View/Open - Repository | UNHAS

KLONING GEN Pab PENGKODE ANTIGEN 38 KDA MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS SEBAGAI KIT
DIAGNOSTIK TUBERKULOSIS LATEN
Rosana Agus1, Sjafaraenan, Helmy Widyastuti1 dan A. Arfan Sabran1
Genetika, Jurusan Biologi Fakultas MIPA Universitas Hasanuddin
[email protected], [email protected], [email protected], [email protected]
1Laboratorium
ABSTRAK
Saat ini deteksi TB laten masih dilakukan dengan uji tuberculin skin test (TST). Prinsip uji tuberkulin adalah
timbulnya hipersensitivitas pada seseorang yang terinfeksi M. tuberculosis terhadap komponen tuberkulin yaitu purified
protein derivative (PPD). PPD mengandung kurang lebih 200 antigen mikobakteri, sehingga uji tuberkulin mempunyai
keterbatasan. Misalnya terjadi reaksi positif palsu karena reaksi silang antara PPD dan antibodi yang dihasilkan oleh
vaksinasi BCG atau infeksi dengan mikobakteria bukan TB. Dengan demikian, dibutuhkan reagen diagnostik TB yang
dapat mengidentifikasi individu terinfeksi baru dan laten. Penelitian kami sebelumnya tentang pencarian antigen M.
tuberculosis yang reaktif terhadap serum penderita tuberkulosis dan kontak sebagai imunodiagnostik tuberkulosis laten
telah diperoleh antigen 38 kDa yang dikode oleh gen Pab (protein antigen b)..
Tujuan penelitian ini adalah untuk mengkloning gen Pab yang akan menjadi dasar pengembangan kit diagnosis TB laten
berbasis imunologi. Metode yang digunakan adalah mengisolasi gen Pab dengan PCR, meligasi ke vektor kloning
pGEM-T dan mentransformasi ke sel host E.coli JM 109. Karakterisasi klon rekombinan dilakukan dengan PCR dan
sekuensing. Hasil penelitian diperoleh bahwa gen Pab berukuran 1993 bp, dan setelah karakterisasi klon rekombinan
diketahui bahwa DNA sisipannya adalah benar gen Pab.
Kata kunci: antigen, 38 kDa, Mycobacterium tuberculosis, TB laten, kloning, gen Pab
ABSTRACT
Detection of latent TB is still done with the tuberculin test skin test (TST). The principle of tuberculin test is the
presence of hypersensitivity to someone who is infected M. tuberculosis of the components of the tuberculin are purified
protein derivative (PPD). PPD contains approximately 200 mycobacterial antigens, so that the tuberculin test has
limitations . For example, false-positive reactions due to cross-reaction between PPD and the antibodies produced by
BCG vaccination or infection with mycobacteria is not TB . Therefore the availability of TB diagnostic reagents that can
identify new and latently infected individuals. Our research on the search antigen M. tuberculosis as latent tuberculosis
imunodiagnostic obtained antigen 38 kDa encoded by the gene Pab ( protein antigen b ) .
The purpose of this study was to clone the gene Pab which to base the development kit based immunological diagnosis
of latent TB. The method used was Pab isolate genes by PCR , ligating into cloning vector pGEM-T and transformed
into JM 109 E. coli host cells . Characterization of recombinant clones performed by PCR and sequencing . The result
showed that the Pab gene size 1993 bp , and after characterization of recombinant clones is known that the DNA insert
is correct Pab gene;
Keywords : antigen, 38 kDa , Mycobacterium tuberculosis , latent TB , cloning , gene Pab
PENDAHULUAN
Di negara berkembang termasuk Indonesia, diagnostik tuberkulosis (TB) dilakukan secara
mikroskopik pada sputum untuk melihat keberadaan dan jumlah basil tahan asam (BTA). Namun
tantangan utama dalam pengendalian TB adalah bagaimana mendiagnosis secara cepat dan tepat
infeksi TB khususnya TB laten. Menurut Flynn and Chan, 2001 bahwa sekitar 5-10% penduduk
dengan TB laten, akan menjadi TB aktif. Sampai saat ini deteksi infeksi TB laten tidak memiliki
standar baku, dan masih dilakukan dengan uji tuberculin skin test (TST) (Menzies et al., 2007).
Prinsip uji tuberkulin adalah timbulnya hipersensitivitas pada seseorang yang terinfeksi M.
tuberculosis terhadap komponen tuberkulin dari bakteri tersebut yaitu purified protein derivative
(PPD). Uji tersebut dilakukan dengan menyuntikan 0,1 ml (5 tuberkulin unit) PPD secara
intrakutan. Hasil dapat dilihat 48-72 jam setelah penyuntikan dengan mengamati ada atau tidaknya
indurasi pada kulit dengan mengukur diameter indurasi (Jasmer et al., 2002).
PPD mengandung 200 antigen mikobakteri, antara lain M.tuberculosis kompleks (M.
tuberculosis, M. bovis dan M.africanum), mikobakteri bukan tuberkulosa (NTM) dan M. bovis BCG
( Pinxteren et.al, 2000). Akibatnya uji tuberkulin mempunyai beberapa keterbatasan yaitu terjadi
reaksi positif palsu karena adanya reaksi silang antara PPD dan antibodi yang dihasilkan oleh
vaksinasi BCG atau infeksi dengan mikobakteria bukan TB (Diel et al., 2009). Dengan demikian,
ketersediaan reagen diagnostik untuk TB sangat diperlukan yang secara ideal dapat
mengidentifikasi individu terinfeksi baru dan laten dengan resiko tinggi untuk berkembang menjadi
tuberkulosis aktif.
Penelitian kami tentang pencarian antigen M. tuberculosis yang reaktif terhadap serum
penderita tuberkulosis dan kontak sebagai imunodiagnostik tuberkulosis laten telah diperoleh
antigen 38 kDa. Antigen 38 Mycobacterium tuberculosis merupakan phosphate binding protein
yang dikode oleh gen Pab (protein antigen b) yang berukuran 1993 bp (Andersen and Hansen,
1989).
Pada penelitian Kadival et al., 1997 diketahui bahwa antigen 38 kDa dari M.tuberculosis
memiliki respons sangat immunodominan terhadap sel B dan sel T. Menurut Rosales-Borjas et al.,
1998 bahwa antigen 38 kDa spesifik pula pada M.tuberculosis complex dan bersifat sangat
immunogenik, sehingga berpotensi untuk dikembangkan menjadi alat deteksi tuberkulosis melalui
kulit.
Tujuan penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk mengkloning gen Pab dari M.tuberculosis yang akan menjadi dasar
untuk pengembangan kit diagnosis TB laten berbasis imunologi.
BAHAN DAN METODE PENELITIAN
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah isolat klinis dari M.tuberculosis yang
dikultur dalam medium Lowestein Jensen, kit ekstraksi DNA kromosom, primer Ag 38, agarosa,
PCR Mix, pGEM-T, E.coli JM 109, ampisilin, X-Gal, IPTG, Qiagen Kit, GFX Kit
Tahapan penelitian untuk kloning gen Pab pengkode antigen 38 kDa dilakukan sebagai
berikut:
1. Dekontaminasi Sputum
Sputum penderita TB didekontaminasi dengan menambahkan zat dekontaminan yaitu
NaOH, Sodium sitrat dan N asetil-L-sistein, kemudian disentrifugasi pada 12.000 rpm. Endapan
diencerkan dengan Phosphate Buffer Saline (PBS) atau akuades steril. Sputum siap untuk di kultur
dalam medium Lowestein Jensen.
2. Kultur M. tuberculosis
Dilakukan dalam medium Lowenstein Jensen yang terdiri dari Monopotassium dehydrogen
phosphate, Magnesium sulfate-heptahydrate dan Tri-Magnesium dicitrate-4-hydrate). Ditambahkan
pula L-Asparagin, Potato flour, Malachite green dan gliserol. Selanjutnya disterilkan dalam
autoclave, dan setelah dingin ditambahkan telur ayam kampung. Medium LJ dipadatkan pada
suhu 860C, 45 menit selama 2 hari.
3. Pewarnaan Ziehl Neelsen (ZN)
Koloni diperiksa kebenarannya dengan pewarnaan Ziehl Neelsen. Gelas objek ditempatkan
pada rak yang tersedia dan dituangkan zat warna Ziehl’s karbol fuchsin 0,3%. Selanjutnya di
bawah gelas objek dilewatkan nyala api sebanyak tiga kali selama 5 menit. Sediaan dicuci dengan
air mengalir sampai zat warna terbuang. Diteteskan lagi HCl alkohol 3% selama 3 menit kemudian
dicuci dengan air mengalir. Pewarnaan dilakukan dengan metilen biru 0,3% selama 3 menit,
kemudian dicuci dengan air mengalir dan dibiarkan kering.
4. Isolasi DNA kromosom
Isolasi DNA kromosom Mycobacterium tuberculosis dilakukan dengan metode Boom. Ke
dalam 100 µl sampel ditambahkan 900 µl buffer lisis L6, sentrifugasi 12.000 rpm selama 10 menit.
Selanjutnya supernatan ditambahkan dengan 20 µl celite, sentrifugasi 15 detik. Endapan dicuci
dengan 1 ml buffer L2 sebanyak dua kali. Kemudian dicuci dengan 1 ml etanol 70%, dan 1 ml
aseton masing-masing dua kali. Endapan dilarutkan dengan menambahkan buffer TE.
5. Perancangan dan sintesis primer untuk amplifikasi gen Pab pengkode antigen 38 kDa
Amplifikasi gen Pab dilakukan dengan teknik PCR menggunakan sepasang primer spesifik.
Urutan
primer
yang
digunakan
dalam
penelitian
ini
adalah
pabF224
(5’GGCGGCCATGGGCTCGAAACCACCGAGCGG-3’)
dan
pab1342
dengan
urutan
(5’CCAGCAGGATCCGCAAAGCAGCCCGATGGC-3’) (Chang et al., 1994).
6. Amplifikasi gen Pab pengkode antigen 38 kDa dengan PCR
Reaksi rantai polimerase berantai (PCR) bertujuan untuk memperbanyak gen Pab
pengkode antigen 38 kDa. Komponen reaksi PCR sejumlah 25μL dibuat dengan mereaksikan 1 μL
primer forward (10pmol), 1 μL primer reverse (10pmol), dan 3μL DNA hasil isolasi dan digenapkan
dengan Master Mix go Taq green.
Kondisi PCR yang digunakan adalah pra denaturasi 900C selama 5 menit, denaturasi awal
o
94 C selama 30 detik, penempelan primer 55oC selama 30 detik, dan elongasi pada 72oC selama
30 detik. Pemanjangan fragmen DNA akhir pada 72oC selama 7 menit dan reaksi dilakukan
sebanyak 25 siklus.
7. Kloning gen ke vektor kloning pGEM-T
Untuk menyimpan dan mengkararakterisasi keseluruhan urutan nukleotida dari gen
pengkode antigen target, maka gen hasil amplifikasi dikloning ke vektor kloning pGEM-T. Produk
PCR diisolasi dari gel agarosa dengan KIT kolom GFX kemudian diligasi ke vektor kloning pGEMT. Hasil ligasi ditransformasikan ke E. coli JM109 dan diseleksi dengan media seleksi yang
mengandung ampisilin, X-Gal dan IPTG. Koloni yang mengandung pGEM-T dengan DNA sisipan
gen Pab akan berwarna putih. Sedangkan koloni biru merupakan E.coli yang hanya membawa
plasmid pGEM-T tanpa gen Pab.
8. Karakterisasi klon rekombinan
Karakterisasi klon rekombinan dilakukan dengan mengisolasi koloni putih dengan Qiagen
Plasmid KIT. Karakterisasi dilakukan dengan melakukan PCR pada klon rekombinan. Penentuan
urutan nukleotida gen Pab sebagai DNA sisipan dilakukan dengan sekuensing. Hasil sekuensing
DNA kemudian dihomologikan dengan urutan pada Bank data untuk diketahui tingkat homologinya
dengan bantuan program BLAST pada website NCBI.
HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Isolat Mycobacterium tuberculosis
Pada penelitian ini asal bakteri Mycobacterium tuberculosis diperoleh dari sputum
penderita TB. Selanjutnya dilakukan dekontaminasi sputum agar kuman berkelompok, sehingga
lebih mudah mendapatkan mikobakteria dalam jumlah besar. Tindakan dekontaminasi juga
diperlukan untuk membunuh kuman selain mikobakteria misalnya flora normal dan jamur.
Kultur M.tuberculosis dilakukan dalam medium Lowenstein-Jensen (LJ). Medium LJ
merupakan medium berbasis telur yang dilengkapi dengan asam lemak dan protein untuk
metabolisme mikobakteria. Gliserol menjadi sumber karbon dan energi, sedangkan asparagin
untuk sumber nitrogen dan stimulasi pertumbuhan. Koagulasi albumin telur diperlukan untuk
mengentalkan medium cair, dan malachite green berperan untuk menghalangi kontaminan
Selanjutnya dilakukan pewarnaan Ziehl-Neelsen (ZN) untuk menguji keberadaan
Mycobacterium tuberculosis. Hal ini disebabkan karena mikobakteri lain seperti M. fortuitum, M.
triviale, M. chelonei dan beberapa strain M. flavescens dapat tumbuh pada medium ini (Condalab,
1990).
B. Isolasi kromosom M.tuberculosis
Isolasi kromosom pada penelitian ini dilakukan dengan menggunakan teknik Boom yang
diperkenalkan oleh Boom et.al, 1990. Metode ini berdasarkan proses lisis dari sel dan
menginaktifkan sifat nuklease dengan agen ”chaotropic” yaitu guanidium thiocynate (GuSCN).
Selanjutnya asam nukleat akan bergabung dengan partikel silika atau diatom yang terdapat dalam
reagen tersebut. Diatom merupakan bahan yang mengikat DNA dan berasal dari fosil dinding sel
alga uniseluler.
C. Amplifikasi gen Pab pengkode antigen 38 kDa
Hasil amplifikasi gen Pab dengan PCR menggunakan primer spesifik diperoleh hasil seperti
pada gambar 1.
Gambar 1. Produk PCR
gen Pab ukuran 1993 bp
Dari gambar terlihat produk PCR berada di atas 1000 bp, tepatnya berukuran 1993 bp. Hal
ini sesuai dengan data dari GenBank bahwa gen Pab yang mengkode antigen 38 kDa terdiri dari
1993 bp. Produk PCR tersebut selanjutnya menjadi gen target untuk di ligasi ke vektor kloning
D. Ligasi gen Pab dengan vektor kloning pGEM-T
Kloning dilakukan agar gen Pab dapat diperoleh dalam jumlah banyak. Pada penelitian ini
digunakan vektor kloning pGEM-T karena memiliki daerah Origin of Replication (ORI) untuk
fragmen DNA sisipan. Selain itu vektor pGEM-T memiliki situs gen resisten Ampisilin (Ampr) dan
gen lacZ yang berperan dalam skrining biru-putih pada saat transformasi ke sel kompeten
Escherichia coli JM 109.
Hasil ligasi DNA orf ESAT-6 ke vektor kloning pGEM-T diperoleh plasmid rekombinan
seperti terlihat pada gambar 2.
1
2
2
5000
pGEM-T-Pab
3000
00
Gambar 2. Ligasi gen Pab ke dalam pGEM-T
Dari gambar di atas tampak bahwa DNA sisipan Pab telah berhasil diligasi ke vektor
kloning pGEM-T. Hal ini terbukti dari kolom 2 bahwa ukuran pGEM-T-Pab berukuran lebih dari
3000 pb, berarti plasmid pGEM-T telah tersisipi dengan DNA sisipan Pab
E. Transformasi pGEM-T- Pab ke dalam sel kompeten (Escherichia coli JM 109)
Transformasi dilakukan menggunakan sel kompeten Escherichia coli JM 109 yang
berfungsi sebagai organisme yang akan memperbanyak plasmid rekombinan pGEM-T-Pab. Hasil
transformasi diperoleh koloni bakteri berwarna putih dan koloni biru pada cawan petri yang berisi
medium LB padat, X-gal, IPTG dan ampisilin seperti terlihat pada gambar 3. Koloni putih
menandakan bahwa DNA sisipan telah berhasil disisipkan ke vektor, sedang koloni biru berarti
DNA sisipan tidak berhasil diligasikan ke vektor.
1
2
Gambar 3. Hasil transformasi dan skrining biru putih.
Keterangan : 1 = koloni putih; 2 = koloni biru
Medium LB padat yang sudah ditambahkan antibiotik ampisilin, isopropyl β-D-1thiogalactopyranoside (IPTG), dan X-Gal, dapat digunakan sebagai medium seleksi pertumbuhan
sel kompeten yang di transformasi. Ampisilin berfungsi sebagai media seleksi pertama, karena
bakteri yang akan tumbuh adalah bakteri yang memiliki gen resistensi ampisilin, yaitu E. coli yang
mengandung pGEM-T. Penambahan IPTG dimaksudkan sebagai induser transkripsi pada gen
operon lac yaitu lacZ.
Gen lacZ akan mengkode suatu enzim β-galaktosidase yang berfungsi memecah laktosa
menjadi glukosa dan galaktosa. Kehadiran enzim β-galaktosidase dalam metode ini dideteksi
dengan adanya pemecahan substrat X-gal (5-bromo-4chloro-3-indolyl-β-D-galactactoside) yang
tidak berwarna menjadi galaktosa dan 5-bromo-4-chloroindigo yang berwarna biru (Madigan and
Martinko, 2005). Adanya enzim β-galaktosidase aktif menghasilkan koloni sel bakteri yang
berwarna biru yang menunjukan tidak adanya DNA sisipan di dalam plasmid vektor. Sebaliknya,
sel yang tidak memiliki aktivitas enzim β-galaktosidase akan menghasilkan koloni sel bakteri yang
berwarna putih. Hal ini disebabkan adanya sisipan fragmen DNA terletak di antara gen lacZ
sehingga fragmen DNA akan menginaktifkan ekspresi dari gen lacZ sehingga enzim βgalaktosidase tidak akan terbentuk .
Koloni E. coli yang berwarna putih (sel transforman) menunjukan DNA pengkode Pab telah
diligasi pada daerah MCS (multi cloning site) yang terdapat pada gen lacZ pGEM-T. Sisipan
fragmen DNA ini akan menghambat gen lacZ untuk mengkode subunit β-galactosidase, sehingga
enzim tersebut tidak dapat mendegradasi substrat galaktosa yang tersedia. Koloni bakteri
berwarna biru, tidak memiliki fragmen DNA sisipan sehingga dapat mendegradasi substrat
galaktosa yang tersedia.
F. Karakterisasi plasmid rekombinan pGEM-T-Pab
1. Analisis DNA Sisipan gen Pab dengan PCR
Analisis terhadap DNA sisipan gen Pab dilakukan dengan PCR. Produk PCR terlihat adanya
satu pita DNA dengan ukuran 1993 bp. Hasil PCR ini membuktikan bahwa DNA plasmid dari
koloni putih terdapat DNA sisipan berupa orf ESAT-6.
Gambar 4. Produk PCR gen Pab
sebagai DNA sisipan
2. Analisis DNA sisipan gen Pab dengan sekuensing
Sekuensing dilakukan untuk menentukan apakah gen yang diisolasi dari klon rekombinan
adalah benar Pab. Hasil sekuensing menggunakan primer Pab yang dikonfirmasi dengan analisa
BLAST diperoleh hasil seperti berikut :
Score
Expect
1642 bits(889)
0.0
Query
43
Sbjct
278
Query
103
Sbjct
338
Query
163
Sbjct
398
Query
223
Sbjct
458
Query
283
Sbjct
518
Query
343
Sbjct
578
Query
403
Sbjct
638
Query
463
Sbjct
698
Query
523
Sbjct
758
Query
583
Sbjct
818
Query
643
Sbjct
878
Query
703
Sbjct
938
Query
763
Sbjct
998
Query
822
Sbjct
1057
Query
881
Sbjct
1117
Query
941
Sbjct
1176
Identities
Gaps
Strand
914/930(98%) 5/930(0%) Plus/Plus
GCGACTACCCCCGCGTCGTCGCCGGTGACGTTGGCGGAGACCGGTAGCACGCTGCTCTAC
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
GCGACTACCCCCGCGTCGTCGCCGGTGACGTTGGCGGAGACCGGTAGCACGCTGCTCTAC
CCGCTGTTCAACCTGTGGGGTCCGGCCTTTCACGAGAGGTATCCGAACGTCACGATCACC
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
CCGCTGTTCAACCTGTGGGGTCCGGCCTTTCACGAGAGGTATCCGAACGTCACGATCACC
102
337
162
397
GCTCAGGGCACCGGTTCTGGTGCCGGGATCGCGCAGGCCGCCGCCGGGACGGTCAACATT
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
GCTCAGGGCACCGGTTCTGGTGCCGGGATCGCGCAGGCCGCCGCCGGGACGGTCAACATT
222
GGGGCCTCCGACGCCTATCTGTCGGAAGGTGATATGGCCGCGCACAAGGGGCTGATGAAC
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
GGGGCCTCCGACGCCTATCTGTCGGAAGGTGATATGGCCGCGCACAAGGGGCTGATGAAC
282
ATCGCGCTAGCCATCTCCGCTCAGCAGGTCAACTACAACCTGCCCGGAGTGAGCGAGCAC
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
ATCGCGCTAGCCATCTCCGCTCAGCAGGTCAACTACAACCTGCCCGGAGTGAGCGAGCAC
342
CTCAAGCTGAACGGAAAAGTCCTGGCGGCCATGTACCAGGGCACCATCAAAACCTGGGAC
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
CTCAAGCTGAACGGAAAAGTCCTGGCGGCCATGTACCAGGGCACCATCAAAACCTGGGAC
402
GACCCGCAGATCGCTGCGCTCAACCCCGGCGTGAACCTGCCCGGCACCGCGGTAGTTCCG
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
GACCCGCAGATCGCTGCGCTCAACCCCGGCGTGAACCTGCCCGGCACCGCGGTAGTTCCG
462
CTGCACCGCTCCGACGGGTCCGGTGACACCTTCTTGTTCACCCAGTACCTGTCCAAGCAA
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
CTGCACCGCTCCGACGGGTCCGGTGACACCTTCTTGTTCACCCAGTACCTGTCCAAGCAA
522
GATCCCGAGGGCTGGGGCAAGTCGCCCGGCTTCGGCACCACCGTCGACTTCCCGGCGGTG
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
GATCCCGAGGGCTGGGGCAAGTCGCCCGGCTTCGGCACCACCGTCGACTTCCCGGCGGTG
582
CCGGGTGCGCTGGGTGAGAACGGCAACGGCGGCATGGTGACCGGTTGCGCCGAGACACCG
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
CCGGGTGCGCTGGGTGAGAACGGCAACGGCGGCATGGTGACCGGTTGCGCCGAGACACCG
642
GGCTGCGTGGCCTATATCGGCATCAGCTTCCTCGACCAGGCCAGTCAACGGGGACTCGGC
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
GGCTGCGTGGCCTATATCGGCATCAGCTTCCTCGACCAGGCCAGTCAACGGGGACTCGGC
702
GAGGCCCAACTAGGCAATAGCTCTGGCAATTTCTTGTTGCCCGACGCGCAAAGCATTCAG
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
GAGGCCCAACTAGGCAATAGCTCTGGCAATTTCTTGTTGCCCGACGCGCAAAGCATTCAG
457
517
577
637
697
757
817
877
937
762
997
GCCGCGGCGGCTGGCTTCGCATCG-AAACCCCGGCGAACCAGGCGATTTTCNATGATCGA
|||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||| |||| ||||||||
GCCGCGGCGGCTGGCTTCGCATCGAAAACCCCGGCGAACCAGGCGA-TTTCGATGATCGA
821
CGGGCCCGCCCCGGACGN-TACCCGATCATCAACTACGAGTACGCCATCGTCAACAACCG
||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
CGGGCCCGCCCCGGACGGCTACCCGATCATCAACTACGAGTACGCCATCGTCAACAACCG
880
GCAAANGGACGNCGCCACCGCGCAGANCNTGNNGGCNTTTCTGCACTGGGGCGATCACCG
||||| ||||| |||||||||||||| | || ||| |||||||||| ||||||||||||
GCAAAAGGACGCCGCCACCGCGCAGACCTTGCAGGCATTTCTGCACT-GGGCGATCACCG
ACGGCAACCAGGCCTCGATTCCTCGANCAG
|||||||| |||||||| |||||||| |||
ACGGCAACAAGGCCTCG-TTCCTCGACCAG
970
1204
Gambar 5. Hasil BLAST gen Pab
1056
1116
940
1175
Hasil analisa BLAST menunjukkan bahwa homologi gen Pab hasil kloning dengan gen
Bank adalah 98%. Hal ini menunjukkan bahwa DNA sisipan adalah benar gen Pab.
KESIMPULAN
Hasil kloning gen Pab yang mengkode antigen 38 kDa dari Mycobacterium tuberculosis ke
vektor kloning pGEM-T dan transformasi ke sel Escherichia coli JM 109, diperoleh 3 koloni putih.
Setelah dikarakterisasi dengan PCR dan sekuensing diperoleh bahwa DNA sisipan yang diligasi
adalah benar gen Pab.
UCAPAN TERIMA KASIH
Pada kesempatan ini, peneliti menyampaikan terima kasih kepada Kementerian Pendidikan
Nasional yang mendanai penelitian ini melalui BOPTN 2013.
DAFTAR PUSTAKA
 Andersen A.B and Egon Bech Hansen, 1989, Structure and Mapping of Antigenic Domains
of Protein Antigen b, a 38,000-Molecular-Weight Protein of Mycobacterium tuberculosis,
Infection and Immunity, Vol 57 No 8
 Boom, R. C.J.A, Sol, M.M.M, Salimans, C. L Jansen, P.M.E. Wertheim-van Dillen and J.van
Der Noordaa, 1990, Rapid and Simple Method for Purification of Nucleic acids, J. of
Clinical Microbiology, p 495-503
 Rosales-Borjas, D.M., Sergio Zambrano-Villa, Martha Elinos, Harum Kasem, Antonio
Osuna, Raul Mancilla, and Librado Ortiz-Ortiz, 1998, Rapid Screening Test for Tuberculosis
Using a 38 kDa Antigen From Mycobacterium tuberculosis, Journal of Clinical Laboratory
Analysis 12 : 126-129
 Chang Zengyi, Abba Choudhary, Raju Lathigra and Florante A. Quiocho, 1994, The
Immunodominant 38 kDa Lipoprotein Antigen of Mycobacterium tuberculosis is a
Phosphate binding Protein, The Journal of Biological Chemistry Vol 269 No3
 Condalab, 1990, Lowenstein-Jensen Medium Base, Cat : 1116
 Diel R., Robert Loddenkemper, Karen Meywald-Walter, Rene Gottschalk, and Albert
Nienhaus, 2009, Comparative Performance of Tuberculin Skin Test, QuantiFERON-TBGold In Tube Assay, and T-Spot.TB Test in contact Investigations for Tuberculosis,
American College of Chest Physicians, Chest, 135 :1010-1018
 Flynn J.L and John Chan, 2001, Tuberculosis: Latency and Reactivation, Infection and
Immunity, Vol 69 No.7, p. 4195–4201
 Jasmer R.M, Payam Nahid, and Philip C.Hopewell, 2002, Latent Tuberculosis Infection,
The New England Journal of Medicine, Vol.347
 Kadival G.V., C.D’ Souza, M. Kameswaran and A.M Samuel, 1997, Mycobacterium
tuberculosis 38 kDa Antigen and Its Encoding Gene-Experience In Diagnostic Applications,
Indian Journal of Clinical Biochemistry, 12 (Suppl), 68 -71
 Madigan dan Martinko, 2005, Brock Biology of Microorganisms 11th edition. San Fransisco :
Benjamin Cummings
 Menzies D, Madhukar Pai, and George Comstock, Meta-analysis: New Tests for the
diagnosis of latent tuberculosis infection: Areas of Uncertainty and Recommendations for
Research, Ann Intern Med. 2007; 146 : 340-354
 Pinxteren L.A.H, Pernille Ravn, Else Marie Agger, John Pollock and Peter Andersen,
Diagnosis of Tuberculosis Based on the Two Specific Antigens ESAT-6 and CFP10, 2000,
Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology, Vol 7 No 2, p.155-160