tinjauan pustaka

TINJAUAN PUSTAKA
A. ENZIM ARABINOSA ISOMERASE
L-Arabinosa isomerase (AI) merupakan enzim intraseluler yang berdasarkan
klasifikasi enzim secara internasional atas reaksi yang dikatalisisnya diberi nomor
kode EC 5.3.1.4. Enzim AI dapat mengkatalisis secara revesible reaksi isomerisasi
L-arabinosa menjadi L-ribulosa dan D-galaktosa menjadi D-tagatosa. Perubahan
L-arabinosa menjadi L-ribulosa terjadi secara in vivo, sedangkan perubahan Dgalaktosa menjadi D-tagatosa dapat terjadi secara in vitro (Lee et al 2004).
Pada
awalnya
enzim
AI
diketahui
karena
kemampuan
beberapa
mikroorganisme menggunakan L-arabinosa sebagai sumber karbon. L-arabinosa
akan dirubah menjadi D-selulosa-5-posfat yang merupakan reaksi intermediet
dalam jalur pentosa fosfat. Reaksi tahap pertama pada jalur tersebut adalah
terjadinya perubahan arabinosa menjadi L-ribulosa oleh enzim arabinosa
isomerase (AI). Kemampuan AI dalam mengkatalisis reaksi isomerisasi galaktosa
menjadi tagatosa dikarenakan kemiripan struktur konfigurasi antara galaktosa
dengan L-arabinosa (Yoon et al 2003). Karena dapat mengkatalisis reaksi
isomerisasi pada D-galaktosa, enzim AI sering juga disebut sebagai galaktosa
isomerase (Zang et al 2010).
Gambar 2. Reaksi isomerisasi yang dikatalisis oleh enzim AI (Lee et al 2004)
5
Enzim AI dapat dihasilkan oleh mikroorganisme mesofilik dan termofilik.
Aerobacter aerogenes, Lactobacillus plantarum, L. gayonii, L. pentosus,L. sakei,
E. coli, Mycobacterium smegmatis, Salmonella typhimurium, Bacillus subtilis dan
B. halodurans merupakan mikroorganisme mesofilik penghasil enzim AI yang
telah diteliti. Sedangkan mikroorganisme termofilik penghasil enzim AI yang
sampai
saat
ini
telah
dipelajari
antara
lain
seperti
Thermus
sp.
Thermoanaerobacter mathranii, Alicyclobacillus acidocaldarius, Thermotoga
neapolitana,
Thermotoga
maritima,,
Geobacillus
stearothermophilus,
G.
thermodenitrificans dan Acidothermus cellulolytics (Zhang et al 2007; Prabhu et
al 2008; Rhimi et al 2010).
Enzim AI dikodekan oleh gen araA yang terletak pada kompleks gen Larabinosa. Gen araA terdiri dari sekitar 1494 – 1535 pasang basa (bp). Jumlah
pasang basa yang dimiliki gen araA tergantung mikroorganisme asalnya. Gen
araA G. stearothermophilus strain lokal memiliki 1512 pasang basa (Fitriani &
Saksono 2010). B. stearothermophilus US 100, G. stearothermophilus, dan G.
thermodenitrificans mengekspresikan enzim AI yang berukuran 56 kDa (Rhimi &
Bejar 2006; Kim & Oh 2005). Sebagian besar AI terdiri dari 4 (tetramer) struktur
sekunder yang berbentuk alfa-heliks. Kecuali AI dari E. coli yang berupa hexamer
(Wallace et al 1978). Asam amino yang berada pada sisi aktif enzim AI adalah
asam glutamat pada posisi 305 dan 330. Sisi aktif AI akan mengikat substrat
arabinosa ataupun galaktosa untuk dikatalisis menjadi produk. Struktur AI pada
saat mengikat substrat galaktosa dapat dilihat pada gambar 3 dibawah ini.
Gambar 3. Model molekul AI ketika mengikat galaktosa (Kim et al 2009)
6
Enzim AI dari bakteri termofilik memiliki pH optimum 7.0-8.5, dengan pH
isoelektrik sekitar 5.0-5.8 dan suhu optimum antara 60-90ºC. Sebagian besar
enzim AI membutuhkan ion logam Mn 2+ dan Co2+ sebagai kofaktor. Penggunaan
Co 2+ sebagai kofaktor untuk menghasilkan bahan pangan tidak direkomendasikan
karena bahaya kesehatan yang ditimbulkannya (Jorgensen et al 2004). Aktivitas
katalisis dan stabilitas beberapa enzim AI juga ada yang meningkat dengan
keberadaan ion Fe2+, Mg2+, dan Ca2+ (Oh 2007; Kim & Oh 2005). Tidak adanya
ion logam sebagai kofaktor menyebabkan aktifitas enzim AI lebih rendah (Lee et
al 2005a).
B. TAGATOSA
Tagatosa adalah monosakarida dengan rumus empiris C6H12O6 dan berat
molekulnya (Mr) 180,6. Tagatosa termasuk hekso-ketosa alami, akan tetapi jarang
terdapat di alam. Tagatosa hanya ditemukan dalam jumlah sedikit pada beberapa
buah, produk susu dan cokelat. Tagatosa memiliki struktur molekul yang hampir
sama dengan fruktosa dan telah dikenal sebagai komponen yang aman digunakan
pada bahan pangan dan produk farmasi. Food and Drug Administration Amerika
Serikat (U.S. FDA) telah menetapkan tagatosa sebagai GRAS (Generally
Recognized As Safe) komponen (Levin 2002).
Gambar 4. Perbandingan struktur molekul tagatosa dan fruktosa (Skytte 2006)
Suhu leleh dari tagatosa adalah 134ºC, dan stabil pada pH 2–7. Tagatosa
0
memiliki kelarutan yang tinggi [58% (w/w) pada 21 C]. Karakter humektan
tagatosa sama dengan sorbitol. Sifat higroskopis dari tagatosa lebih rendah jika
7
dibandingkan fruktosa. Viskositas tagatosa lebih rendah dibandingkan sukrosa
pada konsentrasi yang sama, akan tetapi sedikit lebih tinggi dibandingkan fruktosa
dan sorbitol. Pada suhu tinggi, reaksi Maillard dan karamelisasi oleh tagatosa
akan memberikan warna coklat seperti yang dihasilkan oleh sukrosa (Levin 2002).
Tabel 1. Karakteristik fisik dan kimia tagatosa (Levin 2002; Skytte 2006)
Karakteristik
Nama umum
Sinonim
Melting point
Bulk density (g/ml)
Optical rotation
Bentuk fisik
Nilai kalori
Odor, cooling effect dan
Karsinogenesitas
Penjelasan
D-Tagatosa, Tagatosa
D-lyxo-hexulose
133-137ºC
0.7-0.9
a D20 = - 5ºC (c =1 dalam H2O)
Kristal
< 1,5 kcal/g
Tidak ada
Lu et al (2007) menyatakan bahwa tagatosa digunakan sebagai produk
antidiabetes dan pengendali obesitas. Tagatosa bisa meningkatkan high density
lipoprotein (HDL) dan mencegah kanker kolon. Kemampuan tagatosa dalam
mengendalikan gejala hiperglikemia dikarenakan tagatosa dapat menjadi inhibitor
bagi enzim maltase dan sukrase. Mekanisme tagatosa sebagai inhibitor enzim
maltase dan sukrase dapat dilihat pada gambar 5.
Gambar 5. Salah satu mekanisme tagatosa sebagai produk antidiabetes dan
hiperglikemia (Lu et al 2007)
8
Konsumsi tagatosa tidak menyebabkan kerusakan gigi dan efek laktasif.
Tagatosa lambat diserap oleh saluran intestinal sehingga tidak berakibat pada
naiknya indeks glikemik secara cepat (Lu et al 2007). Gambar 6 memperlihatkan
perbandingan respon glikemik dari tagatosa dibandingkan pemanis lainnya.
Menurut Skytte (2006) hanya sekitar 25% tagatosa yang diserap pada usus halus,
sisanya 75% akan difermentasi dalam usus besar oleh mikroflora menjadi asam
lemak rantai pendek. Tagatosa dapat meningkatkan pertumbuhan Lactobacillus
dan bakteri asam laktat lainnya. Manfaat prebiotik tagatosa telah dipelajari pada
manusia dan hewan (Skytte 2006).
Gambar 6. Perbandingan respon glikemik tagatosa dengan beberapa pemanis
(Skytte 2006)
Konsentrasi penggunaan tagatosa pada produk pangan bervariasi. Tagatosa
digunakan sebanyak 1% pada minuman diet berkarbonasi, 2% pada produk roti,
3% pada es krim dan 15% produk candies khusus untuk penderita diabetes
(Dobbs & Bell 2010). Amerika Serikat, Korea, New Zeland dan Australia telah
menerapkan penggunaan tagatosa dalam produk-produk minuman, confectionary,
makanan kesehatan dan pemanis rendah kalori.
9
Tabel 2. Manfaat kesehatan dan aplikasi tagatosa pada produk pangan (Oh 2007)
Manfaat kesehatan
Rendah kalori
Jenis produk pangan
Makanan rendah karbohidrat, sereal,
minuman ringan dan health bars
Diabetic food (tipe 2)
Supplemen
Cokelat, candies, chewing gum
Yogurt, bakery, minuman susu dan
confectionary
No glycemic effect
Anti halistosis
Prebiotik
Flavor enhancement
C. KONSEP DNA REKOMBINAN
Prinsip teknologi rekombinasi DNA yaitu menggabungkan molekul fragmen
DNA atau gen dari organisme yang berbeda sehingga menghasilkan kombinasi
baru yang sebenarnya tidak terdapat secara alami (Glick & Pasternak 2003). DNA
dari manusia, hewan, tumbuhan dan mikroorganisme dapat direkombinasi. DNA
rekombinan buatan sangat berguna dalam penelitian genetika. Teknologi DNA
rekombinan terus mengembangkan metode untuk isolasi dan menyatukan gen
menjadi kombinasi baru.
Tahap awal dari rekombinasi adalah isolasi gen target. Isolasi gen dapat
dilakukan dengan 2 cara yakni pemotongan secara langsung dan isolasi mRNA
untuk persiapan cDNA.
Enzim endonuklease restriksi digunakan untuk
memotong untai DNA. Sedangkan DNA ligase berguna untuk menggabungkan
fragmen-fragmen DNA. Apabila menggunakan metode isolasi mRNA, maka
harus berdasarkan prinsip reverse transcription dan memerlukan penyusunan
DNA primer. Gen yang telah diperoleh kemudian disisipkan pada vektor
pembawa yang akan membawa gen ke dalam sel inang (host). Sel inang yang
telah ditransformasi kemudian diseleksi dan digunakan ataupun dikembangkan
sebagai organisme penghasil DNA rekombinan (Lehninger 2004).
1. Plasmid
Cara insersi gen asing ke dalam sel inang pada teknik rekombinasi DNA
dapat dilakukan dengan plasmid, bakteriophage, cosmid dan kromosom buatan
(Prescott 2002). Plasmid dan bakteriophage merupakan vektor yang paling
banyak digunakan. Plasmid adalah DNA berbentuk lingkaran yang ditemukan
dalam sitoplasma spesies bakteri. Plasmid mengandung gen yang melakukan
10
replikasi, transkripsi dan translasi secara terpisah, tetapi dalam waktu yang
bersamaan dengan kromosom. Plasmid memiliki sifat istimewa, sehingga sangat
bermanfaat dalam teknik rekayasa genetika. Plasmid dapat melewati sel, pindah
dari sel yang satu ke sel lainnya atau dari satu spesies bakteri ke spesies lainnya.
Penggabungan gen asing ke dalam plasmid dapat dilakukan dengan mudah. Selain
itu, plasmid dapat disisipi atau terkadang telah memiliki penanda seleksi (Tortora
et al 2010).
Plasmid juga bisa digunakan sebagai vektor ekspresi. Ekpresi adalah
perubahan fragmen DNA atau gen menjadi protein spesifik melalui tahap
transkripsi dan translasi. Untuk ekspresi, plasmid harus memiliki signal pemulai
tahapan transkripsi dan translasi yang diperlukan. Tingkat ekspresi gen yang
dikloning dikendalikan oleh sekuen promoter dan regulator yang terdapat pada
vektor ekpresi tersebut. Promoter dan regulator memberikan isyarat tempat
dimana RNA polimerase berikatan dan mulai melakukan proses transkripsi
(Lehninger 2004).
Pemakaian teknologi rekombinasi DNA dibidang produksi enzim secara
lebih spesifik dapat dilakukan dengan beberapa cara, salah satunya aplikasi gen
terpilih melalui plasmid. Pemindahan gen penyandi enzim suatu mikroba atau
organisme yang bersifat unggul ke dalam mikroba lain dapat dilakukan dengan
cara
mengisolasi
mengintegrasikannya
gen
ke
yang
diinginkan.
dalam plasmid
Kemudian
tertentu.
memindahkan
dan
Selanjutnya dilakukan
amplifikasi gen yang diinginkan sehingga dapat meningkatkan produksi protein
fungsional yang diturunkan dari gen tersebut (Suhartono 1989).
Gambar 7. Plasmid sebagai vektor ekspresi (Koolman & Roehm 2005)
11
2. Plasmid pET-21b(+) dan Inang E. coli BL21 (DE3) pLysS
Plasmid pET-21b(+) merupakan salah satu plasmid yang dirancang untuk
mengekspresikan gen target yang telah membawa situs pengikatan ribosom dan
kodon pemulai (start codon).
pET-21b(+) berukuran 5442 bp dimana peta
konstruksi sistem ekspresinya terdiri dari sebuah gen lacI yang mengkode protein
represor, sebuah promoter T7 yang spesifik untuk hanya T7 RNA polimerase
(bukan bakteri RNA polimerase dan juga tidak terdapat dalam genom
prokariotik), operator lac (lac O) yang dapat menghalangi transkripsi, multiple
cloning site (MCS), sebuah gen replikasi asli dari plasmid alaminya (pBR322
ORI), dan suatu gen resistensi ampisilin (Blaber 1998). Gambar 8 menampilkan
secara garis besar peta plasmid kontruksi pET-21b(+). Sistem pET memberikan
hasil ekspesi protein target yang tinggi dan sangat kuat dalam mengendalikan
ekpresi basal yang tidak diinginkan. Sistem pET plasmid yang berdasarkan T7
promoter merupakan yang paling tepat untuk kloning dan ekspresi DNA
rekombinan di dalam E. coli (Studier & Moffatt 1986; Novagen 1999).
Gambar 8. Peta plasmid pET-21b(+) secara garis besar
Bakteri E. coli BL21 (DE3) pLysS mempunyai stabilitas yang tinggi
dalam ekspresi protein. Inang ekspresi ini membawa gen T7 RNA polimerase
dibawah kontrol promoter lacUV5. E. coli BL21 memiliki plasmid pLysS,
plasmid ini akan mengkode sejumlah kecil lisosim T7 yang mempunyai kontrol
yang tinggi terhadap ekspresi protein toksik dan resisten terhadap kloramfenikol.
12
Plasmid pLysS mempunyai sedikit inhibisi terhadap T7 RNA polimerase sehingga
perlu
diinduksi
oleh
isopropyl-ß -D-thiogalactopyranoside
(IPTG).
IPTG
menginduksi T7 RNA polimerase dengan promoter lacUV5 sehingga ekspresi
protein rekombinan dapat maksimal (Sambrook & Russell 2001).
3. Mekanisme Ekspresi Gen Target pada Kombinasi Plasmid pET-21b dan
E. coli BL21
Ekpresi protein pada sistem pET21b(+) dan inang E. coli BL21 merupakan
sistem operon indusibel yang sangat kompleks. Operon adalah kelompok gen
yang diatur secara terkoordinasi dengan fungsi yang saling terkait. Operon terdiri
dari promoter, operator, kompleks gen penyandi protein fungsional dan gen
pengkode represor yang berada pada bagian terluar dari operon. Promoter
berfungsi sebagai tempat RNA polimerase mengawali proses transkripsi. Operator
sebagai saklar yang akan menentukan perlu atau tidaknya ekspresi suatu protein
atau peptida pada operon. Saklar operator akan aktif apabila represor terlepas dari
operator (Campbell et al 2003).
Plasmid pET21b yang telah mengandung gen target pada posisi hilir dari
T7 promoter dimasukkan ke dalam inang E. coli BL21. E. coli BL21 telah
mengandung gen T7 faga yang akan menghasilkan T7 RNA polimerase. T7 RNA
polimerase ini hanya bekerja dan memulai transkripsi pada situs promoter T7
(yang dalam hal ini terdapat pada plasmid pET21b[+]). Pembentukan T7 RNA
polimerase diatur melalui operon tersendiri yang telah dikonstruksi pada genom
E. coli BL21 (Sambrook & Russell 2001).
Penambahan senyawa IPTG akan menyebabkan represor tidak dapat
menginkatifkan operator yang awalnya memblok proses transkripsi, sehingga T7
RNA polimerase dihasilkan yang selanjutnya memulai tahapan transkripsi pada
T7 promoter gen target. Karena T7 merupakan promoter dari virus, maka gen
target akan ditranskripsikan secara cepat selama RNA polimerase ada (Sambrook
& Russell 2001). Ekspresi gen target akan naik secara cepat sebagaimana jumlah
mRNA yang ditranskripsikan juga meningkat. Mekanisme pada plasmid ini
serupa dengan mekanisme pemanfaatan laktosa oleh lac operon bakteri.
13
SEL INANG
Gambar 9. Mekanisme ekspresi gen target pada E. coli BL21 (DE3) pLysS
pET21b(+) araA (Sambrook & Russell 2001).
D. PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI ENZIM
Isolasi dan pemurnian enzim intraseluler mikrobial dapat dilakukan dengan
cara pemecahan dinding sel. Pemecahan dinding sel bisa secara mekanis dan non
mekanis. Teknik freeze-thaw merupakan teknik pemecahan dinding sel non
mekanis dengan manipulasi lingkungan. Freeze-thaw dapat memisahkan protein
target dari protein membran dan inclusion bodies. Perlakuan pembekuan dan
pencairan sel secara cepat akan mengakibatkan rusaknya dinding sel.
Pembentukan kristal es merupakan faktor utama penyebab kerusakan ini. Yang
perlu diperhatikan dalam proses pemecahan sel melalui cara freeze-thaw adalah
penggunaan suhu dibawah -20ºC, perlakuan yang cepat dan sistem pelarut sel.
Pada proses penghancuran ditambahkan buffer atau cairan sehingga memudahkan
proses ekstraksi (Suhartono, 1989).
Pemisahan partikel dari cairan termasuk bagian penting operasi dalam
isolasi enzim. Pemisahan dilakukan untuk memisahkan sel dari cairan kultur dan
penggumpalan presipitat enzim. Enzim intraseluler yang telah dikeluarkan,
14
dipisahkan dari bagian sel dan dindingnya dengan proses sentrifugasi. Pemisahan
dengan sentrifugasi merupakan sistem pemisahan berdasarkan berat. Partikel
dengan berat yang berbeda akan mengendap pada kecepatan yang berbeda. Proses
sentrifugasi pada enzim sebagian besar dilakukan pada suhu rendah, sehingga
kehilangan aktivitas enzim dapat dijaga seminimal mungkin (Suhartono, 1989).
Pemurnian atau purifikasi enzim adalah memisahkan enzim target dari
selainnya. Tujuan pemurnian enzim adalah mendapatkan enzim target dalam
keadaan murni. Untuk enzim termofolik, pemurnian dengan perlakuan panas
sering kali dilakukan. Dengan perlakuan panas akan memisahkan enzim yang
tahan panas dari protein lain yang tidak tahan panas. Hal penting yang harus
diperhatikan dalam merencanakan tahapan pemurnian yaitu mempertahankan
aktivitas enzim atau mengurangi proteolisis dan denaturasi aktivitas enzim murni
serta menentukan jumlah enzim yang dibutuhkan. Enzim yang kasar dan murni
dapat
digunakan
untuk
tujuan
komersial.
Sedangkan
untuk
keperluan
laboratorium diperlukan enzim murni (Harris 1989).
Pemurnian enzim seringkali menggunakan kolom kromatografi. Terdapat 5
teknik kromatografi kolom yang sering digunakan antara lain seperti:
kromatografi pertukaran ion, kromatografi gel filtrasi, kromatografi afinitas,
kromatografi interaksi hidrofobik dan kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC)
(Sheehan 2009). Kromatografi penukar ion memanfaatkan perbedaan afinitas
antara molekul bermuatan di dalam larutan dengan senyawa yang tidak reaktif
yang bermuatan berlawanan sebagai pengisi kolom. Golongan senyawa ini
merupakan polimer terhidratasi yang bersifat tidak larut seperti selulosa, dekstran
dan agarosa. Gugus penukar ion diimobilisasikan pada matriks. Matriks selulosa
biasanya digunakan untuk memisahkan protein (termasuk enzim), polisakarida
dan asam nukleat. Beberapa gugus penukar anion yaitu aminoetil (AE-) kuntenari
aminoetil (QAE-) dan dietil aminoetil (DEAE-), sedangkan gugus penukar kation
yaitu sulfopropil (SP-), metil sulfonat dan karboksimetil (CM-) (Widyastuti
2007).
Kromatografi penukar ion dilakukan dengan mengelusi protein enzim
menggunakan buffer awal yang telah diatur. Protein enzim yang diharapkan
terikat pada kolom kemudian dilepaskan dengan cara mengubah pH buffer atau
15
kekuatan ionik pelarut (Phage & Thorpe 2009). Molekul enzim atau protein terdiri
atas muatan positif dan negatif tergantung pada rantai samping asam amino asam
dan basa. pH pada kondisi jumlah muatan positif dan muatan negatif sama disebut
titik isoelektrik (pI). pI sebagian besar protein berkisar antara pH 5 dan 9. Protein
yang berada pada kondisi pH diatas pI akan bermuatan negatif, dan apabila pH
dibawah pI akan bermuatan positif (Lehninger 2004). Karboksimetil selulosa
(CMC) dan dietilaminoetil (DEAE) selulosa merupakan penukar ion yang banyak
dipakai untuk keperluan fraksinasi enzim. Apabila kondisi elusi dapat dijaga
dengan hati-hati, tingkat kemurnian yang tinggi seringkali dapat dicapai.
Agar enzim dapat bekerja secara optimal, perlu diketahui karakteristik
biokimiawi enzim, seperti suhu dan pH optimum, pengaruh ion logam, stabilitas
panas dan lainnya. Kondisi lingkungan harus menunjang kondisi yang dibutuhkan
enzim untuk dapat berfungsi sebagai katalis suatu reaksi (Buchholz et al 2005).
Enzim adalah suatu protein, maka kenaikan suhu dapat menyebabkan
terjadinya denaturasi. Apabila terjadi proses denaturasi, maka bagian aktif enzim
akan terganggu dan dengan demikian konsentrasi efektif enzim akan berkurang
dan kecepatan reaksinya juga akan menurun. Kenaikan suhu sebelum terjadinya
proses denaturasi dapat menaikkan kecepatan reaksi, akan tetapi kenaikan suhu
pada saat mulai terjadinya proses denaturasi akan mengurangi kecepatan reaksi.
Peningkatan suhu tertentu menyebabkan semakin meningkatnya aktivitas katalitik
enzim tetapi juga semakin bertambahnya kerusakan enzim (Illanes 2008).
Struktur protein menentukan aktivitas enzim, jika strukturnya terganggu
maka aktivitasnya akan berubah pula. Kenaikan suhu sampai batas tertentu dalam
suatu reaksi menyebabkan peningkatan kecepatan reaksi karena bertambahnya
energi kinetik yang mempercepat gerak vibrasi, translasi dan rotasi enzim dan
substrat sehingga memperbesar peluang keduanya untuk bereaksi. Pada suhu yang
lebih besar dari batas reaksi, protein enzim dapat mengalami perubahan
konformasi yang bersifat detrimal yaitu berubahnya susunan tiga dimensi yang
khas dari rantai polipeptida. Hal yang sama juga dapat terjadi pada substrat yang
perubahan konformasinya dapat menyebabkan gugus reaktifnya akan mengalami
kesulitan pada saat memasuki sisi aktif enzim (Machielsen et al 2007).
16
Seperti protein pada umumnya, struktur ion enzim tergantung pada pH
lingkungannya. Enzim dapat berbentuk ion positif, ion negatif atau ion bermuatan
ganda (zwitter ion). Dengan demikian perubahan pH lingkungan akan
berpengaruh terhadap aktivitas bagian aktif enzim dalam bentuk kompleks enzim
substrat. Disamping pengaruh struktur ion pada enzim, pH rendah atau pH tinggi
dapat pula menyebabkan terjadinya proses denaturasi dan ini akan menyebabkan
menurunnya aktivitas enzim (Lehninger 2004)
Enzim memiliki pH optimum yang khas, yaitu pH yang menyebabkan
aktivitas maksimal. Profil aktivitas pH enzim menggambarkan pH pada saat
gugus pemberi atau penerima proton yang penting pada sisi katalitik enzim berada
dalam tingkat ionisasi yang diinginkan. Nilai pH optimum tidak perlu sama
dengan pH lingkungan normalnya, dengan pH yang mungkin sedikit berada diatas
atau dibawah pH optimum. Aktivitas katalitik enzim dalam sel mungkin diatur
sebagian oleh perubahan pada pH medium atau lingkungan (Lehninger 2004).
Banyak enzim yang memerlukan tambahan komponen kimia bagi
aktivitasnya. Komponen ini disebut dengan kofaktor. Kofaktor bisa berupa
molekul organik seperti ion Fe, Mn dan Zn atau mungkin juga molekul organik
kompleks yang disebut koenzim seperti tiamin pirofosfat, FAD serta koenzim A.
Beberapa enzim memerlukan satu atau lebih kofaktor dan koenzim bagi
aktivitasnya. Pada beberapa enzim, koenzim atau ion logam hanya terikat secara
lemah atau dalam waktu sementara. Akan tetapi pada beberapa enzim lainnya
senyawa ini terikat kuat dan permanen. Dalam hal ini disebut gugus prostetik.
Enzim yang strukturnya sempurna dan aktif mengkatalisis bersama-sama dengan
koenzim atau gugus logam lainnya disebut holoenzim. Koenzim dan ion logam
bersifat stabil selama pemanasan, sedangkan bagian protein enzim yang disebut
apoenzim akan terdenaturasi oleh pemanasan (Illanes 2008).
Ion logam mempunyai peranan penting dalam menjaga kestabilan enzim.
Logam biasanya berperan sebagai pengatur aktivitas enzim. Ion logam dapat
mengaktifkan enzim melalui berbagai kemungkinan seperti : 1) menjaga bagian
internal enzim, 2) menghubungkan enzim dengan substrat 3) merubah konstanta
keseimbangan reaksi enzim 4) merubah tegangan permukaan reaksi enzim 5)
menghilangkan inhibitor, 6) menggantikan ion logam yang tidak efektif pada sisi
17
aktif enzim maupun substrat, dan 7) merubah konformasi enzim menjadi
konformasi yang lebih aktif (Whitaker et al 2003).
Beberapa jenis enzim mengandung ion logam yang telah terikat ataupun
memerlukan ion logam yang sengaja ditambahkan bagi aktivitasnya. Metaloenzim
mengandung ion logam fungsional dalam jumlah pasti, yang dipertahankan
selama proses pemurnian. Enzim yang diaktifkan oleh logam memperlihatkan
ikatan yang lebih lemah dengan logam, dan dengan demikian memerlukan logam
tambahan. Oleh karena itu, perbedaan metaloenzim dengan enzim yang diaktifkan
oleh logam terletak pada afinitas suatu enzim tertentu terhadap ion logamnya
(Bugg 2004).
Seperti halnya katalisator, enzim dapat mempercepat reaksi kimia dengan
menurunkan energi aktivasinya. Kemampuan enzim merubah substrat menjadi
produk disebut sebagai aktivitas enzim. Dengan persetujuan internasional, 1,0 unit
aktivitas enzim didefinisikan sebagai jumlah yang menyebabkan pengubahan 1,0
mikromol (10 -6 mol) substrat per menit pada keadaan pengukuran optimal.
Aktivitas spesifik adalah jumlah unit substrat yang dirubah per milligram enzim
(Lehninger 1982).
E.
SODIUM
DEDOSIL
SULFAT
ELEKTROFORESIS (SDS-PAGE)
POLIAKRILAMID
GEL
Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE)
merupakan metode analisis protein secara kualitatif yang paling banyak
digunakan. Secara umum SDS-PAGE bermanfaat untuk menganalisis kemurnian
protein. Dan karena dapat memisahkan protein berdasarkan ukuran, maka metode
ini juga dapat digunakan untuk menentukan berat molekul relatif protein (Walker
2009). Elektroforesis adalah peristiwa perpindahan partikel-partikel bermuatan
karena pengaruh medan listrik. Pada tahapan SDS-PAGE, protein didenaturasi
menggunakan panas, ß-merkaptoetanol, dan SDS. Protein yang terdenaturasi akan
bereaksi dengan SDS yang merupakan deterjen anionik membentuk kompleks
yang bermuatan negatif. Protein dalam bentuk kompleks yang bermuatan negatif
ini akan dapat dipisahkan berdasarkan muatan dan ukurannya secara elektroforesis
di dalam matriks gel poliakrilamid. Berat molekul protein dapat diukur dengan
18
bantuan protein standar (marker) yang telah diketahui berat molekulnya melalui
perbandingan nilai mobilitas relatif (Rf) (Lehninger 2004).
Gel poliakrilamid tersusun atas monomer monoakrilamid yang membentuk
ikatan silang dengan bantuan ammonium persulfat (APS) dan N,N,N,Ntetramethylethylenediamine (TEMED). Ukuran pori gel poliakrilamid bergantung
pada konsentrasi akrilamid. SDS-PAGE terdiri dari 2 gel yaitu stacking gels dan
separating gels. Stacking gels memiliki kandungan akrilamid yang lebih rendah
sehingga memiliki pori yang lebih besar. Stacking gels berfungsi sebagai media
agar protein terdenaturasi yang telah bermuatan negatif bergabung atau
berasosiasi membentuk elips masuk kedalam separating gel. Separating gels yang
memiliki pori yang lebih kecil kemudian akan memisahkan protein berdasarkan
ukuran. Protein yang berukuran lebih kecil akan lebih cepat melewati pori-pori
pada separating gels (Walker 2009).
SDS-PAGE dilakukan dengan posisi berdiri, dimana pada bagian bawah gel
diberi buffer anoda (bermuatan positif) dan dibagian atas gel diberi buffer katoda
(bermuatan negatif). Kompleks protein-SDS yang telah bermuatan negatif akan
bergerak melewati gel poliakrilamid menuju anoda dengan bantuan medan listrik
dan buffer elektroforesis. Laju pergerakan protein bergantung pada ukuran pori
dan kekuatan medan listrik. Setelah dilakukan elektroforesis, gel divisualisasi
dengan pewarnaan. Pewarnaan protein dalam gel dapat dilakukan dengan pewarna
Coomassie Brilliant Blue R-250 atau pewarna perak (silverstain). Dengan
pewarnaan, protein dalam gel poliakrilamid akan terlihat membentuk band atau
pita yang terpisah berdasarkan ukurannya masing-masing (Walker 2009).
F. PENGUKURAN KONSENTRASI PROTEIN
Menurut Walker (2009), kuantifikasi protein dapat dilakukan dengan
beberapa metode diantaranya adalah dengan: 1) absorbansi dengan sinar
ultraviolet (UV absorption), 2) metode Lowry, 3) bicinchoninic acid (BCA) assay
dan 4) metode Bradford. Metode Bradford merupakan salah satu teknik penentuan
kadar protein yang berdasarkan pada pengikatan secara langsung zat warna
Coomassine Brilliant Blue G250 (CBBG) oleh protein pada kondisi pH asam.
Grup trifenilmetana mengikat struktur non polar protein dan grup anion sulfonat
berinteraksi dengan rantai samping protein kation (protein bermuatan positif).
19
Jumlah CBBG yang terikat pada protein proporsional dengan muatan positif yang
ditemukan pada protein. Reagen CBBG bebas berwarna merah-kecoklatan
(panjang gelombang
maks
465 nm), sedangkan dalam suasana asam reagen CBBG
akan berada dalam bentuk anion yang akan mengikat protein membentuk warna
biru (panjang gelombangmaks 595 nm). (Bradford 1976).
Pada metode Bradford, penentuan protein dapat dilakukan dengan cara
mikro untuk kandungan protein yang rendah dan makro untuk kandungan protein
yang tinggi. Standar konsentrasi protein yang sesuai adalah 10-100 µg.
Konsentrasi protein 0-10 µ g biasanya digunakan dalam pengujian mikro dan 10100 µg digunakan dalam pengujian makro. Karena lebih sederhana dan lebih
sensitif, metode ini adalah yang paling banyak digunakan untuk analisis protein
secara kuantitatif (Kruger 2009).
Hubungan absorbansi dan konsentrasi protein ditentukan melalui kurva
standar yang telah dibuat sebelumnya. Penetapan kurva standar dilakukan dengan
menggunakan protein tertentu seperti bovin serum albumin (BSA),
dengan
berbagai konsentrasi. Besarnya konsentrasi BSA sebagai protein standar adalah
sekitar 150-750 µg/ml (Coligan et al 2004). Hubungan antara konsentrasi larutan
standar dan absorbansinya dinyatakan sebagai persamaan regresi linier: Y = a +
bx. Dalam analisis dengan metode bardford ini terdapat dua jenis metode yaitu
makro assay untuk konsentrasi protein tinggi dan mikro assay untuk konsentrasi
protein rendah (Bradford 1976).
20