(Agus R,2014). Pada penelitian Kadival et al., 1997 menunjukkan

KLONING GEN Pab MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS
KE VEKTOR EKSPRESI pQE30 SEBAGAI ANTIGEN UNTUK
KIT DIAGNOSTIK TUBERKULOSIS LATEN
Rosana Agus1, Sjafaraenan1, Helmy Widyastuti1 dan A. Arfan Sabran1
Laboratorium Genetika, Jurusan Biologi Fakultas MIPA Universitas Hasanuddin
[email protected]
1
ABSTRAK
Saat ini deteksi TB laten masih dilakukan dengan uji tuberculin skin test (TST). Prinsip uji tuberkulin adalah
timbulnya hipersensitivitas pada seseorang yang terinfeksi M. tuberculosis terhadap komponen tuberkulin yaitu purified
protein derivative (PPD). PPD mengandung kurang lebih 200 antigen mikobakteri, sehingga uji tuberkulin tidak spesifik.
Dengan demikian, dibutuhkan reagen diagnostik TB yang dapat mengidentifikasi individu terinfeksi baru dan laten. Salah
satu yang berpotensi adalah antigen 38 kDa dari M.tuberculosis . Diketahui bahwa antigen ini memiliki respons
immunodominan terhadap sel B dan sel T, dan spesifik pula pada M.tuberculosis complex, sehingga berpotensi untuk
dikembangkan menjadi alat deteksi tuberkulosis melalui kulit. Antigen 38 kda dikode oleh gen Pab dan telah berhasil di
kloning ke vektor kloning pGEM-T.
Tujuan penelitian ini adalah untuk mengkloning gen Pab ke vektor ekspresi, sehingga dapat diproduksi menjadi antigen
untuk pengembangan kit diagnosis TB laten berbasis imunologi. Metode yang digunakan adalah memotong gen Pab dan
vektor ekspresi pQE30 dengan enzim restriksi yang sama , meligasi ke vektor ekspresi dan mentransformasi ke sel host
E.coli BL 21. Karakterisasi klon rekombinan dilakukan dengan PCR dan sekuensing.
Hasil penelitian diperoleh klon rekombinan pQE30-Pab dan setelah dikarakterisasi dengan PCR dan sekuensing,
diperoleh bahwa DNA yang disisipkan adalah benar gen Pab. Kesimpulan dari penelitian ini adalah bahwa gen Pab telah
berhasil dikloning ke vektor ekspresi pQE30.
Kata kunci : hipersensitivitas , pGEM-T, PCR, TST
ABSTRACT
The detection of latent TB is still done with the tuberculin skin test test (TST). The principle TST was the incidence of
hypersensitivity tuberculin test on a person infected with M. tuberculosis to which component of purified protein derivative
of tuberculin (PPD). PPD contains approximately 200 mycobacterial antigens, so the tuberculin test is not specific. Thus, it
takes a TB diagnostic reagents that can identify new and latently infected individuals. One of the potential is 38 kDa antigen
of M. tuberculosis. It is known that this antigen has immunodominan response against B cells and T cells, and also specific to
the M. tuberculosis complex, so has the potential to be developed into a tool of detection of tuberculosis through the skin. 38
kDa antigen encoded by genes Pab and have successfully cloned into the cloning vector pGEM-T. The purpose of this study
was to clone the Pab gene into the expression vector pQE30, so it can be manufactured into antigen for the diagnosis of latent
TB development kit based immunology. The method used was cut Pab gene and expression vector pQE30 with the same
restriction enzyme, ligating into an expression vector and transformed into host cells E. coli BL 21. Characterization of
recombinant clones performed by PCR and sequencing.
The results were obtained recombinant clone pQE30-Pab and after characterized by PCR and sequencing, showed that the
inserted DNA is actually genes Pab. The conclusion of this study that the gene has been successfully cloned Pab into the
expression vector pQE30.
Keywords: hypersensitivity, pGEM-T, PCR, TST
1. Pendahuluan
Di negara berkembang seperti Indonesia,
diagnostik tuberkulosis dilakukan secara mikroskopik
pada sputum untuk melihat keberadaan dan jumlah
basil tahan asam (BTA) dan secara radiologi. Namun
tantangan utama dalam pengendalian TB adalah
diagnosis dan penatalaksanaan infeksi TB laten.
Menurut Flynn and Chan, 2001 bahwa penduduk
dengan TB laten, sekitar 5-10% diantaranya akan
menjadi TB aktif. Deteksi infeksi TB laten tidak
memiliki standar baku, namun saat ini dilakukan
dengan uji tuberculin skin test (TST) (Menzies et al.,
2007).
Prinsip uji tuberkulin adalah timbulnya
hipersensitivitas pada seseorang yang terinfeksi M.
tuberculosis terhadap komponen tuberkulin dari bakteri
tersebut yaitu purified protein derivative (PPD). Uji
tersebut dilakukan dengan menyuntikan 0,1 ml (5
tuberkulin unit) PPD secara intrakutan. Hasil dapat
1
dilihat 48-72 jam setelah penyuntikan dengan
mengamati ada atau tidaknya indurasi pada kulit
dengan mengukur diameter indurasi (Jasmer et al.,
2002). PPD mengandung 200 antigen mikobakteri,
antara lain M.tuberculosis kompleks (M. tuberculosis,
M. bovis dan M.africanum), mikobakteri bukan
tuberkulosa (NTM) dan M. bovis BCG ( Pinxteren
et.al, 2000). Akibatnya uji tuberkulin mempunyai
beberapa keterbatasan yaitu terjadi reaksi positif palsu
karena adanya reaksi silang antara PPD dan antibodi
yang dihasilkan oleh vaksinasi BCG atau infeksi
dengan mikobakteria bukan TB (Diel et al., 2009).
Dengan demikian, ketersediaan reagen diagnostik
untuk TB sangat diperlukan yang secara ideal dapat
mengidentifikasi individu terinfeksi baru dan laten
dengan resiko tinggi untuk berkembang menjadi
tuberkulosis aktif.
Penelitian kami tentang pencarian antigen M.
tuberculosis asal Makassar yang reaktif terhadap serum
penderita
tuberkulosis
dan
kontak
sebagai
imunodiagnostik tuberkulosis laten diperoleh antigen
38 kDa (Agus R,2014). Pada penelitian Kadival et al.,
1997 menunjukkan bahwa antigen 38 kDa dari
M.tuberculosis
memiliki
respons
sangat
immunodominan terhadap sel B dan sel T. Menurut
Rosales-Borjas et al., 1998 bahwa antigen 38 kDa
spesifik pula pada M.tuberculosis complex dan bersifat
sangat immunogenik, sehingga berpotensi untuk
dikembangkan menjadi alat deteksi tuberkulosis
melalui kulit dengan uji serologi. Antigen 38
Mycobacterium tuberculosis merupakan phosphate
binding protein yang dikode oleh gen Pab (protein
antigen b) yang berukuran 1993 bp (Andersen and
Hansen, 1989).
Pada penelitian kami sebelumnya gen ini telah
berhasil dikloning ke vektor kloning dan
dikarakterisasi kebenarannya. Selanjutnya akan
dilakukan subkloning ke vektor ekspresi.
Berdasarkan penjelasan di atas maka kami akan
melakukan kloning gen Pab pengkode 38 kDa dari
M,tuberculosis ke vektor ekspresi. Diharapkan klon
rekombinan tersebut dapat diekspresi dan diproduksi
menjadi protein, sehingga dapat dipakai sebagai
antigen untuk melengkapi uji imunodiagnostik TB
yang sudah ada di Indonesia.
2. Metode
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini
adalah primer Pab, agarosa, PCR Mix, pQE30, E.coli
BL 21, ampisilin, Qiagen Kit, GFX Kit, enzim restriksi
Tahapan penelitian untuk kloning gen Pab pengkode
antigen 38 kDa ke vektor ekspresi pQE30 dapat
dilakukan sebagai berikut:
2.1 Subklon gen target Pab ke vektor ekspresi
pQE30 pada E.coli BL21 (DE3)
Plasmid rekombinan pGEM-T-pQE30 yang
telah diuji kebenarannya, ditumbuhkan dalam medium
Lowenstein Jensen dengan ampisilin. Selanjutnya
dilakukan isolasi plasmid menggunakan Qiagen Kit.
Tahapan selanjutnya plasmid rekombinan dan vektor
ekspresi pQE30 dipotong dengan enzim restriksi NcoI
dan BamHI. Hasil pemotongan dikarakterisasi dengan
analisis elektroforesis gel agarosa. DNA sisipan
dimurnikan dari gel agarosa dengan kit dan diligasikan
ke vektor ekspresi. Hasil ligasi kemudian di
transformasi ke sel host E.coli BL21 (DE3), sehingga
dihasilkan transforman E.coli BL 21 (DE3) yang
mengandung plasmid rekombinan pQE30-Pab.
Transforman diseleksi pada media yang mengandung
ampisilin.
2.2 Karakterisasi klon rekombinan pQE30Pab
Plasmid rekombinan ditumbuhkan pada
medium LB cair dengan ampisilin. Selanjutnya
dilakukan isolasi plasmid untuk dikarakterisasi
kebenaran DNA sisipannya. Karakterisasi dilakukan
dengan PCR dan pemotongan dengan enzim restriksi.
3. Hasil dan pembahasan
Hasil isolasi plasmid rekombinan pGEM-TPab yang diperoleh pada penelitian sebelumnya dapat
dilihat pada gambar 1.
Tujuan
Penelitian ini bertujuan untuk mengkloning
gen Pab pengkode antigen 38 kDa dari M.tuberculosis
ke vektor ekspresi yang akan menjadi dasar untuk
pengembangan kit diagnosis TB laten berbasis
imunologi.
5000
1000
Gambar 1. Klon rekombinan pGEM-T-Pab
2
Dari gambar 1 terlihat bahwa ada 7 klon
rekombinan pGEM-T-Pab yang berukuran 4993 bp.
Hal ini disebabkan karena ukuran pGEM-T adalah
3000 bp dan gen Pab 1993 bp.
Setelah klon rekombinan dan vektor ekspresi
pQE30 dipotong dengan enzim restriksi NcoI dan
BamHI, diperoleh hasil seperti pada gambar 2.
Karakterisasi terhadap klon rekombinan dilakukan
untuk mengetahui kebenaran DNA sisipan yang telah
dikloning. Karakterisasi dilakukan dengan PCR dan
pemotongan dengan enzim restriksi .
Gambar 4. Karakterisasi DNA sisipan dengan PCR
Gambar 2. Restriksi pQE30 dan pGEM-T-Pab (R1)
Dari gambar 2 terlihat bahwa vektor pQE30 telah
berhasil dipotong dengan sempurna. Hal ini tampak
dari terbentuknya 2 pita. Demikian pula setelah klon
rekombinan dipotong, diperoleh dua pita yaitu vektor
pGEM-T dan DNA sisipan Pab.
Selanjutnya gen Pab diligasi ke vektor
ekspresi pQE30 dan ditransformasi ke sel E.coli BL 21,
yang dapat dilihat pada gambar 3. Dari gambar terlihat
adanya 3 koloni putih yang di dalamnya membawa
plasmid rekombinan pQE30-Pab.
Setelah klon rekombinan pQE30-Pab dikarakaterisasi
dengan PCR, diperoleh pita ukuran 1994 bp yang
merupakan gen Pab.
Karakterisasi klon rekombinan dilakukan pula
dengan pemotongan dengan enzim restriksi, yang
terlihat pada gambar berikut
Gambar 5. Karakterisasi DNA sisipan
dengan pemotongan enzim restriksi
Gambar 3. Transformasi pQE30-Pab ke E.coli BL 21
Dari gambar 5 terlihat klon rekombinan G1 dan G2
sebelum dan sesudah dipotong enzim restriksi, Setelah
terpotong diperoleh DNA sisipan yang merupakan gen
Pab.
3
4. Kesimpulan
Kloning gen Pab Mycobacterium tuberculosis ke
vektor ekspresi pQE30 telah berhasil dilakukan dan
dikarakterisasi kebenaran DNA sisipannya
Daftar Pustaka
Agus, R (2014), Isolasi dan karakterisasi antigen
M.tuberculosis asal Makassar yang reaktif terhadap
serum penderita tuberkulosis dan kontak sebagai
imunodiagnostik tuberkulosis laten, Jurnal Ilmu Alam
dan Lingkungan, Volume 5, No 10, Agustus
Andersen A.B and Egon Bech Hansen, (1989),
Structure and Mapping of Antigenic Domains of
Protein Antigen b, a 38,000-Molecular-Weight Protein
of Mycobacterium tuberculosis, Infection and
Immunity, Vol 57 No 8
Diel R., Robert Loddenkemper, Karen MeywaldWalter, Rene Gottschalk, and Albert Nienhaus, (2009),
Comparative Performance of Tuberculin Skin Test,
QuantiFERON-TB-Gold In Tube Assay, and TSpot.TB Test in contact Investigations for
Tuberculosis, American College of Chest Physicians,
Chest, 135 :1010-1018
Flynn J.L and John Chan, (2001), Tuberculosis:
Latency and Reactivation, Infection and Immunity, Vol
69 No.7, p. 4195–4201
Jasmer R.M, Payam Nahid, and Philip C.Hopewell,
(2002), Latent Tuberculosis Infection, The New
England Journal of Medicine, Vol.347
Kadival G.V., C.D’ Souza, M. Kameswaran and A.M
Samuel, (1997), Mycobacterium tuberculosis 38 kDa
Antigen and Its Encoding Gene-Experience In
Diagnostic Applications, Indian Journal of Clinical
Biochemistry, 12 (Suppl), 68 -71
STIC APPLICATIONS
Menzies D, Madhukar Pai, and George Comstock,
(2007) Meta-analysis: New Tests for the diagnosis of
latent tuberculosis infection: Areas of Uncertainty and
Recommendations for Research, Ann Intern Med. 146
: 340-354
Pinxteren L.A.H, Pernille Ravn, Else Marie Agger,
John Pollock and Peter Andersen, Diagnosis of
Tuberculosis Based on the Two Specific Antigens
ESAT-6 and CFP10, (2000), Clinical and Diagnostic
Laboratory Immunology, Vol 7 No 2, p.155-160
Rosales-Borjas, D.M., Sergio Zambrano-Villa, Martha
Elinos, Harum Kasem, Antonio Osuna, Raul Mancilla,
and Librado Ortiz-Ortiz, 1998, Rapid Screening Test
for Tuberculosis Using a 38 kDa Antigen From
Mycobacterium tuberculosis, Journal of Clinical
Laboratory Analysis 12 : 126-129
4