OPTIMASI DAN VALIDASI KONDISI POLYMERASE CHAIN
advertisement
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI OPTIMASI DAN VALIDASI KONDISI POLYMERASE CHAIN REACTION PADA IDENTIFIKASI CYP2A6*9 SKRIPSI Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) Program Studi Farmasi Oleh : Cindy NIM : 138114127 FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2017 i PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI OPTIMASI DAN VALIDASI KONDISI POLYMERASE CHAIN REACTION PADA IDENTIFIKASI CYP2A6*9 SKRIPSI Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) Program Studi Farmasi Oleh : Cindy NIM : 138114127 FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2017 ii PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Persetujuan Pembimbing OPTIMASI DAN VALIDASI KONDISI POLYMERASE CHAIN REACTION PADA IDENTIFIKASI CYP2A6*9 Skripsi yang diajukan oleh : Cindy NIM : 138114127 telah disetujui oleh Pembimbing ( Dr. Christine Patramurti, M.Si., Apt.) tanggal 18 November 2016 iii PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Pengesahan Skripsi Berjudul OPTIMASI DAN VALIDASI KONDISI POLYMERASE CHAIN REACTION PADA IDENTIFIKASI CYP2A6*9 Oleh : Cindy NIM : 138114127 Dipertahankan di hadapan Panitia Penguji Skripsi Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma pada tanggal 4 Januari 2017 Mengetahui Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Dekan (Aris Widayati, Ph.D., Apt.) Panitia Penguji : Tanda tangan 1. Dr. Christine Patramurti, M.Si., Apt. ....................... 2. Damiana Sapta Candrasari, M.Sc. ....................... 3. Maywan Hariono, Ph.D., Apt. ....................... iv PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI HALAMAN PERSEMBAHAN 我的世界 For My Soul, Papa, Mama, Hendrikus, Diana Fransiska, Lidya Natalia, Steven and Kevin, who let me write my own story. v PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ILMIAH UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS Yang bertanda tangan di bawah ini, saya mahasiswa Universitas Sanata Dharma : Nama : Cindy Nomor Mahasiswa : 138114127 Demi pengembangan ilmu pengetahuan, saya memberikan kepada Perpustakaan Universitas Sanata Dharma karya ilmiah saya yang berjudul : OPTIMASI DAN VALIDASI KONDISI POLYMERASE CHAIN REACTION PADA IDENTIFIKASI CYP2A6*9 beserta perangkat yang diperlukan (bila ada). Dengan demikian saya memberikan kepada Perpustakaan Universitas Sanata Dharma hak untuk menyimpan, mengalihkan dalam bentuk media lain, mengelolanya dalam bentuk pangkalan data, mendistribusikan secara terbatas, dan mempublikasikannya di Internet atau media lain untuk kepentingan akademis tanpa perlu meminta ijin dari saya maupun memberikan royalti kepada saya selama tetap mencantumkan nama saya sebagai penulis. Demikian pernyataan ini yang saya buat dengan sebenarnya. Dibuat di Yogyakarta Pada tanggal : 18 November 2016 Yang menyatakan ( Cindy ) vi PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PRAKATA Penulis menghaturkan puji syukur ke hadirat Tuhan Yang Maha Esa, karena atas berkat dan rahmat-Nya, penulis dapat menyelesaikan skripsi yang berjudul "Optimasi dan Validasi Kondisi Polymerase Chain Reaction pada Identifikasi CYP2A6*9" untuk memenuhi persyaratan memperoleh gelar Sarjana Farmasi (S. Farm) Program Studi Farmasi Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma. Penyusunan skripsi ini tidak terlepas dari dukungan berbagai pihak. Pada kesempatan ini, penulis menyampaikan terima kasih kepada: 1. Ibu Aris Widayati, Ph. D., Apt., selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma 2. Ibu Dr. Christine Patramurti, M.Si., Apt., selaku dosen pembimbing atas segala bimbingan, saran, dan nasihat kepada penulis 3. Ibu Damiana Sapta Candrasari, M.Sc., selaku dosen penguji atas bantuan, kritik dan saran kepada penulis 4. Bapak Maywan Hariono, Ph. D., Apt., selaku dosen penguji atas bantuan, kritik dan saran kepada penulis 5. Bapak Jeffry Julianus, M. Si., atas segala ilmu, bimbingan, motivasi, dan dukungan kepada penulis 6. Ibu Dita Maria Virginia, M. Sc., Apt., selaku Dosen Pembimbing Akademik penulis 7. Ibu dr. Elsa Herdiana Murhandarwati, M. Kes., Ph. D., selaku supervisor penulis selama penelitian di Laboratorium Parasitologi Fakultas Kedokteran UGM 8. Ibu Rumbiwati, M.Sc., selaku teknisi Laboratorium Parasitologi Fakultas Kedokteran UGM atas bantuan dan petunjuk selama penelitian 9. Sr. Yenny Baptista, KFS atas segala bantuan dan dukungan sejak penulis berada di bangku SMP 10. Kementerian Pendidikan dan Kebudayaan Republik Indonesia atas Program Beasiswa yang diberikan kepada penulis vii PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 11. Segenap civitas akademika Universitas Sanata Dharma yang telah memberikan wawasan dan motivasi kepada penulis selama perkuliahan 12. Dewan Perwakilan Mahasiswa Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma periode 2014, 2015, 2016 13. Keluarga tercinta yang telah memberikan segalanya kepada penulis 14. Sahabat sejak semester pertama: Jessy Florensia, Indriyani Permatasari, Regina Hiacinta Eva Angelista, dan Putu Ririn Andreani 15. "Tim PICS Sadhar": Kenny Kowira, Bernadetta Inez Ludwinia, Yolanda Tyas Prameswari, dan Donny Soeparto 16. MCL: Jonathan Ronny Kurniawan, dan Suryatmoko Agung 17. Partner lomba: Pricella, Erica Kusuma Rahayu Sudarsono 18. Kirana Andranilla, Ivana Tunggal, Monita Natalia Siregar, Ineke Andrayani, Nadia Okky Luciana, Trensia Imel atas kebaikan dan ketulusannya 19. Teman-teman FSM C 2013 dan FST 2013, beserta seluruh teman-teman angkatan 2013 Prodi S1 Farmasi Universitas Sanata Dharma atas segala proses dan dinamika bersama selama masa perkuliahan 20. Seluruh pihak yang tidak dapat disebutkan satu per satu atas bantuan secara langsung maupun tidak langsung selama penyusunan skripsi Penulis menyadari bahwa skripsi ini masih memiliki banyak kekurangan sehingga segala saran, kritik dan masukan sangat diharapkan. Penulis berharap skripsi ini dapat bermanfaat dalam perkembangan ilmu pengetahuan, khususnya di bidang kesehatan. Yogyakarta, 18 November 2016 Penulis viii PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PERNYATAAN KEASLIAN KARYA Saya menyatakan dengan sesungguhnya bahwa skripsi yang saya tulis ini tidak memuat karya atau bagian karya orang lain, kecuali yang telah disebutkan dalam kutipan dan daftar pustaka, sebagaimana layaknya karya ilmiah. Apabila di kemudian hari ditemukan indikasi plagiarisme dalam naskah ini, maka saya bersedia menanggung segala sanksi sesuai peraturan perundangundangan yang berlaku. Yogyakarta, 18 November 2016 Penulis (Cindy) ix PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI DAFTAR ISI HALAMAN SAMPUL....................................................................................... i HALAMAN JUDUL........................................................................................... ii HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING................................................. iii HALAMAN PENGESAHAN............................................................................ iv HALAMAN PERSEMBAHAN......................................................................... v PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI............................................... vi PRAKATA......................................................................................................... vii PERNYATAAN KEASLIAN KARYA............................................................ ix DAFTAR ISI...................................................................................................... x DAFTAR GAMBAR.......................................................................................... xi DAFTAR LAMPIRAN....................................................................................... xii ABSTRAK.......................................................................................................... xiii ABSTRACT.......................................................................................................... xiv PENDAHULUAN............................................................................................. 1 METODE PENELITIAN................................................................................. 3 HASIL DAN PEMBAHASAN......................................................................... 5 KESIMPULAN................................................................................................. 10 DAFTAR PUSTAKA........................................................................................ 11 LAMPIRAN...................................................................................................... 14 BIOGRAFI PENULIS....................................................................................... 32 x PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI DAFTAR GAMBAR Gambar 1. Hasil analisis kualitatif isolat DNA menggunakan teknik elektroforesis..................................................................................................... 6 Gambar 2. Situs penempelan primer pada sekuen CYP2A6*9...................... 7 Gambar 3. Produk PCR pada berbagai suhu annealing dan siklus Amplifikasi........................................................................................................ 7 Gambar 4. Elektroforegram produk PCR pada kondisi optimum dari berbagai isolat DNA......................................................................................... 9 Gambar 5. Urutan nukleotida produk PCR gen CYP2A6*1 dan CYP2A6*9........................................................................................................ 9 xi PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI DAFTAR LAMPIRAN Lampiran 1. Ethical clearance........................................................................... 15 Lampiran 2. Go Taq Green Master Mix Certificate of Analysis....................... 16 Lampiran 3. Usage Information of Go Taq Green Master Mix....................... 17 Lampiran 4. Product Datasheet of DNA Ladder & Markers............................ 18 Lampiran 5. Hasil Analisis Kualitatif Isolat DNA menggunakan Teknik Elektroforesis...................................................................................................... 19 Lampiran 6. Hasil PCR pada Optimasi Volume Primer.....................................20 Lampiran 7. Simulasi Penempelan Primer pada CYP2A6*1 dengan NCBI....... 21 Lampiran 8. Hasil Uji Reprodusibilitas PCR.................................................... 22 Lampiran 9. Hasil Sekuensing Produk PCR...................................................... 23 Lampiran 10. Tahapan manual editing pada BioEdit.......................................... 24 Lampiran 11. Hasil manual editing pada BioEdit.............................................. 27 xii PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI ABSTRAK CYP2A6 merupakan anggota famili CYP2 dari sitokrom P450 dan diketahui memiliki polimorfisme yang tinggi. CYP2A6*9 merupakan alel CYP2A6 yang mengalami mutasi titik pada TATA box (T-48G) pada ujung '5 sehingga menyebabkan penurunan aktivitas. Adanya polimorfisme pada CYP2A6 dapat dideteksi dengan menggunakan teknik Polymerase Chain Reaction (PCR). Adapun parameter penting yang mempengaruhi spesifisitas reaksi dalam PCR antara lain suhu penempelan primer (annealing) dan jumlah siklus amplifikasi. Primer forward, primer reverse dan reagen yang digunakan dalam penelitian ini berturut-turut adalah 5'-GAT TCC TCT CCC CTG GAA C-3', 5'GGC TGG GGT GGT TTG CCT TTA-3', dan Promega Go Taq Green Master Mix. Suhu annealing dioptimasi dengan pengaturan pada suhu 56 oC, 60oC, dan 64oC, sedangkan siklus amplifikasi pada 25 siklus dan 30 siklus. Adapun kondisi PCR optimum yang didapatkan: initial denaturation pada suhu 94oC selama 3 menit; diikuti dengan 30 siklus terdiri dari denaturation pada suhu 94oC selama 30 detik, annealing pada suhu 60oC selama 30 detik, dan extension pada suhu 70oC selama 25 detik; kemudian diakhiri dengan final extension pada suhu 72oC selama 5 menit. Kondisi ini memenuhi parameter spesifisitas dan reprodusibilitas pada validasi metode analisis. Kata kunci: CYP2A6*9, CYP2A6*1, PCR, optimasi, validasi xiii PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI ABSTRACT CYP2A6 belongs to the CYP2 family of P450 cytochromes is known having a high polymorphism. CYP2A6*9 is an allel of CYP2A6 having point of mutation in TATA box (T-48G) that reduced its activity. The polymorphism of CYP2A6 could be determined using polymerase chain reaction (PCR). There have been a few parameters important for reaction specificity in PCR including annealing temperatures and amplification cycles number. 5'-GAT TCC TCT CCC CTG GAA C-3', 5'-GGC TGG GGT GGT TTG CCT TTA-3', and Promega Go Taq Green Master Mix were used as the forward primer, the reverse primer, and the reagent in these study, respectively. The annealing temperature were optimized by adjusting the temperature at 56oC, 60oC, and 64oC, while the amplification cycles were at 25 cycles and 30 cycles. The PCR was carried out under the following conditions: initial denaturation at 94oC for 3 minutes; 30 cycles of denaturation at 94oC for 30 seconds, annealing at 60oC for 30 seconds, and extension at 70oC for 25 seconds; and subsequently a final extension at 72oC for 5 minutes. These conditions met parameters of specificity and reproducibility on analytical method validation. Keywords: CYP2A6*9, CYP2A6*1, PCR, optimize, validation xiv PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PENDAHULUAN Sitokrom P450 2A6 (CYP2A6) merupakan gen yang mengekspresikan enzim CYP2A6 dan diketahui memiliki polimorfisme yang tinggi. Polimorfisme didefinisikan sebagai variasi bentuk dari gen yang menghasilkan dua atau lebih varian dan masing-masing varian memiliki frekuensi yang cukup tinggi (Maggert, 2012). Saat ini terdapat 80 jenis bentuk polimorfi CYP2A6 yang sudah berhasil diidentifikasi (Sim, 2014). Adanya polimorfisme CYP2A6 akan mempengaruhi aktivitas enzim pada metabolisme senyawa xenobiotik dalam tubuh, baik dengan menurunkan, menghilangkan atau meningkatkan aktivitas enzim (Raunio and Rahnasto-Rilla, 2012). Enzim CYP2A6 bertanggungjawab utama dalam metabolisme nikotin, suatu senyawa yang terkandung dalam rokok (Bloom et al., 2011) dan berperan utama terhadap timbulnya efek ketergantungan fisik terhadap rokok (Baurley et al., 2016). Seorang perokok akan mengalami ketergantungan fisik terhadap rokok karena mempertahankan kadar nikotin dalam plasma sehingga dapat memberi efek psikoaktif yang berkelanjutan (Bloom et al., 2011). Enzim CYP2A6 memetabolisme nikotin menjadi kontinin, yang selanjutnya akan diubah menjadi 3-hidroksikotinin sebagai metabolit tidak aktif (Park et al., 2016). Enzim CYP2A6 turut berpartisipasi dalam metabolisme beberapa senyawa kimia, baik senyawa obat maupun senyawa toksik. Pada umumnya, substrat CYP2A6 relatif polar, dengan berat molekul rendah hingga sedang. Contoh substrat CYP antara lain kumarin, nikotin, metoksifluran, pilokarpin dan efavirenz. Beberapa senyawa prokarsinogen golongan N-nitrosamin dimetabolisme oleh CYP2A6, terutama senyawa spesifik pada tembakau, yaitu 4-(metilnitrosamino)-1-(3-piridil)-1-butanon (NNK) yang dapat diaktivasi menjadi senyawa intermediet melalui reaksi hidroksilasi alfa, yang dapat menyebabkan timbulnya kanker pada jaringan yang terpapar pada asap rokok, yaitu paru-paru dan laring (Raunio and Rahnasto-Rilla, 2012). Polimorfisme CYP2A6 banyak ditemukan pada orang-orang Asia dengan frekuensi alel non aktif yang tinggi (Peamkrasatam et al., 2006; Yusof and Gan, 2009). Pada penelitian genotip enzim CYP2A6 terhadap subyek uji perokok dan bukan perokok suku Jawa Indonesia, diperoleh data bahwa pada populasi yang diteliti ditemukan bentuk alel nonaktif CYP2A6*4 dengan frekuensi yang tinggi. Sebanyak 95% dari subyek uji yang diteliti mempunyai bentuk genotip lain dikategorikan sebagai slow metabolizer (Patramurti et al., 2014). Hasil penelitian menunjukkan bahwa adanya alel non aktif CYP2A6*9 pada 1 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI suatu individu akan menurunkan aktivitas CYP2A6 pada metabolisme nikotin dibandingkan CYP2A6 normal (Yoshida et al., 2003). Seorang perokok yang memiliki alel CYP2A6*9 akan mengalami penurunan ketergantungan fisik terhadap rokok untuk mempertahankan kadar nikotin dalam plasma sehingga tidak memerlukan peningkatan dosis untuk mendapat efek yang sama (Minematsu et al., 2006) yang dapat menurunkan risiko terjadinya berbagai jenis penyakit kanker yang disebabkan oleh asap rokok (Kadlubar et al., 2009; Liu et al., 2013; Wang et al., 2013), sehingga penelitian mengenai identifikasi CYP2A6*9 perlu dilakukan. Polymerase Chain Reaction (PCR) merupakan metode yang dapat digunakan untuk mendeteksi adanya polimorfisme pada suatu gen. PCR merupakan metode molekuler untuk menggandakan potongan DNA hingga berjuta kali lipat dalam waktu yang relatif singkat. Penggandaan tersebut tidak terlepas dari penggunaan enzim dan sepasang primer bersifat spesifik terhadap DNA target yang akan dilipatgandakan (Joko et al., 2011). PCR mampu mengamplifikasi suatu fragmen gen pada templat DNA berdasarkan primer tertentu sehingga dapat diidentifikasi suatu alel dalam sampel DNA (Rahman et al., 2013). Secara garis besar, PCR terdiri dari tiga tahapan utama, yaitu tahap denaturasi templat DNA (denaturation), tahap penempelan primer (annealing) dan tahap pemanjangan DNA (extension). Produk PCR yang dihasilkan dipengaruhi oleh parameter-parameter yang berkontribusi dalam proses PCR, antara lain sepasang primer, dNTPs, buffer PCR, MgCl2, dan enzim polimerase DNA. Ketepatan primer, suhu annealing, dan jumlah siklus amplifikasi merupakan faktor-faktor kritis pada kondisi PCR yang dapat mempengaruhi produk PCR (Ishmael and Stellato, 2008). Adanya penggunaan PCR dengan kondisi yang tidak optimum akan menghasilkan produk yang tidak sesuai dengan produk target, atau bahkan tidak menghasilkan produk (Roux, 2009). Oleh karena itu, optimasi kondisi PCR menjadi penting untuk dilakukan. Pengembangan metode dilakukan melalui tahapan optimasi dan validasi metode. Optimasi metode dilakukan untuk memastikan parameter-parameter penting dalam metode dapat memberikan hasil optimum. Optimasi metode PCR perlu dilakukan untuk mengefisienkan waktu dan bahan sehingga proses deteksi dapat dilakukan dengan cepat dan tepat (Joko et al., 2011). Dalam penelitian ini dilakukan optimasi suhu annealing dan jumlah siklus amplifikasi PCR dengan cara memvariasikan suhu annealing dan jumlah siklus amplifikasi PCR sehingga didapatkan kondisi yang paling sesuai untuk mendapatkan fragmen gen CYP2A6*1. Adanya gen CYP2A6*1 pada subyek uji menunjukkan subyek uji 2 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI memiliki gen CYP2A6 normal yang tidak mengalami polimorfisme berupa Single Nucleotide Polymorphism (SNP) pada TATA box menjadi CYP2A6*9 (Pitarque et al., 2001). Validasi metode dilakukan untuk memastikan bahwa hasil yang didapatkan dari metode optimum telah sesuai dengan tujuan penggunaannya (World Organization of Animal Health, 2013). Validasi metode dalam penelitian ini dilakukan dengan cara sekuensing produk PCR (parameter spesifisitas) dan memastikan kondisi PCR yang digunakan mampu memberikan hasil yang reprodusibel (parameter reprodusibilitas). Visualisasi produk PCR dilakukan dengan teknik elektroforesis. Penelitian ini bertujuan untuk menetapkan kondisi optimum PCR pada identifikasi alel CYP2A6*9 melalui ketiadaan alel CYP2A6*1 serta menetapkan validitas dari metode tersebut. Penelitian ini diharapkan dapat digunakan sebagai acuan pada identifikasi alel CYP2A6*9 melalui ketiadaan alel CYP2A6*1 menggunakan metode PCR dan memberikan kontribusi dalam perkembangan ilmu kesehatan. METODE PENELITIAN Jenis dan Rancangan Penelitian. Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental analitik murni dengan rancangan acak lengkap pola searah. Pada penelitian ini terdapat variabel bebas, variabel tergantung dan variabel pengacau terkendali. Variabel bebas dalam penelitian ini adalah suhu annealing dan jumlah siklus amplifikasi. Variabel tergantung dalam penelitian ini adalah produk PCR yang dideteksi dengan elektroforesis. Variabel pengacau terkendali dalam penelitian ini adalah kemurnian isolat DNA total dan jenis reagen yang digunakan. Dalam penelitian ini dilakukan perlakuan pada subyek uji isolat DNA dan dipaparkan peristiwa yang terjadi akibat perlakuan sehingga terdapat hubungan sebab akibat antara variabel bebas dan variabel tergantung. Bahan. Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah isolat DNA dari populasi suku Jawa Indonesia yang pernah diteliti oleh Patramurti et al. (2014), primer forward: 5'-GATTCCTCTCCCCTGGAAC-3', primer reverse: 5'-GGCTGGGGTGGTTTG CCTTTA-3', Promega Go Taq Green Master Mix (berisi Taq DNA Polymerase, dNTPs, MgCl2, dan buffer), Nuclease-Free Water (Promega), Tris-Borate-EDTA (TBE) Buffer pH 7 (Geneaid), 1% dan 1,5% gel agarose (Geneaid), larutan ethidium bromide (Geneaid) 0,44 mg/mL, 100 bp DNA Ladder (Geneaid), blue orange DNA loading dye (Geneaid), etanol 96% (Sigma Chemical Co., St. Louis), aqua bidestilata steril (Ikapharmindo). Alat. Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah Thermal cycler (Perkin 3 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Elmer 2400), satu set Elektroforesis (Biorad), UV Transilluminator (Fisher Scientific), microwave (National), mikrosentrifuge (Fisher Scientific), kamera Polaroid. Analisis Kualitatif Isolat DNA. Elektroforesis menggunakan agarose 1,0 % dilakukan dengan cara 1,5 g agarose dilarutkan dalam larutan 0,5 x TBE sebanyak 100 mL lalu dipanaskan dalam microwave selama dua menit sampai semua agarose larut kemudian ditambahkan 5 µL larutan EtBr dan dicampur hingga homogen. Larutan dituang ke dalam cetakan gel, diberi sisiran pada tepi gel dan gel dibiarkan mengeras. Sisir dicabut setelah gel mengeras sehingga terbentuk sumur-sumur. Isolat DNA sebanyak 5,0 µL (kadar 50 ng) ditambahkan dengan aquabidest sebanyak 2,0 µL, kemudian dicampur dengan loading dye sebanyak 1,0 µL. Campuran tersebut diambil sejumlah 7,0 µL dan dimasukkan ke dalam sumur-sumur gel menggunakan mikropipet. Satu sumur gel diisi dengan 100 bp DNA ladder sebanyak 2 µL sebagai marker. Gel agarose ini kemudian ditempatkan ke dalam gel tray elektroforesis yang sudah berisi larutan bufer 0,5 x TBE dan diberi tegangan 100 volt selama 30 menit, molekul DNA yang bermuatan negatif pada pH netral akan bergerak ke arah positif. Gel agarose kemudian dideteksi di bawah lampu UV dan didokumentasikan menggunakan kamera Polaroid. Panjang pita DNA dapat diketahui dengan cara menarik garis lurus masing-masing pita sampel DNA dengan posisi pita DNA ladder. Optimasi kondisi PCR pada amplifikasi CYP2A6. Untuk mendapatkan fragmen DNA dari alel CYP2A6*9 dilakukan amplifikasi dengan menggunakan primer yang diadopsi Yoshida et al. (2003), yaitu primer forward: 5'-GAT TCC TCT CCC CTG GAA C-3', primer reverse: 5'-GGC TGG GGT GGT TTG CCT TTA-3'. Optimasi reaksi PCR dilakukan menggunakan Promega Go Taq Green Master Mix. Kadar genomik DNA yang digunakan kira-kira 50 ng dengan volume akhir campuran 25 μL (reagent 12,5 μL, primer forward 1,25 μL, primer reverse 1,25 μL, isolat DNA 5,0 μL, Nuclease-Free Water 5 μL). Penentuan rentang suhu annealing dan jumlah siklus amplifikasi yang dioptimasi dilakukan berdasarkan penelitian Patramurti et al. (2014). Amplifikasi dilakukan dengan mesin PCR (Thermal cycler Perkin Elmer 2400). Kondisi PCR digunakan adalah sebagai berikut: initial denaturasi pada suhu 94˚C (3’); dilanjutkan dengan denaturasi pada suhu 94˚C (30”); annealing pada suhu 56˚C, 60oC, dan 64˚C (30”) dan ekstensi pada suhu 70˚C (25”). Siklus amplifikasi tersebut dilakukan sebanyak 25 dan 30 kali dan selanjutnya diakhiri dengan final ekstensi pada suhu 72˚C (5’). Kondisi optimum PCR ditentukan dengan cara melihat suhu annealing dan jumlah siklus yang dapat mengamplifikasi alel CYP2A6*1 berdasarkan hasil produk PCR yang terdeteksi pada elektrofotogram dengan 4 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI ukuran 368-bp. Adanya gen CYP2A6*1 pada subyek uji menunjukkan subyek uji memiliki gen CYP2A6 normal yang tidak mengalami polimorfisme menjadi CYP2A6*9. Analisis Produk PCR menggunakan Teknik Elektroforesis. Untuk melihat keberhasilan amplifikasi dilakukan elektroforesis dengan fase diam agarosa 1,5% yang telah diwarnai dengan ethidium bromide dan dievaluasi menggunakan lampu UV. DNA yang terekspresi didokumentasi dengan kamera Polaroid. Produk PCR alel normal, yaitu alel CYP2A6*1 berada pada pita 368-bp (Yoshida et al, 2003). Validasi Metode PCR. Validitas metode PCR dilakukan dengan menguji parameter reprodusibilitas dan spesifisitas produk PCR. Metode PCR memenuhi parameter reprodusibilitas bila dihasilkan elektroforegram yang sama pada 368-bp dari produk PCR sampel isolat DNA yang berbeda. Metode PCR memenuhi parameter spesifisitas bila urutan nukleotida produk PCR pada 368-bp sesuai dengan urutan nukleotida CYP2A6*1 pada GenBank. Spesifisitas ditetapkan dengan melakukan sekuensing produk PCR di Macrogen, Singapore. Hasil sekuensing dilakukan manual editing menggunakan program BioEdit. Runutan nukleotida yang dihasilkan disejajarkan dengan runutan nukleotida CYPA6 dari Genbank menggunakan Clustal W yang terdapat pada program BioEdit. HASIL DAN PEMBAHASAN Studi polimorfisme pada CYP2A6 pada penelitian ini dilakukan dalam empat tahapan, yaitu analisis kualitatif isolat DNA, optimasi PCR pada amplifikasi CYP2A6*1, analisis produk PCR menggunakan teknik elektroforesis, dan validasi metode PCR. PCR merupakan salah satu metode yang dapat digunakan untuk mendeteksi adanya variasi genetik di dalam suatu populasi. Alel CYP2A6*9 merupakan jenis alel yang diidentifikasi pada penelitian ini. Pemilihan alel CYP2A6*9 didasarkan pada adanya frekuensi alel slow metabolizer seperti CYP2A6*9 yang sangat tinggi pada populasi Asia, terutama pada populasi oriental (Raunio and Rahnasto-Rilla, 2012). Analisis kualitatif isolat DNA. Isolat DNA yang digunakan pada penelitian ini merupakan isolat DNA yang pernah diteliti oleh Patramurti et al. (2014). Isolat DNA dianalisis secara kualitatif menggunakan teknik elektroforesis (Broeders et al., 2014). Hasil elektroforesis menunjukkan adanya variasi bentuk pita, baik pita tunggal dan tebal, maupun pita ganda dan tipis dengan ukuran lebih dari 3000 bp (Gambar 1). Adanya variasi bentuk pita dapat disebabkan karena adanya isolat DNA yang tidak murni, tercemar (Patramurti et 5 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI al., 2014) atau terdegradasi (ECJRC, 2012). Adapun isolat DNA yang dipilih untuk digunakan dalam penelitian adalah isolat DNA yang menghasilkan pita tunggal dan tebal dengan ukuran lebih dari 3000 bp, yang menunjukkan bahwa isolat DNA yang digunakan masih dalam keadaan murni, tidak tercemar oleh protein lain serta tidak terdegradasi (Patramurti et al., 2014). M 1 2 3 4 5 6 7 8 Isolat DNA 3000 1500 1000 500 200 100 Gambar 1. Hasil analisis kualitatif isolat DNA menggunakan teknik elektroforesis Keterangan: M : 100 bp DNA Ladder (Geneaid) sebagai marker 1-3, 8 : Isolat DNA dengan pita tipis dan tunggal 4 : Isolat DNA dengan pita tipis dan ganda 5 : Isolat DNA dengan pita tebal dan ganda 6-7 : Isolat DNA dengan pita tebal dan tunggal Kondisi Elektroforesis : Fase diam agarose 1%; Fase Gerak Larutan TBE 0,5%; Kecepatan 100 V/cm; Vol. Injeksi 6 μL Optimasi Kondisi PCR pada Amplifikasi CYP2A6. Identifikasi alel dari CYP2A6*9 pada penelitian ini mengadopsi dari penelitian yang pernah dilakukan oleh Yoshida et al. (2003). Primer yang digunakan untuk mengamplifikasi alel CYP2A6*1 adalah primer forward: 5'-GAT TCC TCT CCC CTG GAA C-3' dan primer reverse: 5'-GGC TGG GGT GGT TTG CCT TTA-3'. Spesifisitas primer akan menentukan keberhasilan proses PCR, karena spesifisitas menentukan kemampuan primer untuk menempel pada sekuen target pada isolat DNA (McPherson and Moller, 2006). Amplifikasi alel CYP2A6*1 menggunakan primer forward 5'-GATTCCTCT CCC CTG GAA C-3' akan mengamplifikasi ekson 395 sampai 376, sedangkan primer reverse 5'-GGC TGG GGT GGT TTG CCT TTA-3' akan mengamplifikasi ekson 48 sampai 28 dari gen CYP2A6*1 6 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI (Yoshida et al., 2003). Amplifikasi gen CYP2A6 menggunakan primer tersebut menghasilkan produk PCR yang berukuran 368-bp yang merupakan produk dari alel CYP2A6*1. Situs penempelan primer pada sekuen urutan basa potongan gen CYP2A6*1 pada daerah yang diamplifikasi disimulasikan dengan http://ncbi.nlm.nih.gov/ dan diilustrasikan seperti pada Gambar 2. Alel CYP2A6*1 Primer forward 5' GATTCCTCTCCCCTGGAAC CTAAGGAGAGGGGACCTTG 3' TAAAGGCAAACCACCCCAGCC ATTTCCGTTTGGTGGGGTCGG 5' 3' Primer reverse Gambar 2. Situs penempelan primer pada sekuen CYP2A6*1 Keterangan: : arah penempelan primer forward : arah penempelan primer reverse Penggunaan suhu annealing dengan jumlah siklus amplifikasi berturut-turut 56oC, 25 siklus; 56oC, 30 siklus; 64oC, 30 siklus belum dapat mengamplifikasi CYP2A6 seperti yang dikehendaki. Hal ini dapat dilihat pada hasil elektroforegram yang ditunjukkan pada Gambar 3, yaitu adanya produk PCR yang tipis, tidak terlihat jelas, dan adanya pita DNA berukuran selain 368-bp pada elektroforesis. Penggunaan suhu annealing 60oC dan jumlah siklus amplifikasi 30 siklus telah mampu mengamplifikasi CYP2A6 seperti yang dikehendaki, karena menghasilkan satu produk PCR spesifik, dengan pita DNA tebal dan berukuran 368-bp pada elektroforesis (Stephenson and Abilock, 2012). Penggunaan suhu annealing 56oC dan 64oC menyebabkan terbentuknya pita DNA berukuran selain 368-bp. Hal ini dapat disebabkan karena suhu annealing tidak sesuai untuk menempelkan primer pada DNA target, sehingga primer tidak menempel pada DNA target (Rahman et al., 2013) atau terjadi mispriming (McPherson and Moller, 2006), yang menghasilkan pita DNA selain pita berukuran 368-bp. Jumlah siklus amplifikasi sebanyak 25 siklus telah mampu menghasilkan produk PCR, namun pita yang dihasilkan belum berupa pita tebal. Hal ini disebabkan karena pada amplifikasi 25 siklus, reaksi belum terjadi secara optimal (Innis, M.A., and Gelfand, D.H., 1990) sehingga masih terdapat primer yang tersisa. Adanya primer yang tersisa terlihat pada elektroforegram (Gambar 3). Pada jumlah siklus amplifikasi 30, primer digunakan untuk menggandakan DNA secara optimal sehingga tidak terlihat sisa primer pada elektroforegram. Oleh karena itu, suhu annealing dan jumlah sikus amplifikasi yang optimum untuk amplifikasi CYP2A6 menggunakan primer forward: 7 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 5'-GAT TCC TCT CCC CTG GAA C-3' dan primer reverse: 5'-GGC TGG GGT GGT TTG CCT TTA-3'berturut-turut adalah 60oC dan 30 siklus. 1 1 2 2 B M 3 3 4 4 3000 1500 1000 produk PCR 368 bp 500 300 200 100 produk PCR mispriming primer tersisa Gambar 3. Produk PCR pada berbagai suhu annealing dan siklus amplifikasi Keterangan: 1 : 64OC, 30 siklus 2 : 60OC, 30 siklus 3 : 56OC, 30 siklus 4 : 56OC, 25 siklus B : Kontrol Negatif M : 100 bp DNA Ladder (Geneaid) sebagai marker Kondisi Elektroforesis : Fase diam Agarose 1,5%; Fase Gerak Larutan TBE 0,5%; Kecepatan 100 V/cm; Vol. Injeksi 6 μL Validasi Metode PCR. Validitas metode PCR ditentukan dengan menguji reprodusibilitas dan spesifisitas produk PCR. Reprodusibilitas dari reaksi kondisi amplifikasi alel CYP2A6*1 menggunakan primer forward: 5'-GAT TCC TCT CCC CTG GAA C-3' dan primer reverse: 5'-GGC TGG GGT GGT TTG CCT TTA-3' pada kondisi optimum ini dapat dilihat dari hasil reaksi PCR sepuluh sampel isolat DNA yang berbeda, di mana pada semua sampel menghasilkan satu produk PCR yang sama dengan panjang pita 368 bp (Gambar 4). Kontrol negatif yang berisi campuran yang digunakan pada PCR tanpa isolat DNA (reagent 12,5 μL, primer forward 1,25 μL, primer reverse 1,25 μL, Nuclease-Free Water 10 μL) tidak menghasilkan pita DNA pada 368-bp yang menunjukkan bahwa campuran tersebut tidak mempengaruhi produk PCR. Dari hasil pengujian, dapat ditetapkan bahwa kondisi optimum PCR tersebut telah memenuhi parameter reprodusibilitas. 8 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI B 1 2 3 4 5 M 6 7 8 9 10 3000 1500 1000 produk PCR 368 bp 500 300 200 100 Gambar 4. Elektroforegram produk PCR pada kondisi optimum dari berbagai isolat DN Keterangan: M : 100 bp DNA Ladder (Geneaid) sebagai marker B : kontrol negatif 1-10 : Produk PCR dari berbagai isolat DNA yang berbeda Kondisi Elektroforesis : Fase diam Agarose 1,5%; Fase Gerak Larutan TBE 0,5%; Kecepatan 100 V/cm; Vol. Injeksi 6 μL Spesifisitas PCR ditetapkan melalui sekuensing produk PCR (Broeders et al., 2014). Pembacaan sekuen merupakan hal penting dan utama dalam biologi molekuler karena dapat mengetahui komposisi nukleotida suatu gen. Hasil sekuensing urutan basa potongan alel gen menunjukkan bahwa produk PCR memiliki urutan basa yang sama dengan urutan basa alel CYP2A6*1 menurut GenBank. Hal ini menunjukkan bahwa kondisi optimum PCR telah memenuhi parameter spesifisitas. Pada hasil sekuensing produk PCR terlihat bahwa urutan basa alel CYP2A6*1 mempunyai perbedaan sebanyak 1-bp terhadap alel CYP2A6*9, yang disebabkan oleh adanya single nucleotide polymorphism (SNP) T-48G pada CYP2A6 (Gambar 5). Adanya perbedaan urutan basa antara alel CYP2A6*9 dan CYP2A6*1 menyebabkan primer forward: 5'-GATTCCTCTCCCCTGGAAC-3' dan primer reverse: 5'-GGCTGGGGTGGTTTGCCTTTA-3' mengamplifikasi alel CYP2A6*1 secara spesifik. Adanya perbedaan urutan basa tersebut mengakibatkan terjadinya perbedaan urutan asam amino yang dikode oleh kedua alel, yang menyebabkan alel CYP2A6*9 mengalami penurunan aktivitas dalam mengekspresikan enzim CYP2A6 (Pitarque et al., 2001). A. CYP2A6*1 GGATTCCTCTCCCCTGGAACCCCCAGATCCACAACTTTGGGGTGC B. CYP2A6*1 TGATTCCTCTCCCCTGGAACCCCCAGATCCACAACTTTGGGGTGC C. CYP2A6*9 GGATTCCTCTCCCCTGGAACCCCCAGATCCACAACTTTGGGGTGC 9 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI A. CYP2A6*1 ATTCTCACTCTCAGACCCCAAATCCAAAGCCCAAGTGCTCCCCTA B. CYP2A6*1 ATTCTCACTCTCAGACCCCAAATCCAAAGCCCAAGTGCTCCCCTA C. CYP2A6*9 ATTCTCACTCTCAGACCCCAAATCCAAAGCCCAAGTGCTCCCCTA A. CYP2A6*1 TGCAAATATTCCAAACTCCTCAGTTCTACAGCTTATCTGTTGCCC B. CYP2A6*1 TGCAAATATTCCAAACTCCTCAGTTCTACAGCTTATCTGTTGCCC C. CYP2A6*9 TGCAAATATTCCAAACTCCTCAGTTCTACAGCTTATCTGTTGCCC A. CYP2A6*1 CCTCCTAAATCCACAGCCCTGCGGCACCCCTCCTGAAGTACCACA B. CYP2A6*1 CCTCCTAAATCCACAGCCCTGCGGCACCCCTCCTGAAGTACCACA C. CYP2A6*9 CCTCCTAAATCCACAGCCCTGCGGCACCCCTCCTGAAGTACCACA A. CYP2A6*1 GATTTAGTCTGGAGGCCCCCTCTCTGTTCAGCTGCCCTGGGGTCC B. CYP2A6*1 GATTTAGTCTGGAGGCCCCCTCTCTGTTCAGCTGCCCTGGGGTCC C. CYP2A6*9 GATTTAGTCTGGAGGCCCCCTCTCTGTTCAGCTGCCCTGGGGTCC A. CYP2A6*1 CCTTATCCTCCCTTGCTGGCTGTGTCCCAAGCTAGGCAGGATTCA B. CYP2A6*1 CCTTATCCTCCCTTGCTGGCTGTGTCCCAAGCTAGGCAGGATTCA C. CYP2A6*9 CCTTATCCTCCCTTGCTGGCTGTGTCCCAAGCTAGGCAGGATTCA A. CYP2A6*1 TGGTGGGGCATGTAGTTGGGAGGTGAAATGAGGTAATTATGTAAT B. CYP2A6*1 TGGTGGGGCATGTAGTTGGGAGGTGAAATGAGGTAATTATGTAAT C. CYP2A6*9 TGGTGGGGCATGTAGTTGGGAGGTGAAAGGAGGTAATTATGTAAT A. CYP2A6*1 CAGCCAAAGTCCATCCCTCTTTTTCAGGCAGTATAAAGGCAAACC B. CYP2A6*1 CAGCCAAAGTCCATCCCTCTTTTTCAGGCAGTATAAAGGCAAACC C. CYP2A6*9 CAGCCAAAGTCCATCCCTCTTTTTCAGGCAGTAGAAAGGCAAACC A. CYP2A6*1 ACCCCAGCCG B. CYP2A6*1 ACCCCAGCCA C. CYP2A6*9 ACCCCAGCC Gambar 5. Urutan nukleotida produk PCR gen CYP2A6*1 dan CYP2A6*9 (perbedaan 1-bp ditunjukkan oleh warna hijau dan kuning, primer ditunjukkan oleh warna merah) Keterangan : A : potongan urutan basa CYP2A6*1 menurut Gen Bank B : urutan basa konsensus CYP2A6*1 hasil sekuens C : urutan basa CYP2A6*9 menurut teori Yoshida et al (2003) KESIMPULAN Kondisi optimum PCR pada identifikasi CYP2A6*9 menggunakan primer forward 5'-GATTCCTCTCCCCTGGAAC-3' dan primer reverse 5'-GGCTGGGGTGGTTTG CCTTTA-3' dengan Promega Go Taq Green Master Mix adalah sebagai berikut: initial denaturation 94oC (3 menit); 30 siklus terdiri dari denaturation 94oC (30 detik), annealing 60oC (30 detik), extension 70oC (25 detik); diakhiri final extension 72oC (5 menit). Kondisi ini memenuhi parameter spesifisitas dan reprodusibilitas pada validasi metode analisis. 10 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI DAFTAR PUSTAKA Baurley, J.W., Edlund, C.K., Pardamean, C.I., Conti, D.V., and Bergen, A.W., 2016, Smokescreen: A Targeted Genotyping Array for Addiction Research, BMC Genomics, 17, 1-12. Bloom, A.J., Hinrichs, A.L., Wang, J.C., Von-Weymarn, L.B., Kharasch, E.D.,Bierut, L.J., et al, 2011, The Contribution of Common CYP2A6 Alleles to Variation in Nicotine Metabolism Among European Americans, Pharmacogenetic Genomics, 21(7), 403-416. Broeders, S., Huber, I., Grohmann, L., Berben, G., Taverniers, I., Mazzara, M., Roosens, N., and Morisset, D., 2014, Guidelines for Validation of Qualitative Real-Time PCR Mehods, Trends in Food Science & Technology, 37, 115-126. European Commission Joint Research Centre, 2012, Report on the Single-Laboratory Validation of A PCR-Based Detection Method for Identification of FlorigeneTM IFD-25958-3 GM Carnation, EU-RL GMFF, 1-15. Ishmael, F.T., and Stellato, C., 2008, Principles and Applications of Polymerase Chain Reaction: Basic Science for The Practicing Physician, Annals of Allergy, Asthma, and Immunology, 101, 437-443. Joko, T., Kusumandari, N., and Hartono, S., 2011, Optimasi Metode PCR untuk Deteksi Pectobacterium carotovorum, Penyebab Penyakit Busuk Lunak Anggrek, Jurnal Perlindungan Tanaman Indonesia, 17(2), 54-59. Kadlubar, S., Anderson, J.P., Sweeney, C., Gross, M.D, Lang, N.P., Kadlubar, F.F. et al, 2009, Phenotypic CYP2A6 Variation and the Risk of Pancreatic Cancer, Journal of the Pancreas, 10(3), 263–270. Liu, Y., Xu, Y., Li, F., Chen, H., and Guo, S., 2013, CYP2A6 Deletion Polymorphism is Associated with Decreased Susceptibility of Lung Cancer in Asian Smokers: a Meta-Analysis, Tumour Biology: the Journal of International Society for Oncodevelopmental Biology and Medicine, 34(5), 2651–2567. Maggert, K.A., 2012, Genetics: Polymorphisms, Epigenetics, and Something In Between, Genetic Research International, 1-9. McPherson, M.J., and Moller, S.G., 2006, PCR, 2 edition, New York: Taylor & Francis, 292. Minematsu, N., Nakamura, H., Furuuchi, M., Nakajima, T., Takahashi, S., Tateno, H., et al., 2006, Limitation of Cigarette Consumption by CYP2A6*4, *7 and *9 Polymorphisms, European Respiratory Journal, 27(2), 289–292. Park, L.S., Tiirikainen, M.I., Patel, Y.M., Wilkens, L.R., Stram, D.O., Marchand, L.L., et al., 2016, Genetic Determinants of CYP2A6 Activity Across Racial/Ethnic Groups with Different Risks of Lung Cancer and Effect on Their Smoking Intensity, Carcinogenesis, 37(3), 269-279. Patramurti, C., Sugiyanto, Nurrochmad, A., and Martono, S., 2014, Polymorphism of Cytochrome P450 2A6 (CYP2A6*1 and CYP2A6*4) Among Javanese Indonesian Smoker and Non Smoker, Indonesian Journal of Pharmacy, 26(1), 11-19. Peamkrasatam, S., Sriwatanakul, K., Kiyotani, K., Fujieda, M., Yamazaki, H., Kamataki, T., et al., 2006, In Vivo Evaluation of Coumarin and Nicotine as Probe Drugs to Predict the Metabolic Capacity of CYP2A6 Due To Genetic Polymorphism in Thais, Drug Metabolism and Pharmacokinetics, 21(6), 475-484. Pitarque, M., Richter, O., Oke, B., Berkkan, H., Oscarson, M., and Ingelman-Sundberg, M., 2001, Identification of a Single Nucleotide Polymorphism in the TATA Box of the CYP2A6 Gene: Impairment of Its Promoter Activity, Biochemical and Biophysical 11 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Research Communications, 284, 455-460. Rahman, M.T., Uddin, M.S., Sultana, R., Mone, A., and Setu, M., 2013, Polymerase Chain Reaction (PCR): A Short Review, Anwer Khan Modern Medical College Journal, 4(1), 30-36. Raunio, H. and Rahnasto-Rilla, M., 2012, CYP2A6: Genetics, Structure, Regulation, and Function, Drug Metabolism and Drug Interactions, 27(2), 73-88. Roux, K.H., 2009, Optimization and Troubleshooting in PCR, Cold Spring Harbor Protocols, 4(4), 1-6. Stephenson, F.H. and Abilock, M.C., 2014,PCR Optimization. Sim, S.C., 2014, CYP2A6 Allele Nomenclature (Online), http://www.cypalleles.ki.se/cyp2a6.htm., accessed 10 Maret 2014. Wang, L., Zang, W., Liu, J., Xie, D., Ji, W., Pan, Y., et al, 2013, Association of CYP2A6*4 with Susceptibility of Lung Cancer: A Meta-Analysis, PLoS ONE, 8(4),1-5. World Organization of Animal Health, 2013, Principles and Methods of Validation of Diagnostic Assays for Infectious Dieseases, OIE Terrestrial Manual, 1-17. Yoshida, R., Nakajima, M., Nishimura, K., Tokudome, S., Kwon, J-T., and Yokoi, T., 2003, Effects of Polymorphism in Promoter Region of Human CYP2A6 gene (CYP2A6*9) on Expression Level of Messenger Ribonucleic Acid and Enzymatic Activity In Vivo and In Vitro, Clinical Pharmacology and Therapeutics, 74(1), 69-76. Yoshida, R., Nakajima, M., Watanabe, Y., Kwon, J-T., and Yokoi, T., 2002, Genetic Polymorphisms in Human CYP2A6 Gene Causing Impaired Nicotine Metabolism, Br. J. Clin. Pharmacol., 54(5), 511-517. Yusof, W. and Gan, S.H., 2009, High Prevalence of CYP2A6*4 and CYP2A6*9 Alleles Detected Among a Malaysian Population, Clinica Chimica Acta: International Journal of Clinical Chemistry, 403(1-2),105–9. Zhu, A.Z.X., Renner, C.C., Hatsukami, D.K., Swan, G.E., Lerman,C., Benowitz, N.L., dkk., 2013, The Ability of Plasma Cotinine to Predict Nicotine and Carcinogen Exposure is Altered by Differences in CYP2A6: the Influence of Genetics, Race, and Sex, Cancer Epidemiology Biomarkers and Prevention, 22(4), 708-718. 12 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI LAMPIRAN 13 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Lampiran 1. Ethical clearance 14 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Lampiran 2. Go Taq Green Master Mix Certificate of Analysis 15 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Lampiran 3. Usage Information of Go Taq Green Master Mix 16 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Lampiran 4. Product Datasheet of DNA Ladder & Markers 17 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Lampiran 5. Hasil Analisis Kualitatif Isolat DNA menggunakan Teknik Elektroforesis 9 10 11 12 13 14 15 16 M 17 Isolat DNA 3000 1500 1000 500 200 100 18 19 20 21 22 23 24 25 M 26 Isolat DNA 3000 1500 1000 500 200 100 Hasil analisis kualitatif isolat DNA menggunakan teknik elektroforesis Keterangan: M : Marker (100 bp DNA Ladder Geneaid) 9-25 : Isolat DNA Kondisi Elektroforesis : Fase diam agarose 1%; Fase Gerak Larutan TBE 0,5%; Kecepatan 100 V/cm; Vol. Injeksi 6 μL 18 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Lampiran 6. Hasil PCR pada Optimasi Volume Primer A A M B B C C 3000 1500 1000 500 200 100 Produk PCR 368-bp Produk PCR pada berbagai volume primer Keterangan: A B C M Kondisi Elektroforesis V/cm; Vol. Injeksi 6 μL : 1 μL : 1,25 μL : 1,5μL : Marker (100 bp DNA Ladder Geneaid) : Fase diam Agarose 1,5%; Fase Gerak Larutan TBE 0,5%; Kecepatan 100 19 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Lampiran 7. Simulasi penempelan primer pada CYP2A6*1 dengan NCBI 20 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Lampiran 8. Hasil Uji Reprodusibilitas PCR a b c d e f g h M i j k l mn o p 3000 1500 1000 500 200 100 Isolat DNA q r s t u v w x M y z 1 2 3 4 5 6 3000 1500 1000 500 200 100 Isolat DNA Elektroforegram produk PCR pada kondisi optimum dari berbagai isolat DN Keterangan: M : Marker (100 bp DNA Ladder Geneaid) a-ff : Produk PCR dari berbagai isolat DNA yang berbeda Kondisi Elektroforesis : Fase diam Agarose 1,5%; Fase Gerak Larutan TBE 0,5%; Kecepatan 100 V/cm; Vol. Injeksi 6 μL 21 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Lampiran 9. Hasil Sekuensing Produk PCR 22 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Lampiran 10. Tahapan manual editing pada BioEdit 23 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 24 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 25 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 26 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Lampiran 11. Hasil manual editing pada BioEdit >ConsensusA (primer forward) TGATTCCTCTCCCCTGGAACCCCCAGATCCACMACTTTGGGGTGCATTCTCACT CTCAGACCCCAAATCCAAAGCCCAAGTGCTCCCCTATGCAAATATTCCAAACTC CTCAGTTCTACAGCTTATCTGTTGCCCCCTCCTAAATCCACAGCCCTGCGGCACC CCTCCTGAAGTACCACAGATTTAGTCTGGAGGCCCCCTCTCTGTTCAGCTGCCC TGGGGTCCCCTTATCCTCCCTTGCTGGCTGTGTCCCAAGCTAGGCAGGATTCATG GTGGGGCATGTAGTTGGGAGGTGAAATGAGGTAATTATGTAATCAGCCAAAGTC CATCCCTCTTTYTCAGGCAGTATAAAGGCAAACCACCCCAGCCA >ConsensusB (primer reverse) TGATTCCTCTCCCCTGGAACCCCCAGATCCACAACTTTGGGGTGCATTCTCACTC TCAGACCCCAAATCCAAAGCCCAAGTGCTCCCCTATGCAAATATTCCAAACTCC TCAGTTCTACAGCTTATCTGTTGCCCCCTCCTAAATCCACAGCCCTGCGGCACCC CTCCTGAAGTACCACAGATTTAGTCTGGAGGCCCCCTCTCTGTTCAGCTGCCCT GGGGTCCCCTTATCCTCCCTTGCTGGCTGTGTCCCAAGCTAGGCAGGATTCATGG TGGGGCATGTAGTTGGGAGGTGAAATGAGGTAATTATGTAATCAGCCAAAGTCC ATCCCTCTTTTTCAGGCAGTATAAAGGCAAACCACCCCAGCCA Dibandingkan dengan sekuens CYP2A6*1 pada GenBank : CCCTTACGCCCTCCTGAAGCAGGACACTCTTATGCCCTCAATGACACCTGAGACAACACACA GAGCCCTC TTGGCACCAAACATGACTTCAATATTCTCCTGGTGTCAAGTTCAGTGCCAACTTGTTTCCCAT CCTCGCA TACACCTGGGGGCAGTCCCAAAGCCAACACGATGCCTTTCCCTCCCTGGCCATACCTGATGC TGATATCA GAACCCACCAATGTCATCAGTGTGTCCACTGCTGATGCCAGTCCCAGCACTCACCTCCTGCT AAGGCTGG CCTGCACTTGACTCCCAGGGTGATCTAGGCCAGTCAATGAAGGGGGGTGAGGAGAAAGTTC ACATCCCAG CTCCCTCACTTACTCCCTGTGTGACCTCACTCAAGAGGATTTATGGAGTCTAGATCTGCTCAT CTTCAAA ATGAGGATGATCATGATGAACCAACCTCATTGTTACAAAGATTCAACCAGATCATACACACCT AGACTTA ATCTTCCCGTATACGACCATGCTCACCAAAGGGTAACTGTCCTGTTTACTAAGGAAGAATTTC CCTGAGG GAAGGACAGGAGGGCTACTCATCCCTTCTCCACTCACACCCACCCCAGGATCTGCCTCTGTG CCTAATAC TGGAGTTTACCCCAATCTCTTCTGCCACTGTTCCCTCTGCCTGCTAATAGTAGTAGCCCCTGA CAAAGCA GGAATCATTCTTAAAGGAGACTTAACTCACCCTCGAATGTGATCTTCTCTTCCCAAACACTCC CTTTCCA CTGGCAGGAAAACCAAATCCAGAAAGGGGAACTAAGTACACAGAGCAGGAGAGATGGGAG TTCAGGGCCA CTCACACATGTCCCCTGCCCACTGTCTGTTTTCTGTCCTCTGTAGATCTTTATATAAAATGAGA AACATA AACAACAATCATAATATTAATAGGGATGATACAATCAATCTAGTGGGTTTCCCTGAGGATCTG GGTTGGA AACCAGCGGACAACCCTTGGGACACTTGAGATTTTTCCACCATTTGGGGGTTGTTATTACTAT TTCTCCA GACCTAGCCAATCCCTCTGCCAACCGCTAACTCCAGGTACTCTTCTCCAGGTGTGGGGAAAG 27 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI TTCCCCTG AAATATGGCTCTGGTCTTCCTCCCCTTCCCAATCAGAGATGGGCAGTGGAGGTTCTATGGCA CCCATCCT GGCCTCACTCTGAGGTTCCAATGAGGATTCTGGGCATCAAGAGACAGCTCTGGGCAAAAGC AAAATCAAG TCAGCCCCTGGACCCAGTGCTGGGCTGCTGGGCTTTCTGGGAGAACCCGCTGGGCTTGCTA CACACTCCT CCTCCCAGAAACTCCACACCCACAGCCCTGGGTCTTCCTAGCCCCGAGACTTTCAAGTCCAT ATGCCTGG AATCCCCCTTCCTGAGACCCTTAACCCTGCATCCTCCACAACAGAAGACCCCTAAATGCACA GCCACACT TTGTCTTACCCTAATAAAACCCAGACCTTTGGATTCCTCTCCCCTGGAACCCCCAGATCCACA ACTTTGG GGTGCATTCTCACTCTCAGACCCCAAATCCAAAGCCCAAGTGCTCCCCTATGCAAATATTCC AAACTCCT CAGTTCTACAGCTTATCTGTTGCCCCCTCCTAAATCCACAGCCCTGCGGCACCCCTCCTGAA GTACCACA GATTTAGTCTGGAGGCCCCCTCTCTGTTCAGCTGCCCTGGGGTCCCCTTATCCTCCCTTGCTG GCTGTGT CCCAAGCTAGGCAGGATTCATGGTGGGGCATGTAGTTGGGAGGTGAAATGAGGTAATTATGT AATCAGCC AAAGTCCATCCCTCTTTTTCAGGCAGTATAAAGGCAAACCACCCCAGCCGTCACCATCTATC ATCCCACT ACCACCATGCTGGCCTCAGGGATGCTTCTGGTGGCCTTGCTGGTCTGCCTGACTGTGATGGT CTTGATGT CTGTTTGGCAGCAGAGGAAGAGCAAGGGGAAGCTGCCTCCGGGACCCACCCCATTGCCCTT CATTGGAAA CTACCTGCAGCTGAACACAGAGCAGATGTACAACTCCCTCATGAAGGTGTCCCAAGGCAGG GAGATGGGT GGCACGGGGTGGGGGCTGCCTAGTTGGCTGGGGCTTTGTGGCAGGGGGTTGACCAGTGTG GACCAGAGTC TTAGGAAATGGAGTTTTGGAGTTTCAGCATCAGAAAGACAGGATCTTGGGATGTCCAGCTCC CTGACTGT GAGAACCTGGGTGCGAAGCATCCCAGCACATGACATCTCGGTGCTGGGCCCCATTCAGAGT GGAGGCTTC TCCCTCTAACCACTCCCACCCACCTCCATCAGATCAGTGAGCGCTATGGCCCCGTGTTCACC ATTCACTT GGGGCCCCGGCGGGTCGTGGTGCTGTGTGGACATGATGCCGTCAGGGAGGCTCTGGTGGAC CAGGCTGAG GAGTTCAGCGGGCGAGGCGAGCAAGCCACCTTCGACTGGGTCTTCAAAGGCTATGGTGAG GGGGTGCCCA AGAGGGGGAAGGTGGCCAGGTGGACACGAAGGTCTCAGTGTTCCCAGCCTTCTCCCTGACT CTCCTGCCA ACTGGAGGCTAAGGCAGAGTCCCCAGTCTGGTCTTCCCTCCCCATCTCCCTTCATTGTGGCC TCTCCATG TGTATCCCTCACCTGTCTCCAGCGTCCCTGTCCTGATTCCTCCCTGCCTCTCTCTGCCCCACC TCCTTAT TCTCTCTCACTGGAGTCTCCTCTTTCCCCTCTCTCTCCATCTCTAAGGACATCCTGGGTTTCT GTTTTCC AGCCCTGGTTCTCTGTCTTCATTTGTCTTTTTGTCCCTCTTAGCTTCTGGGCTTCTCTGTGTTT CTCATC TCTCCGCATCCCTTTCTCACTTCTTCCTCTGTCTTAGGATTTCAGGGTATTCCTACTTCCACAT CTTCAG CCTCCATCTCCTGGTAACAGTCTCTCTTCCTTCCAGACCCTCTCTGTTTCTATCTCAATATTTT TCTCTC TTCTCCAGCTCAGCTTAAGAATGTTTCACCATTTTTATTTCCTCCTCCCAGATCTCCCCATATC 28 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI TCACTT CCCCTCCCTCCATCCTCTTCCTCCATCACTCTCTTTCTCTCCCCACTTCCTTCCCTTCCTCCAT GGAGTG TCCCCTTATCCCTCTGTTTCTATGTGCATCTCTCTGTCTGGCCTTTCTGTTTCTTTTCTGATTGT CTTAT TCTTTAAACCTGGTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCCTCTCTCT CTTCT CTCTCTCTCTCCTCTCTCTCTTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCCTCTCTCTCTTCTCTCTCTC TCTCT CTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTACCTCGACATCGTGTTTCTCTGACTGAGTTTGCAGCTCTGC TGGGCAA TGGCGCTGAATCCATCTCTCTCCCACCCTACTCCCTCTCTCCTCCACCCTTGGGGAGCCCCTT GGAGCTG CTCCGCTCCTGCCCCCGCCGCCCCCTGGCCTGTCTCCATTCCCGCGTTCACCTCCCCAGGCG TGGTATTC AGCAACGGGGAGCGCGCCAAGCAGCTCCGGCGCTTCTCCATCGCCACCCTGCGGGACTTCG GGGTGGGCA AGCGAGGCATCGAGGAGCGCATCCAGGAGGAGGCGGGCTTCCTCATCGACGCCCTCCGGG GCACTGGCGG TGAGCAGGGGACCCCGAGTGCGGGGGCAGGAGAAGGAAAACACCCAGGACGAGGAACCC GCGCGCGTTCT GCCTGGGGATGGGGACTAGGTGGGGAAAGGCGCCCGCACTTCCAGCCCTGGAGTCTGGCG CTGGGAATTT GGCTCAACAAGGCCCTGCCTCCTGGAATTCTGACTCTCCTCAGACCTCTGAGTTGACTCTCT CCCCAACC CCCTTCTCCCGCCATACCCGCAGGCGCCAATATCGATCCCACCTTCTTCCTGAGCCGCACAGT CTCCAAT GTCATCAGCTCCATTGTCTTTGGGGACCGCTTTGACTATAAGGACAAAGAGTTCCTGTCACT GTTGCGCA TGATGCTAGGAATCTTCCAGTTCACGTCAACCTCCACGGGGCAGGTAACTGGCTGCAGCCC GGCCCGTGA CGCCCCTACCACAACCTGCCAACTGCTCCCCTACCTGGAGACAGGTGCCCCAAACTCCCAC CGCCCTCCA GACAGTGTCCCCTCAAAATCAGTCCCCGATATTGGACAACTGGACAGTTGCACCAGAACCC AGGATGGAT GTCCAATACCCTGTCTCCAAGGACACCTGGATAGCTCAACAGATGCTCCCCAAAACAGAGC CTGCTGGCA GGATGCATACCCTCAGCTCAGCTCTCTCACCTGGGCACATGTTCCCATCCCCAACTTACCGTA ATTTCTA ACAGATGCTCCCTACCCAGTTCTTCTGAATATTTTAACACCTGGACAAGTGACTGCGTCAAC CGGCCTCC TGCATACCTGAACACCTGGTGCTGCAAAATCCAGCCCATCATAATCATTTCACATCTACACAA ATGTCCC AGATTAGCCCACTGGAATATCTGGCCAAGCGCCCTCTACTTCACCCACTTAAATACCTGAAA ACATGGAC AGCTGCCCTAACCAACACCTTAAACACATAAATATCTAGACAGATTGTTCCCTGACACACAA ATAAGTGT TCCCCAACCCTTTCCAATCACACACCTTACAGAGGTGCTCCCAGTGCATCCCACTTGGATAG GTAAACAC CTCAACAGGTATCCCCTCCACTTCAACATCTTCACCAGCCCCACTTTAATACCTGAGCACCTG AACAAAA GCCCCCAATCCAGACCCAGTAAGTATCTGGACAGCTGTCTCCAACCAAGCCTACTTGAATGC CTAAATAC CTAGACAGGTGACACTCACCTCATACCAGCCCCACCTGAAGAGCTAAACACCTGGACAGGT GTCTTCCAA CTCAACTTCACTTGAATATCTGAACACCTAGATGTGTGCTCCAATCCAGCCTCGTTTAAATAC 29 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI CTGAAAC CTGGATATATGTCTCAGTTCTTCTCACCTAAATTACTAGACCGTGGCCCTGGTACCTAACCTTC CTGAAA ACTTAGATATAAGTTCCTATCCGGCCCCACTGAAATACCTAAACAACGAGACAGATGCCTTTA ACTCAGT TCCTTCCTTGCTATGAAACAAATCCCATTCCCATCAGCTCCTGCCCCGTGACAGCTGTCCTTC CCTTCCC ATCCTCTCTCTGCAACCCCAGCTCTATGAGATGTTCTCTTCGGTGATGAAACACCTGCCAGG ACCACAGC AACAGGCCTTTCAGTTGCTGCAAGGGCTGGAGGACTTCATAGCCAAGAAGGTGGAGCACA ACCAGCGCAC GCTGGATCCCAATTCCCCACGGGACTTCATTGACTCCTTTCTCATCCGCATGCAGGAGGTAC ACCCCAGC AGCCACTGCGGGGAGATGCAAAGCCAGGCAGAGGGAAATCAGTCTGGGAGTGGGGCAGGC AGATGACACA GGCCCATTCAAATTAACCCTCATCATAATAATCCTCACAATTGGCTGGGTGCCGTGGCTAACA GCCTGTA ATCCCAGCACTTTGGGAGGCCGAGGCAGGTGGATCACCTGAGGTCAGGAGTTCGAGACCA GCCTGGCCAA CATGGTCAAACCCCGTCTCTACTAAAAATCCAAAAATTAGTTGGGCATGGTGGCGCGAAGG GGGGCAGAG GTTGCAATGAGCCAAGATCACGGCATTGCACTCCAGTCTGGGTGACAGAATGAGGCCCTGT GTCAAAAAA AATTAATTAATTGTTTAAAAAGTAAGTGAGCCTGCATGGTCATGCGCATGTGCAGTTCCAGCT ACTCAGG AGGCTGAGGCTGGAGGATTGCTTGAGCTCAGGAGTTGGAGTCCGGCCTGTGCAACTTAGCA AGACCAAGT CAGTATAAGAAAAAAAAAAACAAAAAAAAACTGACAGCTAAGTTGATAATTGAAGGACAG ATGGTCAGCA AGGTAAAGAAGGTGAGAAGGAAGAGCATTTTGGGCAAAGCCAGCAGCCAGGGCAAGGGC TGGAACCTAGA GCGAGTCTGGTAGATCTAGGGTCCCTCTTTCCACCTTTGGTCTGAACCAAAGAGAGGTAGAT CCAAAGGA AAAGCCCTAGAAGGGCCCTGAGGGCAAGAGGAGTGAGGTTGGCCTAAAGCCCCCTCTCCC TGCAGGAGGA GAAGAACCCCAACACGGAGTTCTACTTGAAAAACCTGGTGATGACCACGTTGAACCTCTTC ATTGGGGGC ACCGAGACCGTCAGCACCACCCTGCGCTATGGCTTCTTGCTGCTCATGAAGCACCCAGAGG TGGAGGGTA AGGCTGGAGGGGGACGGAAGTGGAGGGCCCCAGACCCTCAAAATTCCCCTTCGACTGGTG CAATGTCCCC ACCTGTCCCAGATCCCGGGACCCTGAGACGTGACTTGCTGTCCAGAGACAGGGCAACATTC AGCTGGTAG GCATCAGCTGAGTCTCATTAGATATTAAAATATTGAAAATGTCTGCACTGATTGGTCAGTCAC TTCTGTC CCAAGCCCACTGAGTGCCCACTGCCCGTTCCACCGGGTCATCCCCTAAGTTCCTCCCTGTGC CTCCCCTG TGATTCTGGCACAACCTGGTTAACAGGATCCTACTCCAACAATGCGAATGGCTGATGTCTGT TCTGTTAT GAATGCTCTACTTCCGTCTCATAGGCGGAGCCATATCATCCACCCCATTTTGCCTATTCGGACT ATCATT TCCTGCTCTGAGACCCCTAGATACCTAAACACATTCCCCCTCCTCCCCCAGCCAAGGTCCAT GAGGAGAT TGACAGAGTGATCGGCAAGAACCGGCAGCCCAAGTTTGAGGACCGGGCCAAGATGCCCTA CATGGAGGCA GTGATCCACGAGATCCAAAGATTTGGAGACGTGATCCCCATGAGTTTGGCCCGCAGAGTCA 30 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI AAAAGGACA CCAAGTTTCGGGATTTCTTCCTCCCTAAGGTGCTATCCGCCCCCACCCCCCAGACTACGGGG ACTTCCAG CCCCTCTCTGTGTCCCCAGCATCCCACCCACATTAGAAGCTTTCTAGACCCTGTCCCACTCCC TCAATCA GTCAAAAAAGACTTCCCCAACCACCACATCCGTTCCACCTTTCCACTTAGACACTCCTGAGT CCTGCATC TCTCCAGACTCTTTGTGTCAGGAGAATCAAACACATGTTCCCAAACTTCCTATCTTAAGAAA CAGAAGCC CCCTTTCCATTCGGCCTTTTGTCATAGGGACAGAAATCTCAGGTCCCCCAAACTCCTGCCTA GAAGGACA TGGACCCCATGTCTCCCAAACTTCCTGTTTCAGAGATGTGAACCTTCTATCCCCCAAAGCTC CTCCATCA GAGGACCCCAACTCCTCCATGCCTGCCACTTCCCCTTACCTGGGGCACACTAGTTCCCCCTC CAGCCCCT GTGTACTTTCACCAATCCCCCGACCCTCCTCATCACACACAACTTCCTCCTCCCTACCAGGG CACCGAAG TGTACCCTATGCTGGGCTCTGTGCTGAGAGACCCCAGTTTCTTCTCCAACCCCCAGGACTTC AATCCCCA GCACTTCCTGAATGAGAAGGGGCAGTTTAAGAAGAGTGATGCTTTTGTGCCCTTTTCCATCG GTAAGAGA CCACTGTTTGCTGCCAGGCCACGGCTCACACCAGCAGGGGCCTCCCTCACCCTCCTCCCCTC TCTGCGGT GTAGCCTGGTATTTCTCCAGCTTGGAAGTTCCTGTTAGAATCTACCCTTGAGCCAGCAGCTGA TACTTCC TTAACTACCAAGCACCCAGTACCTGCGCCCAGGTAAAATGAAAGGAAACATCTTTCCCCGTA GATGTATT TCTCTAGGGTCACACAGCAGATTCCTCAGATCCCTAAAAAGGAGATGACGGCACAGCAGTC ATATTTGCA AGTGTACCTGGCAGGAAAGGACATCTAAACCTCCCATTGCTACACCTGGCATGGATCACCCC ATCTATGA TGGATGTGTGACATTATGCCTTTTTCAAAACCCATAGAACTGTATAACACAGAGTAAACCCTA ATGTAAA CTATGGACTTTGTTAGTAATAATATATCAATATTGGTTCACCATTGTTACATCTCTTATAGAAAG AAATT GAGGCTCAGGGAGGATCAGAGCCTCCTCTGAAACTCTCTCAGGCCATAATATTCCACCCTTC CTCCCTGG GAGAGCCGCAGCTGGAGGTCGGTACTGGGGCGAGGCTGCACTGAGAGTGGGCTTCACCTC CACCCCTCCC GCCTCTCCTCCTCAGGAAAGCGGAACTGTTTCGGAGAAGGCCTGGCCAGAATGGAGCTCTT TCTCTTCTT CACCACCGTCATGCAGAACTTCCGCCTCAAGTCCTCCCAGTCACCTAAGGACATTGACGTGT CCCCCAAA CACGTGGGCTTTGCCACGATCCCACGAAACTACACCATGAGCTTCCTGCCCCGCTGAGCGA GGGCTGTGC CGGTGCAGGTCTGGTGGGCGGGGCCAGGGAAAGGGCAGGGCCAAGACCGGGCTTGGGAG AGGGGCGCAGC TAAGACTGGGGGCAGGATGGCGGAAAGGAAGGGGCGTGGTGGCTAGAGGGAAGAGAAGA AACAGAAGCGG CTCAGTTCACCTTGATAAGGTGCTTCCGAGCTGGGATGAGAGGAAGGAAACCCTTACATTAT GCTATGAA GAGTAGTAATAATAGCAGCTCTTATTTCCTGAGCACGTACCCCCGTGTCACCTTTGTTCAAAA ACCATTG CACGCTCACCTAATTGCCACAAACCTCTGCGAAGGGCGTTCATGCCCATTTTACACGTGACA AAACTGAG GCTTAGAAAGTTGTCTCTGATGTCTCACAAAACATAAGTGCCCAGAAAATCTTTGAACACAG 31 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI ATCTGTGC CCATAGCCTTCTAGACAGATTCTTAAAAAGCACCTATTCCTCACGTAAAACAGCTTAGTATAG CATCACA TGGCCTGAACATCCCTGTCCTGGGGAGTTTTCCAGAGACCTGGCGGGTGGCTGTCCTGCCTT CACTGCAC ACATGCCCACACTCTCACCTACTCAACATGCTTTGAATACCCGGGTGTAATCTGTGCTTGCTA CCAGATA AGGCCACTGTAGCCCATTCAGAGTCAGTCCAGGGACACAACGAGACATGAATGGACATACA GAGTCAGTC CATTAACAATTTTTTGCAGAGCAGAAGTTTTTAATTTTAATGACATTCTGTCAATATATCCCTT AATGAA GAAGTTGAAGGAAAGAATCACTTACAGAGAATGAGAGAACTCTGGATCAGGACATAGCCAT ATTCATGTG TGTGATCATGTTCAGACATGCATGTGAGCATATGACTGCATATTCTCCTCCGTGTATGCATGAA ACATAT TCCACTATGGGTTCTGAAGGCTGGGCTCTCCTGATGGATCTGGGGTCTGTTGTAAGACCCAG CTGAGAGT TTCACAATCACTGCCCACTCTCAAAGAAGTTAGTGTGTGTCCCCCTTAGAAGCTCCCTTACG GCTTTCAC GAAAATTAACTCCAAGTTTATTGTAGACCTAAATGAATAGTGAGTACAAAACTTCTAGAAGA TAATGTAG GAGAAAATCTAGATGACCTTAAGTTTGGTGATGGCTTATTAGATACAACACCAAAAGCACAA TCCTTGAA AGAAGCAATTGATAAGTTCTGTGTCATTAAAATTAGAAGCTTCTGCTCTGCAAAAGAATTGT CAAGAGAA TGACAATACAAGCTACAGACTAGGAGAACATATTTGCAGGGGACATACCTGATAAGGGACTT ACATTCAA AATACACAAAGAACTGTTAAAACTCAATAGAAAACAACCCAATTAAAGAATGGGCAAACGA TCTGAGCAG ACACCTCACCAAAGAAAATATACACATAGCAAATAAGCATAAGGAAAGATGCTCCATATCATA TGTCAGT AGCCATTTCAAATTGAAACAATAATGATGTACCACTACTCACCTATTAGAATGGCTAAAATCC AAAGCTG ACAACATCAAATGCTGACAAGGAGGTGGCTCAACAGGAACTGTCATTCATTGATGGTGGGA ATGCAAAAT GACACAGCTACTTTGAAAGACAATTTGGCGGTTTCTTGCAAAGCTAAACATATTCTTACCAT GTGCTACA GCAATCATGTTCTTCGGTATTAACCCAAATGAGTTGAAAACATATAGCAACACAAAAACCTC TGCACAGA TGTTTATAGCAGCTTTATTCATAATTGCCAAATCTTGTAAGCAACCAAGATGTTCTTCAACAA GTGAATG GATAAATGAACTGTAATATGTTCATACAATGAAATACGGCAGGGCTTGATGGCTCATACTGTT AATTATA GCACTATGGGAGGCCGAGGTGGGCAGATCACTTGAGGTCAGGAATTCGAGACCAGCCTGGC CAACATGGT GAAACCCCATCTCTACTAAAAATACAAAAATTAGCCGGGCACGGTGGCATGCGCCTGCAGTT GCAGCCAC TTGGGAGGCTGAGGTGGGAGAATTGCCTGAACCCATAAGGCAGAGGTTGCAGCGAGCTGA GATGGAGCCA CTGCACTCCAGCCTGGGCGACACAGTGAGATTAGAAGAAGCAATATTGTTAAAATGTTCATA CTACTCAA AGCAATCTACAGATTCAATGCAATTCCTATCAAAATACCAATGACATTCTTCACAGAAACAG AAAAAA 32 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI BIOGRAFI PENULIS Penulis mempunyai nama lengkap Cindy, dilahirkan di Surabaya, pada tanggal 13 April 1995, serta merupakan anak ketiga dari enam bersaudara dari pasangan Tjua Nyit Fui dan Henny Susana. Penulis menempuh pendidikan TK hingga SMA di Kota Sambas, Kalimantan Barat, yaitu TK Amkur (1999-2001), SDS Amkur (2001-2007), SMP Amkur (2007-2010) dan SMA Santo Bonaventura (2010-2013). Penulis melanjutkan studi di Program Studi S1 Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta pada tahun 2013. Selama masa kuliah, penulis aktif dalam kegiatan akademik dan non akademik di dalam maupun di luar kampus, yaitu Dewan Perwakilan Mahasiswa Fakultas (DPMF) Farmasi sebagai anggota Divisi Advokasi (2014), Bendahara (2015), dan Ketua (2016); Kepanitiaan Inisiasi Fakultas Tiga Hari Temu Akrab Farmasi (Titrasi) sebagai anggota Kesekretariatan (2014) dan Koordinator Kesekretariatan (2015); anggota Patient Counseling Club; anggota Herbal Garden Team; asisten Praktikum Kimia Dasar (2014), Kimia Organik (2015-2016), Kimia Analisis (2015), Biologi Sel dan Molekuler (2015-2016); Tim Farmasi Bakti Sosial Pengobatan Gratis Yayasan Persaudaraan Masyarakat Yogyakarta; peserta Kalbe Pharmaceutical Professional Program (2016), peserta Good Manufacturing Practice education (GMPed) dan Patient Counseling Event (PCE) dalam Pekan Ilmiah Mahasiswa Farmasi Indonesia (PIMFI) di Universitas Padjadjaran Bandung (2015), Juara 3 Pharmaceutical Industry Case Study di Institut Teknologi Bandung (2016), Semifinalis Nutrifood Leadership Award (2016), 15 Besar Olimpiade Sains Mahasiswa Tingkat Nasional Bidang Kimia (2016), Juara 1 Aksi Penulisan Ilmiah Nasional (2016), 10 Naskah Terbaik Lomba Karya Tulis Ilmiah Tingkat Nasional (2016), Peserta Phase Paper of Innovation Challenge, Peringkat II Olimpiade Nasional MIPA bagi Mahasiswa Perguruan Tinggi (ONMIPA-PT) Swasta Tingkat Wilayah 2016 Bidang Kimia, 50 besar Lomba Essay Nasional (2016), Peserta Olimpiade Farmasi Indonesia 8 di Universitas Andalas Padang (2016), Peserta Pharmacy Competition (2016); Peserta Clinical Pharmacy Skill Event dalam kegiatan Kompetisi Farmasi Seluruh Indonesia di Universitas Airlangga (2016); Peserta Kompetisi Kefarmasian Mahasiswa Tingkat Nasional Pharmadays di Universitas Gadjah Mada (2015); Peserta Lomba Cerdas Cermat Farmasi dalam Pharmacy Festival di Universitas Indonesia (2015); dan peserta Student Exchange Program di Mahasarakham University, Thailand (2017). 33
