran, Edisi revisi. Jakarta: Binarupa
Aksara.
Suhardimansyah. 2004. Pengaruh Tanah Pirit Pada Berbagai Perlakuan Terhadap
Pertumbuhan Rumput Laut, Gracillaria sp. IPB
Tjay T. H. dan R. Kirana, 2002, Obat-Obat Penting, ed. 5, PT. Elex Media
Komputindo, Jakarta.
WHO. 1999. Infectious Diseases are the Biggest Killer of the Young. diakses tanggal
25 Juli 2011. Dari http://www.who.int/infectious-disease-report/indexrpt99.htm
Winarno, F.G. 1996. Teknologi Pengolahan rumput laut. Pustaka Sinar Harapan.
Jakarta.
Xu, N, Xiao Fan, Xiaojun Yan, Xiancui Li, Rongli Niu, C.K. Tsenga. 2003.
Antibacterial bromophenols from the marine red alga Rhodomela
confervoides. Phytochemistry 62 : 1221–1224.
Zuhud, M.A.E., Rahayu, W.P.,Wijaya, H.P., Sari, P.P. 2001. Aktivitas Antimikroba
Ekstrak Kedawung Terhadap Bakteri Patogen. Jurnal Teknol dan Indrustri
Pangan. Vol. XII. : 6-12.
LAMPIRAN
50
51
Lampiran 1. Determinasi Tanaman
52
Lampiran 2. Gambar Gracilaria verrucosa
Gambar 1 . Gracilaria verrucosa
Gambar 2. Ekstrak Gracilaria verrucosa
53
Lampiran 3 . Hasil Penapisan fitokimia
Gambar 3. Penapisan Fitokimia
Alkaloid
Flavonoid
Saponin
Tanin
Kuinon
Steroid dan Triterpenoid
54
Lampiran 4. Perhitungan
1. Perhitungan Rendemen
Ekstraksi G. verrucosa sebanyak 500 g dalam metanol didapatkan ekstrak yang
dipekatkan hingga 18 g.
Rendemennya : 18 g x 100 % = 3.6 %
500 g
2. Susut Pengeringan
Dipanaskan 30 menit di oven ±150 oC
Cawan Penguap + tutup = 25,940 g
Cawan penguap + tutup + ekstrak = 26,944 g
Ekstrak 1,004 g
30 menit selanjutnya : Cawan penguap + tutu + ekstrak = 26,844 g
30 menit selanjutnya : Cawan penguap + tutup + ekstrak = 26,704 g
Didiamkan dalam eksikator 24 jam : Cawan penguap + tutup + ekstrak = 26,703 g
Jadi, susut pengeringan ekstrak metanol ganggang merah Gracilaria verrucosa adalah
= 26,944 g – 26,703 g
= 0,241 g
0,241 g x 100 % = 0,89%
26,944 g
3. Perhitungan Konsentrasi Uji
Konsentrasi 100 mg/ml :
Berat ekstrak kental : 1 gram
Volume metanol : 10 ml
Konsentrasi 10 mg/ml :
Berat ekstrak kental : 100 gram
55
Volume metanol : 10 ml
Konsentrasi 1 mg/ml :
Konsentrasi 10 mg/ml : 1 ml
Volume metanol : ad 10 ml
Konsentrasi 0.1 mg/ml :
Konsentrasi 1 mg/ml : 1 ml
Volume metanol : ad 10 ml
56
Lampiran 5. Hasil Pengukuran Absorban Suspensi Bakteri
57
Lampiran 6. Hasil Uji Diameter Zona Hambat
Gambar 4. Staphylococcus aureus
Gambar 5. Bacillus subtilis
Gambar 6. Streptococcus pneumoniae
58
Gambar 7. Proteus mirabillis
Gambar 8. Escherichia coli
Gambar 9. Pseudomonas aeruginosa
59
Lampiran 7. Pembuatan ekstrak Gracilaria Verrucosa
Gracilaria verrucosa
Dicuci bersih, dikeringkan, dirajang
Ekstraksi dengan methanol
(metode maserasi)
Dipekatkan dengan Vacuum
Rotary Evaporator
Didapatkan ekstrak kental
Gracilaria verrucosa
Dilarutkan dengan metanol
Uji Aktivitas Antibakteri
60
Lampiran 8. Pembuatan Suspensi Bakteri Uji
Bakteri uji yang murni
Diinokulasikan dalam
NaCl fisiologis
Vortex selama 5 menit
Diukur kepadatannya dengan spektrofotometer λ =625 nm,
A=0,08-0,1 (setara mc Farland 0,5 = 1-2 x 108 cfu/ml)
61
Lampiran 9. Uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak Metanol G. verrucosa
Tabel 2. Uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak Metanol G. verrucosa
Diameter zona hambat (mm)
Konsentrasi
Ekstrak
S. aureus
B. subtilis
S. pneumoniae
E. coli
P. aeruginosa
P. mirabilis
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
Kontrol (-)
0
0
0
0
0
0
Metanol
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
51
40
42
28
51
23
100 µg/ml
1000 µg/ml
10000µg/ml
100000µg/ml
Kontrol (+)
Amoxilin
25μg/cakram