OPTIMASI DAN VALIDASI KONDISI POLYMERASE CHAIN

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
OPTIMASI DAN VALIDASI KONDISI POLYMERASE CHAIN REACTION
PADA IDENTIFIKASI CYP2A6*9
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat
Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)
Program Studi Farmasi
Oleh :
Cindy
NIM : 138114127
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA
2017
i
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
OPTIMASI DAN VALIDASI KONDISI POLYMERASE CHAIN REACTION
PADA IDENTIFIKASI CYP2A6*9
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat
Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)
Program Studi Farmasi
Oleh :
Cindy
NIM : 138114127
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA
2017
ii
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Persetujuan Pembimbing
OPTIMASI DAN VALIDASI KONDISI POLYMERASE CHAIN REACTION
PADA IDENTIFIKASI CYP2A6*9
Skripsi yang diajukan oleh :
Cindy
NIM : 138114127
telah disetujui oleh
Pembimbing
( Dr. Christine Patramurti, M.Si., Apt.)
tanggal 18 November 2016
iii
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Pengesahan Skripsi Berjudul
OPTIMASI DAN VALIDASI KONDISI POLYMERASE CHAIN REACTION
PADA IDENTIFIKASI CYP2A6*9
Oleh :
Cindy
NIM : 138114127
Dipertahankan di hadapan Panitia Penguji Skripsi
Fakultas Farmasi
Universitas Sanata Dharma
pada tanggal 4 Januari 2017
Mengetahui
Fakultas Farmasi
Universitas Sanata Dharma
Dekan
(Aris Widayati, Ph.D., Apt.)
Panitia Penguji :
Tanda tangan
1. Dr. Christine Patramurti, M.Si., Apt.
.......................
2. Damiana Sapta Candrasari, M.Sc.
.......................
3. Maywan Hariono, Ph.D., Apt.
.......................
iv
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
HALAMAN PERSEMBAHAN
我的世界
For My Soul,
Papa, Mama, Hendrikus, Diana Fransiska,
Lidya Natalia, Steven and Kevin,
who let me write my own story.
v
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN
PUBLIKASI KARYA ILMIAH UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS
Yang bertanda tangan di bawah ini, saya mahasiswa Universitas Sanata Dharma :
Nama
: Cindy
Nomor Mahasiswa
: 138114127
Demi pengembangan ilmu pengetahuan, saya memberikan kepada Perpustakaan
Universitas Sanata Dharma karya ilmiah saya yang berjudul :
OPTIMASI DAN VALIDASI KONDISI POLYMERASE CHAIN REACTION
PADA IDENTIFIKASI CYP2A6*9
beserta perangkat yang diperlukan (bila ada). Dengan demikian saya memberikan
kepada Perpustakaan Universitas Sanata Dharma hak untuk menyimpan, mengalihkan dalam bentuk media lain, mengelolanya dalam bentuk pangkalan data,
mendistribusikan secara terbatas, dan mempublikasikannya di Internet atau media
lain untuk kepentingan akademis tanpa perlu meminta ijin dari saya maupun
memberikan royalti kepada saya selama tetap mencantumkan nama saya sebagai
penulis.
Demikian pernyataan ini yang saya buat dengan sebenarnya.
Dibuat di Yogyakarta
Pada tanggal : 18 November 2016
Yang menyatakan
( Cindy )
vi
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
PRAKATA
Penulis menghaturkan puji syukur ke hadirat Tuhan Yang Maha Esa,
karena atas berkat dan rahmat-Nya, penulis dapat menyelesaikan skripsi yang
berjudul "Optimasi dan Validasi Kondisi Polymerase Chain Reaction pada
Identifikasi CYP2A6*9" untuk memenuhi persyaratan memperoleh gelar Sarjana
Farmasi (S. Farm) Program Studi Farmasi Fakultas Farmasi Universitas Sanata
Dharma.
Penyusunan skripsi ini tidak terlepas dari dukungan berbagai pihak. Pada
kesempatan ini, penulis menyampaikan terima kasih kepada:
1.
Ibu Aris Widayati, Ph. D., Apt., selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas
Sanata Dharma
2.
Ibu Dr. Christine Patramurti, M.Si., Apt., selaku dosen pembimbing atas
segala bimbingan, saran, dan nasihat kepada penulis
3.
Ibu Damiana Sapta Candrasari, M.Sc., selaku dosen penguji atas bantuan,
kritik dan saran kepada penulis
4.
Bapak Maywan Hariono, Ph. D., Apt., selaku dosen penguji atas bantuan,
kritik dan saran kepada penulis
5.
Bapak Jeffry Julianus, M. Si., atas segala ilmu, bimbingan, motivasi, dan
dukungan kepada penulis
6.
Ibu Dita Maria Virginia, M. Sc., Apt., selaku Dosen Pembimbing
Akademik penulis
7.
Ibu dr. Elsa Herdiana Murhandarwati, M. Kes., Ph. D., selaku supervisor
penulis
selama
penelitian
di
Laboratorium
Parasitologi
Fakultas
Kedokteran UGM
8.
Ibu Rumbiwati, M.Sc., selaku teknisi Laboratorium Parasitologi Fakultas
Kedokteran UGM atas bantuan dan petunjuk selama penelitian
9.
Sr. Yenny Baptista, KFS atas segala bantuan dan dukungan sejak penulis
berada di bangku SMP
10.
Kementerian Pendidikan dan Kebudayaan Republik Indonesia atas Program
Beasiswa yang diberikan kepada penulis
vii
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
11.
Segenap civitas akademika Universitas Sanata Dharma yang telah
memberikan wawasan dan motivasi kepada penulis selama perkuliahan
12.
Dewan Perwakilan Mahasiswa Fakultas Farmasi Universitas Sanata
Dharma periode 2014, 2015, 2016
13.
Keluarga tercinta yang telah memberikan segalanya kepada penulis
14.
Sahabat sejak semester pertama: Jessy Florensia, Indriyani Permatasari,
Regina Hiacinta Eva Angelista, dan Putu Ririn Andreani
15.
"Tim PICS Sadhar": Kenny Kowira, Bernadetta Inez Ludwinia, Yolanda
Tyas Prameswari, dan Donny Soeparto
16.
MCL: Jonathan Ronny Kurniawan, dan Suryatmoko Agung
17.
Partner lomba: Pricella, Erica Kusuma Rahayu Sudarsono
18.
Kirana Andranilla, Ivana Tunggal, Monita Natalia Siregar, Ineke
Andrayani, Nadia Okky Luciana, Trensia Imel atas kebaikan dan ketulusannya
19.
Teman-teman FSM C 2013 dan FST 2013, beserta seluruh teman-teman
angkatan 2013 Prodi S1 Farmasi Universitas Sanata Dharma atas segala
proses dan dinamika bersama selama masa perkuliahan
20.
Seluruh pihak yang tidak dapat disebutkan satu per satu atas bantuan secara
langsung maupun tidak langsung selama penyusunan skripsi
Penulis menyadari bahwa skripsi ini masih memiliki banyak kekurangan
sehingga segala saran, kritik dan masukan sangat diharapkan. Penulis berharap
skripsi ini dapat bermanfaat dalam perkembangan ilmu pengetahuan, khususnya
di bidang kesehatan.
Yogyakarta, 18 November 2016
Penulis
viii
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
PERNYATAAN KEASLIAN KARYA
Saya menyatakan dengan sesungguhnya bahwa skripsi yang saya tulis ini
tidak memuat karya atau bagian karya orang lain, kecuali yang telah disebutkan
dalam kutipan dan daftar pustaka, sebagaimana layaknya karya ilmiah.
Apabila di kemudian hari ditemukan indikasi plagiarisme dalam naskah ini,
maka saya bersedia menanggung segala sanksi sesuai peraturan perundangundangan yang berlaku.
Yogyakarta, 18 November 2016
Penulis
(Cindy)
ix
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
DAFTAR ISI
HALAMAN SAMPUL....................................................................................... i
HALAMAN JUDUL........................................................................................... ii
HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING................................................. iii
HALAMAN PENGESAHAN............................................................................ iv
HALAMAN PERSEMBAHAN......................................................................... v
PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI............................................... vi
PRAKATA......................................................................................................... vii
PERNYATAAN KEASLIAN KARYA............................................................ ix
DAFTAR ISI...................................................................................................... x
DAFTAR GAMBAR.......................................................................................... xi
DAFTAR LAMPIRAN....................................................................................... xii
ABSTRAK.......................................................................................................... xiii
ABSTRACT.......................................................................................................... xiv
PENDAHULUAN............................................................................................. 1
METODE PENELITIAN.................................................................................
3
HASIL DAN PEMBAHASAN......................................................................... 5
KESIMPULAN................................................................................................. 10
DAFTAR PUSTAKA........................................................................................ 11
LAMPIRAN...................................................................................................... 14
BIOGRAFI PENULIS....................................................................................... 32
x
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
DAFTAR GAMBAR
Gambar 1. Hasil analisis kualitatif isolat DNA menggunakan teknik
elektroforesis..................................................................................................... 6
Gambar 2. Situs penempelan primer pada sekuen CYP2A6*9......................
7
Gambar 3. Produk PCR pada berbagai suhu annealing dan siklus
Amplifikasi........................................................................................................ 7
Gambar 4. Elektroforegram produk PCR pada kondisi optimum dari
berbagai isolat DNA.........................................................................................
9
Gambar 5. Urutan nukleotida produk PCR gen CYP2A6*1 dan
CYP2A6*9........................................................................................................ 9
xi
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1. Ethical clearance........................................................................... 15
Lampiran 2. Go Taq Green Master Mix Certificate of Analysis....................... 16
Lampiran 3. Usage Information of Go Taq Green Master Mix....................... 17
Lampiran 4. Product Datasheet of DNA Ladder & Markers............................ 18
Lampiran 5. Hasil Analisis Kualitatif Isolat DNA menggunakan Teknik
Elektroforesis...................................................................................................... 19
Lampiran 6. Hasil PCR pada Optimasi Volume Primer.....................................20
Lampiran 7. Simulasi Penempelan Primer pada CYP2A6*1 dengan NCBI....... 21
Lampiran 8. Hasil Uji Reprodusibilitas PCR.................................................... 22
Lampiran 9. Hasil Sekuensing Produk PCR...................................................... 23
Lampiran 10. Tahapan manual editing pada BioEdit.......................................... 24
Lampiran 11. Hasil manual editing pada BioEdit.............................................. 27
xii
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
ABSTRAK
CYP2A6 merupakan anggota famili CYP2 dari sitokrom P450 dan
diketahui memiliki polimorfisme yang tinggi. CYP2A6*9 merupakan alel
CYP2A6 yang mengalami mutasi titik pada TATA box (T-48G) pada ujung '5
sehingga menyebabkan penurunan aktivitas. Adanya polimorfisme pada CYP2A6
dapat dideteksi dengan menggunakan teknik Polymerase Chain Reaction (PCR).
Adapun parameter penting yang mempengaruhi spesifisitas reaksi dalam PCR
antara lain suhu penempelan primer (annealing) dan jumlah siklus amplifikasi.
Primer forward, primer reverse dan reagen yang digunakan dalam
penelitian ini berturut-turut adalah 5'-GAT TCC TCT CCC CTG GAA C-3', 5'GGC TGG GGT GGT TTG CCT TTA-3', dan Promega Go Taq Green Master
Mix. Suhu annealing dioptimasi dengan pengaturan pada suhu 56 oC, 60oC, dan
64oC, sedangkan siklus amplifikasi pada 25 siklus dan 30 siklus.
Adapun kondisi PCR optimum yang didapatkan: initial denaturation
pada suhu 94oC selama 3 menit; diikuti dengan 30 siklus terdiri dari denaturation
pada suhu 94oC selama 30 detik, annealing pada suhu 60oC selama 30 detik, dan
extension pada suhu 70oC selama 25 detik; kemudian diakhiri dengan final
extension pada suhu 72oC selama 5 menit. Kondisi ini memenuhi parameter
spesifisitas dan reprodusibilitas pada validasi metode analisis.
Kata kunci:
CYP2A6*9, CYP2A6*1, PCR, optimasi, validasi
xiii
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
ABSTRACT
CYP2A6 belongs to the CYP2 family of P450 cytochromes is known
having a high polymorphism. CYP2A6*9 is an allel of CYP2A6 having point of
mutation in TATA box (T-48G) that reduced its activity. The polymorphism of
CYP2A6 could be determined using polymerase chain reaction (PCR). There have
been a few parameters important for reaction specificity in PCR including
annealing temperatures and amplification cycles number.
5'-GAT TCC TCT CCC CTG GAA C-3', 5'-GGC TGG GGT GGT TTG
CCT TTA-3', and Promega Go Taq Green Master Mix were used as the forward
primer, the reverse primer, and the reagent in these study, respectively. The
annealing temperature were optimized by adjusting the temperature at 56oC,
60oC, and 64oC, while the amplification cycles were at 25 cycles and 30 cycles.
The PCR was carried out under the following conditions: initial
denaturation at 94oC for 3 minutes; 30 cycles of denaturation at 94oC for 30
seconds, annealing at 60oC for 30 seconds, and extension at 70oC for 25 seconds;
and subsequently a final extension at 72oC for 5 minutes. These conditions met
parameters of specificity and reproducibility on analytical method validation.
Keywords: CYP2A6*9, CYP2A6*1, PCR, optimize, validation
xiv
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
PENDAHULUAN
Sitokrom P450 2A6 (CYP2A6) merupakan gen yang mengekspresikan enzim
CYP2A6 dan diketahui memiliki polimorfisme yang tinggi. Polimorfisme didefinisikan
sebagai variasi bentuk dari gen yang menghasilkan dua atau lebih varian dan masing-masing
varian memiliki frekuensi yang cukup tinggi (Maggert, 2012). Saat ini terdapat 80 jenis
bentuk polimorfi CYP2A6 yang sudah berhasil diidentifikasi (Sim, 2014). Adanya
polimorfisme CYP2A6 akan mempengaruhi aktivitas enzim pada metabolisme senyawa
xenobiotik dalam tubuh, baik dengan menurunkan, menghilangkan atau meningkatkan
aktivitas enzim (Raunio and Rahnasto-Rilla, 2012).
Enzim CYP2A6 bertanggungjawab utama dalam metabolisme nikotin, suatu
senyawa yang terkandung dalam rokok (Bloom et al., 2011) dan berperan utama terhadap
timbulnya efek ketergantungan fisik terhadap rokok (Baurley et al., 2016). Seorang perokok
akan mengalami ketergantungan fisik terhadap rokok karena mempertahankan kadar nikotin
dalam plasma sehingga dapat memberi efek psikoaktif yang berkelanjutan (Bloom et al.,
2011). Enzim CYP2A6 memetabolisme nikotin menjadi kontinin, yang selanjutnya akan
diubah menjadi 3-hidroksikotinin sebagai metabolit tidak aktif (Park et al., 2016). Enzim
CYP2A6 turut berpartisipasi dalam metabolisme beberapa senyawa kimia, baik senyawa
obat maupun senyawa toksik. Pada umumnya, substrat CYP2A6 relatif polar, dengan berat
molekul rendah hingga sedang. Contoh substrat CYP antara lain kumarin, nikotin,
metoksifluran, pilokarpin dan efavirenz. Beberapa senyawa prokarsinogen golongan
N-nitrosamin dimetabolisme oleh CYP2A6, terutama senyawa spesifik pada tembakau,
yaitu 4-(metilnitrosamino)-1-(3-piridil)-1-butanon (NNK) yang dapat diaktivasi menjadi
senyawa intermediet melalui reaksi hidroksilasi alfa, yang dapat menyebabkan timbulnya
kanker pada jaringan yang terpapar pada asap rokok, yaitu paru-paru dan laring (Raunio and
Rahnasto-Rilla, 2012).
Polimorfisme CYP2A6 banyak ditemukan pada orang-orang Asia dengan frekuensi
alel non aktif yang tinggi (Peamkrasatam et al., 2006; Yusof and Gan, 2009). Pada
penelitian genotip enzim CYP2A6 terhadap subyek uji perokok dan bukan perokok suku
Jawa Indonesia, diperoleh data bahwa pada populasi yang diteliti ditemukan bentuk alel
nonaktif CYP2A6*4 dengan frekuensi yang tinggi. Sebanyak 95% dari subyek uji yang
diteliti mempunyai bentuk genotip lain dikategorikan sebagai slow metabolizer (Patramurti
et al., 2014). Hasil penelitian menunjukkan bahwa adanya alel non aktif CYP2A6*9 pada
1
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
suatu individu akan menurunkan aktivitas CYP2A6 pada metabolisme nikotin dibandingkan
CYP2A6 normal (Yoshida et al., 2003). Seorang perokok yang memiliki alel CYP2A6*9
akan mengalami penurunan ketergantungan fisik terhadap rokok untuk mempertahankan
kadar nikotin dalam plasma sehingga tidak memerlukan peningkatan dosis untuk mendapat
efek yang sama (Minematsu et al., 2006) yang dapat menurunkan risiko terjadinya berbagai
jenis penyakit kanker yang disebabkan oleh asap rokok (Kadlubar et al., 2009; Liu et al.,
2013; Wang et al., 2013), sehingga penelitian mengenai identifikasi CYP2A6*9 perlu
dilakukan.
Polymerase Chain Reaction (PCR) merupakan metode yang dapat digunakan untuk
mendeteksi adanya polimorfisme pada suatu gen. PCR merupakan metode molekuler untuk
menggandakan potongan DNA hingga berjuta kali lipat dalam waktu yang relatif singkat.
Penggandaan tersebut tidak terlepas dari penggunaan enzim dan sepasang primer bersifat
spesifik terhadap DNA target yang akan dilipatgandakan (Joko et al., 2011). PCR mampu
mengamplifikasi suatu fragmen gen pada templat DNA berdasarkan primer tertentu
sehingga dapat diidentifikasi suatu alel dalam sampel DNA (Rahman et al., 2013). Secara
garis besar, PCR terdiri dari tiga tahapan utama, yaitu tahap denaturasi templat DNA
(denaturation), tahap penempelan primer (annealing) dan tahap pemanjangan DNA
(extension). Produk PCR yang dihasilkan dipengaruhi oleh parameter-parameter yang
berkontribusi dalam proses PCR, antara lain sepasang primer, dNTPs, buffer PCR, MgCl2,
dan enzim polimerase DNA. Ketepatan primer, suhu annealing, dan jumlah siklus
amplifikasi merupakan faktor-faktor kritis pada kondisi PCR yang dapat mempengaruhi
produk PCR (Ishmael and Stellato, 2008). Adanya penggunaan PCR dengan kondisi yang
tidak optimum akan menghasilkan produk yang tidak sesuai dengan produk target, atau
bahkan tidak menghasilkan produk (Roux, 2009). Oleh karena itu, optimasi kondisi PCR
menjadi penting untuk dilakukan.
Pengembangan metode dilakukan melalui tahapan optimasi dan validasi metode.
Optimasi metode dilakukan untuk memastikan parameter-parameter penting dalam metode
dapat memberikan hasil optimum. Optimasi metode PCR perlu dilakukan untuk
mengefisienkan waktu dan bahan sehingga proses deteksi dapat dilakukan dengan cepat dan
tepat (Joko et al., 2011). Dalam penelitian ini dilakukan optimasi suhu annealing dan jumlah
siklus amplifikasi PCR dengan cara memvariasikan suhu annealing dan jumlah siklus
amplifikasi PCR sehingga didapatkan kondisi yang paling sesuai untuk mendapatkan
fragmen gen CYP2A6*1. Adanya gen CYP2A6*1 pada subyek uji menunjukkan subyek uji
2
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
memiliki gen CYP2A6 normal yang tidak mengalami polimorfisme berupa Single
Nucleotide Polymorphism (SNP) pada TATA box menjadi CYP2A6*9 (Pitarque et al., 2001).
Validasi metode dilakukan untuk memastikan bahwa hasil yang didapatkan dari metode
optimum telah sesuai dengan tujuan penggunaannya (World Organization of Animal Health,
2013). Validasi metode dalam penelitian ini dilakukan dengan cara sekuensing produk PCR
(parameter spesifisitas) dan memastikan kondisi PCR yang digunakan mampu memberikan
hasil yang reprodusibel (parameter reprodusibilitas). Visualisasi produk PCR dilakukan
dengan teknik elektroforesis. Penelitian ini bertujuan untuk menetapkan kondisi optimum
PCR pada identifikasi alel CYP2A6*9 melalui ketiadaan alel CYP2A6*1 serta menetapkan
validitas dari metode tersebut. Penelitian ini diharapkan dapat digunakan sebagai acuan pada
identifikasi alel CYP2A6*9 melalui ketiadaan alel CYP2A6*1 menggunakan metode PCR
dan memberikan kontribusi dalam perkembangan ilmu kesehatan.
METODE PENELITIAN
Jenis dan Rancangan Penelitian. Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental
analitik murni dengan rancangan acak lengkap pola searah. Pada penelitian ini terdapat
variabel bebas, variabel tergantung dan variabel pengacau terkendali. Variabel bebas dalam
penelitian ini adalah suhu annealing dan jumlah siklus amplifikasi. Variabel tergantung
dalam penelitian ini adalah produk PCR yang dideteksi dengan elektroforesis. Variabel
pengacau terkendali dalam penelitian ini adalah kemurnian isolat DNA total dan jenis
reagen yang digunakan. Dalam penelitian ini dilakukan perlakuan pada subyek uji isolat
DNA dan dipaparkan peristiwa yang terjadi akibat perlakuan sehingga terdapat hubungan
sebab akibat antara variabel bebas dan variabel tergantung.
Bahan. Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah isolat DNA dari
populasi suku Jawa Indonesia yang pernah diteliti oleh Patramurti et al. (2014), primer
forward: 5'-GATTCCTCTCCCCTGGAAC-3', primer reverse: 5'-GGCTGGGGTGGTTTG
CCTTTA-3', Promega Go Taq Green Master Mix (berisi Taq DNA Polymerase, dNTPs,
MgCl2, dan buffer), Nuclease-Free Water (Promega), Tris-Borate-EDTA (TBE) Buffer pH
7 (Geneaid), 1% dan 1,5% gel agarose (Geneaid), larutan ethidium bromide (Geneaid) 0,44
mg/mL, 100 bp DNA Ladder (Geneaid), blue orange DNA loading dye (Geneaid), etanol
96% (Sigma Chemical Co., St. Louis), aqua bidestilata steril (Ikapharmindo).
Alat. Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah Thermal cycler (Perkin
3
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Elmer 2400), satu set Elektroforesis (Biorad), UV Transilluminator (Fisher Scientific),
microwave (National), mikrosentrifuge (Fisher Scientific), kamera Polaroid.
Analisis Kualitatif Isolat DNA. Elektroforesis menggunakan agarose 1,0 %
dilakukan dengan cara 1,5 g agarose dilarutkan dalam larutan 0,5 x TBE sebanyak 100 mL
lalu dipanaskan dalam microwave selama dua menit sampai semua agarose larut kemudian
ditambahkan 5 µL larutan EtBr dan dicampur hingga homogen. Larutan dituang ke dalam
cetakan gel, diberi sisiran pada tepi gel dan gel dibiarkan mengeras. Sisir dicabut setelah
gel mengeras sehingga terbentuk sumur-sumur. Isolat DNA sebanyak 5,0 µL (kadar 50 ng)
ditambahkan dengan aquabidest sebanyak 2,0 µL, kemudian dicampur dengan loading dye
sebanyak 1,0 µL. Campuran tersebut diambil sejumlah 7,0 µL dan dimasukkan ke dalam
sumur-sumur gel menggunakan mikropipet. Satu sumur gel diisi dengan 100 bp DNA
ladder sebanyak 2 µL sebagai marker. Gel agarose ini kemudian ditempatkan ke dalam gel
tray elektroforesis yang sudah berisi larutan bufer 0,5 x TBE dan diberi tegangan 100 volt
selama 30 menit, molekul DNA yang bermuatan negatif pada pH netral akan bergerak ke
arah positif. Gel agarose kemudian dideteksi di bawah lampu UV dan didokumentasikan
menggunakan kamera Polaroid. Panjang pita DNA dapat diketahui dengan cara menarik
garis lurus masing-masing pita sampel DNA dengan posisi pita DNA ladder.
Optimasi kondisi PCR pada amplifikasi CYP2A6. Untuk mendapatkan
fragmen DNA dari alel CYP2A6*9 dilakukan amplifikasi dengan menggunakan primer
yang diadopsi Yoshida et al. (2003), yaitu primer forward: 5'-GAT TCC TCT CCC CTG
GAA C-3', primer reverse: 5'-GGC TGG GGT GGT TTG CCT TTA-3'. Optimasi reaksi
PCR dilakukan menggunakan Promega Go Taq Green Master Mix. Kadar genomik DNA
yang digunakan kira-kira 50 ng dengan volume akhir campuran 25 μL (reagent 12,5 μL,
primer forward 1,25 μL, primer reverse 1,25 μL, isolat DNA 5,0 μL, Nuclease-Free Water 5
μL). Penentuan rentang suhu annealing dan jumlah siklus amplifikasi yang dioptimasi
dilakukan berdasarkan penelitian Patramurti et al. (2014). Amplifikasi dilakukan dengan
mesin PCR (Thermal cycler Perkin Elmer 2400). Kondisi PCR digunakan adalah sebagai
berikut: initial denaturasi pada suhu 94˚C (3’); dilanjutkan dengan denaturasi pada suhu
94˚C (30”); annealing pada suhu 56˚C, 60oC, dan 64˚C (30”) dan ekstensi pada suhu 70˚C
(25”). Siklus amplifikasi tersebut dilakukan sebanyak 25 dan 30 kali dan selanjutnya
diakhiri dengan final ekstensi pada suhu 72˚C (5’). Kondisi optimum PCR ditentukan
dengan cara melihat suhu annealing dan jumlah siklus yang dapat mengamplifikasi alel
CYP2A6*1 berdasarkan hasil produk PCR yang terdeteksi pada elektrofotogram dengan
4
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
ukuran 368-bp. Adanya gen CYP2A6*1 pada subyek uji menunjukkan subyek uji memiliki
gen CYP2A6 normal yang tidak mengalami polimorfisme menjadi CYP2A6*9.
Analisis Produk PCR menggunakan Teknik Elektroforesis. Untuk melihat
keberhasilan amplifikasi dilakukan elektroforesis dengan fase diam agarosa 1,5% yang telah
diwarnai dengan ethidium bromide dan dievaluasi menggunakan lampu UV. DNA yang
terekspresi didokumentasi dengan kamera Polaroid. Produk PCR alel normal, yaitu alel
CYP2A6*1 berada pada pita 368-bp (Yoshida et al, 2003).
Validasi Metode PCR. Validitas metode PCR dilakukan dengan menguji
parameter reprodusibilitas dan spesifisitas produk PCR. Metode PCR memenuhi parameter
reprodusibilitas bila dihasilkan elektroforegram yang sama pada 368-bp dari produk PCR
sampel isolat DNA yang berbeda. Metode PCR memenuhi parameter spesifisitas bila urutan
nukleotida produk PCR pada 368-bp sesuai dengan urutan nukleotida CYP2A6*1 pada
GenBank. Spesifisitas ditetapkan dengan melakukan sekuensing produk PCR di Macrogen,
Singapore. Hasil sekuensing dilakukan manual editing menggunakan program BioEdit.
Runutan nukleotida yang dihasilkan disejajarkan dengan runutan nukleotida CYPA6 dari
Genbank menggunakan Clustal W yang terdapat pada program BioEdit.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Studi polimorfisme pada CYP2A6 pada penelitian ini dilakukan dalam empat
tahapan, yaitu analisis kualitatif isolat DNA, optimasi PCR pada amplifikasi CYP2A6*1,
analisis produk PCR menggunakan teknik elektroforesis, dan validasi metode PCR. PCR
merupakan salah satu metode yang dapat digunakan untuk mendeteksi adanya variasi
genetik di dalam suatu populasi. Alel CYP2A6*9 merupakan jenis alel yang diidentifikasi
pada penelitian ini. Pemilihan alel CYP2A6*9 didasarkan pada adanya frekuensi alel slow
metabolizer seperti CYP2A6*9 yang sangat tinggi pada populasi Asia, terutama pada
populasi oriental (Raunio and Rahnasto-Rilla, 2012).
Analisis kualitatif isolat DNA. Isolat DNA yang digunakan pada penelitian ini
merupakan isolat DNA yang pernah diteliti oleh Patramurti et al. (2014). Isolat DNA
dianalisis secara kualitatif menggunakan teknik elektroforesis (Broeders et al., 2014). Hasil
elektroforesis menunjukkan adanya variasi bentuk pita, baik pita tunggal dan tebal, maupun
pita ganda dan tipis dengan ukuran lebih dari 3000 bp (Gambar 1). Adanya variasi bentuk
pita dapat disebabkan karena adanya isolat DNA yang tidak murni, tercemar (Patramurti et
5
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
al., 2014) atau terdegradasi (ECJRC, 2012). Adapun isolat DNA yang dipilih untuk
digunakan dalam penelitian adalah isolat DNA yang menghasilkan pita tunggal dan tebal
dengan ukuran lebih dari 3000 bp, yang menunjukkan bahwa isolat DNA yang digunakan
masih dalam keadaan murni, tidak tercemar oleh protein lain serta tidak terdegradasi
(Patramurti et al., 2014).
M
1
2
3
4
5
6
7
8
Isolat DNA
3000
1500
1000
500
200
100
Gambar 1. Hasil analisis kualitatif isolat DNA menggunakan teknik elektroforesis
Keterangan:
M
: 100 bp DNA Ladder (Geneaid) sebagai marker
1-3, 8
: Isolat DNA dengan pita tipis dan tunggal
4
: Isolat DNA dengan pita tipis dan ganda
5
: Isolat DNA dengan pita tebal dan ganda
6-7
: Isolat DNA dengan pita tebal dan tunggal
Kondisi Elektroforesis : Fase diam agarose 1%; Fase Gerak Larutan TBE 0,5%; Kecepatan 100 V/cm;
Vol. Injeksi 6 μL
Optimasi Kondisi PCR pada Amplifikasi CYP2A6. Identifikasi alel dari
CYP2A6*9 pada penelitian ini mengadopsi dari penelitian yang pernah dilakukan oleh
Yoshida et al. (2003). Primer yang digunakan untuk mengamplifikasi alel CYP2A6*1
adalah primer forward: 5'-GAT TCC TCT CCC CTG GAA C-3' dan primer reverse:
5'-GGC TGG GGT GGT TTG CCT TTA-3'. Spesifisitas primer akan menentukan
keberhasilan proses PCR, karena spesifisitas menentukan kemampuan primer untuk
menempel pada sekuen target pada isolat DNA (McPherson and Moller, 2006). Amplifikasi
alel CYP2A6*1 menggunakan primer forward 5'-GATTCCTCT CCC CTG GAA C-3' akan
mengamplifikasi ekson 395 sampai 376, sedangkan primer reverse 5'-GGC TGG GGT
GGT TTG CCT TTA-3' akan mengamplifikasi ekson 48 sampai 28 dari gen CYP2A6*1
6
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
(Yoshida et al., 2003). Amplifikasi gen CYP2A6 menggunakan primer tersebut
menghasilkan produk PCR yang berukuran 368-bp yang merupakan produk dari alel
CYP2A6*1. Situs penempelan primer pada sekuen urutan basa potongan gen CYP2A6*1
pada daerah yang diamplifikasi disimulasikan dengan http://ncbi.nlm.nih.gov/ dan
diilustrasikan seperti pada Gambar 2.
Alel CYP2A6*1
Primer forward
5'
GATTCCTCTCCCCTGGAAC
CTAAGGAGAGGGGACCTTG
3'
TAAAGGCAAACCACCCCAGCC
ATTTCCGTTTGGTGGGGTCGG
5'
3'
Primer reverse
Gambar 2. Situs penempelan primer pada sekuen CYP2A6*1
Keterangan:
: arah penempelan primer forward
: arah penempelan primer reverse
Penggunaan suhu annealing dengan jumlah siklus amplifikasi berturut-turut 56oC, 25
siklus; 56oC, 30 siklus; 64oC, 30 siklus belum dapat mengamplifikasi CYP2A6 seperti yang
dikehendaki. Hal ini dapat dilihat pada hasil elektroforegram yang ditunjukkan pada Gambar
3, yaitu adanya produk PCR yang tipis, tidak terlihat jelas, dan adanya pita DNA berukuran
selain 368-bp pada elektroforesis. Penggunaan suhu annealing 60oC dan jumlah siklus
amplifikasi 30 siklus telah mampu mengamplifikasi CYP2A6 seperti yang dikehendaki,
karena menghasilkan satu produk PCR spesifik, dengan pita DNA tebal dan berukuran
368-bp pada elektroforesis (Stephenson and Abilock, 2012).
Penggunaan suhu annealing 56oC dan 64oC menyebabkan terbentuknya pita DNA
berukuran selain 368-bp. Hal ini dapat disebabkan karena suhu annealing tidak sesuai untuk
menempelkan primer pada DNA target, sehingga primer tidak menempel pada DNA target
(Rahman et al., 2013) atau terjadi mispriming (McPherson and Moller, 2006), yang
menghasilkan pita DNA selain pita berukuran 368-bp. Jumlah siklus amplifikasi sebanyak
25 siklus telah mampu menghasilkan produk PCR, namun pita yang dihasilkan belum
berupa pita tebal. Hal ini disebabkan karena pada amplifikasi 25 siklus, reaksi belum terjadi
secara optimal (Innis, M.A., and Gelfand, D.H., 1990) sehingga masih terdapat primer yang
tersisa. Adanya primer yang tersisa terlihat pada elektroforegram (Gambar 3). Pada jumlah
siklus amplifikasi 30, primer digunakan untuk menggandakan DNA secara optimal sehingga
tidak terlihat sisa primer pada elektroforegram. Oleh karena itu, suhu annealing dan jumlah
sikus amplifikasi yang optimum untuk amplifikasi CYP2A6 menggunakan primer forward:
7
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
5'-GAT TCC TCT CCC CTG GAA C-3' dan primer reverse: 5'-GGC TGG GGT GGT TTG
CCT TTA-3'berturut-turut adalah 60oC dan 30 siklus.
1
1
2
2
B
M
3
3
4
4
3000
1500
1000
produk PCR 368 bp
500
300
200
100
produk PCR mispriming
primer tersisa
Gambar 3. Produk PCR pada berbagai suhu annealing dan siklus amplifikasi
Keterangan:
1
: 64OC, 30 siklus
2
: 60OC, 30 siklus
3
: 56OC, 30 siklus
4
: 56OC, 25 siklus
B
: Kontrol Negatif
M
: 100 bp DNA Ladder (Geneaid) sebagai marker
Kondisi Elektroforesis : Fase diam Agarose 1,5%; Fase Gerak Larutan TBE 0,5%; Kecepatan 100
V/cm; Vol. Injeksi 6 μL
Validasi Metode PCR. Validitas metode PCR ditentukan dengan menguji
reprodusibilitas dan spesifisitas produk PCR. Reprodusibilitas dari reaksi kondisi
amplifikasi alel CYP2A6*1 menggunakan primer forward: 5'-GAT TCC TCT CCC CTG
GAA C-3' dan primer reverse: 5'-GGC TGG GGT GGT TTG CCT TTA-3' pada kondisi
optimum ini dapat dilihat dari hasil reaksi PCR sepuluh sampel isolat DNA yang berbeda,
di mana pada semua sampel menghasilkan satu produk PCR yang sama dengan panjang
pita 368 bp (Gambar 4). Kontrol negatif yang berisi campuran yang digunakan pada PCR
tanpa isolat DNA (reagent 12,5 μL, primer forward 1,25 μL, primer reverse 1,25 μL,
Nuclease-Free Water 10 μL) tidak menghasilkan pita DNA pada 368-bp yang
menunjukkan bahwa campuran tersebut tidak mempengaruhi produk PCR. Dari hasil
pengujian, dapat ditetapkan bahwa kondisi optimum PCR tersebut telah memenuhi
parameter reprodusibilitas.
8
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
B
1
2
3
4
5
M
6
7
8
9
10
3000
1500
1000
produk PCR 368 bp
500
300
200
100
Gambar 4. Elektroforegram produk PCR pada kondisi optimum dari berbagai isolat DN
Keterangan:
M
: 100 bp DNA Ladder (Geneaid) sebagai marker
B
: kontrol negatif
1-10
: Produk PCR dari berbagai isolat DNA yang berbeda
Kondisi Elektroforesis : Fase diam Agarose 1,5%; Fase Gerak Larutan TBE 0,5%; Kecepatan 100
V/cm; Vol. Injeksi 6 μL
Spesifisitas PCR ditetapkan melalui sekuensing produk PCR (Broeders et al., 2014).
Pembacaan sekuen merupakan hal penting dan utama dalam biologi molekuler karena
dapat mengetahui komposisi nukleotida suatu gen. Hasil sekuensing urutan basa potongan
alel gen menunjukkan bahwa produk PCR memiliki urutan basa yang sama dengan urutan
basa alel CYP2A6*1 menurut GenBank. Hal ini menunjukkan bahwa kondisi optimum
PCR telah memenuhi parameter spesifisitas. Pada hasil sekuensing produk PCR terlihat
bahwa urutan basa alel CYP2A6*1 mempunyai perbedaan sebanyak 1-bp terhadap alel
CYP2A6*9, yang disebabkan oleh adanya single nucleotide polymorphism (SNP) T-48G
pada CYP2A6 (Gambar 5). Adanya perbedaan urutan basa antara alel CYP2A6*9 dan
CYP2A6*1 menyebabkan primer forward: 5'-GATTCCTCTCCCCTGGAAC-3' dan primer
reverse: 5'-GGCTGGGGTGGTTTGCCTTTA-3' mengamplifikasi alel CYP2A6*1 secara
spesifik. Adanya perbedaan urutan basa tersebut mengakibatkan terjadinya perbedaan
urutan asam amino yang dikode oleh kedua alel, yang menyebabkan alel CYP2A6*9
mengalami penurunan aktivitas dalam mengekspresikan enzim CYP2A6 (Pitarque et al.,
2001).
A. CYP2A6*1 GGATTCCTCTCCCCTGGAACCCCCAGATCCACAACTTTGGGGTGC
B. CYP2A6*1 TGATTCCTCTCCCCTGGAACCCCCAGATCCACAACTTTGGGGTGC
C. CYP2A6*9 GGATTCCTCTCCCCTGGAACCCCCAGATCCACAACTTTGGGGTGC
9
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
A. CYP2A6*1 ATTCTCACTCTCAGACCCCAAATCCAAAGCCCAAGTGCTCCCCTA
B. CYP2A6*1 ATTCTCACTCTCAGACCCCAAATCCAAAGCCCAAGTGCTCCCCTA
C. CYP2A6*9 ATTCTCACTCTCAGACCCCAAATCCAAAGCCCAAGTGCTCCCCTA
A. CYP2A6*1 TGCAAATATTCCAAACTCCTCAGTTCTACAGCTTATCTGTTGCCC
B. CYP2A6*1 TGCAAATATTCCAAACTCCTCAGTTCTACAGCTTATCTGTTGCCC
C. CYP2A6*9 TGCAAATATTCCAAACTCCTCAGTTCTACAGCTTATCTGTTGCCC
A. CYP2A6*1 CCTCCTAAATCCACAGCCCTGCGGCACCCCTCCTGAAGTACCACA
B. CYP2A6*1 CCTCCTAAATCCACAGCCCTGCGGCACCCCTCCTGAAGTACCACA
C. CYP2A6*9 CCTCCTAAATCCACAGCCCTGCGGCACCCCTCCTGAAGTACCACA
A. CYP2A6*1 GATTTAGTCTGGAGGCCCCCTCTCTGTTCAGCTGCCCTGGGGTCC
B. CYP2A6*1 GATTTAGTCTGGAGGCCCCCTCTCTGTTCAGCTGCCCTGGGGTCC
C. CYP2A6*9 GATTTAGTCTGGAGGCCCCCTCTCTGTTCAGCTGCCCTGGGGTCC
A. CYP2A6*1 CCTTATCCTCCCTTGCTGGCTGTGTCCCAAGCTAGGCAGGATTCA
B. CYP2A6*1 CCTTATCCTCCCTTGCTGGCTGTGTCCCAAGCTAGGCAGGATTCA
C. CYP2A6*9 CCTTATCCTCCCTTGCTGGCTGTGTCCCAAGCTAGGCAGGATTCA
A. CYP2A6*1 TGGTGGGGCATGTAGTTGGGAGGTGAAATGAGGTAATTATGTAAT
B. CYP2A6*1 TGGTGGGGCATGTAGTTGGGAGGTGAAATGAGGTAATTATGTAAT
C. CYP2A6*9 TGGTGGGGCATGTAGTTGGGAGGTGAAAGGAGGTAATTATGTAAT
A. CYP2A6*1 CAGCCAAAGTCCATCCCTCTTTTTCAGGCAGTATAAAGGCAAACC
B. CYP2A6*1 CAGCCAAAGTCCATCCCTCTTTTTCAGGCAGTATAAAGGCAAACC
C. CYP2A6*9 CAGCCAAAGTCCATCCCTCTTTTTCAGGCAGTAGAAAGGCAAACC
A. CYP2A6*1 ACCCCAGCCG
B. CYP2A6*1 ACCCCAGCCA
C. CYP2A6*9 ACCCCAGCC
Gambar 5. Urutan nukleotida produk PCR gen CYP2A6*1 dan CYP2A6*9 (perbedaan 1-bp
ditunjukkan oleh warna hijau dan kuning, primer ditunjukkan oleh warna merah)
Keterangan :
A :
potongan urutan basa CYP2A6*1 menurut Gen Bank
B :
urutan basa konsensus CYP2A6*1 hasil sekuens
C :
urutan basa CYP2A6*9 menurut teori Yoshida et al (2003)
KESIMPULAN
Kondisi optimum PCR pada identifikasi CYP2A6*9 menggunakan primer forward
5'-GATTCCTCTCCCCTGGAAC-3' dan primer reverse 5'-GGCTGGGGTGGTTTG
CCTTTA-3' dengan Promega Go Taq Green Master Mix adalah sebagai berikut: initial
denaturation 94oC (3 menit); 30 siklus terdiri dari denaturation 94oC (30 detik), annealing
60oC (30 detik), extension 70oC (25 detik); diakhiri final extension 72oC (5 menit). Kondisi
ini memenuhi parameter spesifisitas dan reprodusibilitas pada validasi metode analisis.
10
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
DAFTAR PUSTAKA
Baurley, J.W., Edlund, C.K., Pardamean, C.I., Conti, D.V., and Bergen, A.W., 2016,
Smokescreen: A Targeted Genotyping Array for Addiction Research, BMC Genomics,
17, 1-12.
Bloom, A.J., Hinrichs, A.L., Wang, J.C., Von-Weymarn, L.B., Kharasch, E.D.,Bierut, L.J., et
al, 2011, The Contribution of Common CYP2A6 Alleles to Variation in Nicotine
Metabolism Among European Americans, Pharmacogenetic Genomics, 21(7),
403-416.
Broeders, S., Huber, I., Grohmann, L., Berben, G., Taverniers, I., Mazzara, M., Roosens, N.,
and Morisset, D., 2014, Guidelines for Validation of Qualitative Real-Time PCR
Mehods, Trends in Food Science & Technology, 37, 115-126.
European Commission Joint Research Centre, 2012, Report on the Single-Laboratory
Validation of A PCR-Based Detection Method for Identification of FlorigeneTM
IFD-25958-3 GM Carnation, EU-RL GMFF, 1-15.
Ishmael, F.T., and Stellato, C., 2008, Principles and Applications of Polymerase Chain
Reaction: Basic Science for The Practicing Physician, Annals of Allergy, Asthma, and
Immunology, 101, 437-443.
Joko, T., Kusumandari, N., and Hartono, S., 2011, Optimasi Metode PCR untuk Deteksi
Pectobacterium carotovorum, Penyebab Penyakit Busuk Lunak Anggrek, Jurnal
Perlindungan Tanaman Indonesia, 17(2), 54-59.
Kadlubar, S., Anderson, J.P., Sweeney, C., Gross, M.D, Lang, N.P., Kadlubar, F.F. et al, 2009,
Phenotypic CYP2A6 Variation and the Risk of Pancreatic Cancer, Journal of the
Pancreas, 10(3), 263–270.
Liu, Y., Xu, Y., Li, F., Chen, H., and Guo, S., 2013, CYP2A6 Deletion Polymorphism is
Associated with Decreased Susceptibility of Lung Cancer in Asian Smokers: a
Meta-Analysis, Tumour Biology: the Journal of International Society for
Oncodevelopmental Biology and Medicine, 34(5), 2651–2567.
Maggert, K.A., 2012, Genetics: Polymorphisms, Epigenetics, and Something In Between,
Genetic Research International, 1-9.
McPherson, M.J., and Moller, S.G., 2006, PCR, 2 edition, New York: Taylor & Francis,
292.
Minematsu, N., Nakamura, H., Furuuchi, M., Nakajima, T., Takahashi, S., Tateno, H., et al.,
2006, Limitation of Cigarette Consumption by CYP2A6*4, *7 and *9 Polymorphisms,
European Respiratory Journal, 27(2), 289–292.
Park, L.S., Tiirikainen, M.I., Patel, Y.M., Wilkens, L.R., Stram, D.O., Marchand, L.L., et al.,
2016, Genetic Determinants of CYP2A6 Activity Across Racial/Ethnic Groups with
Different Risks of Lung Cancer and Effect on Their Smoking Intensity, Carcinogenesis,
37(3), 269-279.
Patramurti, C., Sugiyanto, Nurrochmad, A., and Martono, S., 2014, Polymorphism of
Cytochrome P450 2A6 (CYP2A6*1 and CYP2A6*4) Among Javanese Indonesian
Smoker and Non Smoker, Indonesian Journal of Pharmacy, 26(1), 11-19.
Peamkrasatam, S., Sriwatanakul, K., Kiyotani, K., Fujieda, M., Yamazaki, H., Kamataki, T.,
et al., 2006, In Vivo Evaluation of Coumarin and Nicotine as Probe Drugs to Predict the
Metabolic Capacity of CYP2A6 Due To Genetic Polymorphism in Thais, Drug
Metabolism and Pharmacokinetics, 21(6), 475-484.
Pitarque, M., Richter, O., Oke, B., Berkkan, H., Oscarson, M., and Ingelman-Sundberg, M.,
2001, Identification of a Single Nucleotide Polymorphism in the TATA Box of the
CYP2A6 Gene: Impairment of Its Promoter Activity, Biochemical and Biophysical
11
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Research Communications, 284, 455-460.
Rahman, M.T., Uddin, M.S., Sultana, R., Mone, A., and Setu, M., 2013, Polymerase Chain
Reaction (PCR): A Short Review, Anwer Khan Modern Medical College Journal, 4(1),
30-36.
Raunio, H. and Rahnasto-Rilla, M., 2012, CYP2A6: Genetics, Structure, Regulation, and
Function, Drug Metabolism and Drug Interactions, 27(2), 73-88.
Roux, K.H., 2009, Optimization and Troubleshooting in PCR, Cold Spring Harbor
Protocols, 4(4), 1-6.
Stephenson, F.H. and Abilock, M.C., 2014,PCR Optimization.
Sim,
S.C.,
2014,
CYP2A6
Allele
Nomenclature
(Online),
http://www.cypalleles.ki.se/cyp2a6.htm., accessed 10 Maret 2014.
Wang, L., Zang, W., Liu, J., Xie, D., Ji, W., Pan, Y., et al, 2013, Association of CYP2A6*4
with Susceptibility of Lung Cancer: A Meta-Analysis, PLoS ONE, 8(4),1-5.
World Organization of Animal Health, 2013, Principles and Methods of Validation of
Diagnostic Assays for Infectious Dieseases, OIE Terrestrial Manual, 1-17.
Yoshida, R., Nakajima, M., Nishimura, K., Tokudome, S., Kwon, J-T., and Yokoi, T., 2003,
Effects of Polymorphism in Promoter Region of Human CYP2A6 gene (CYP2A6*9)
on Expression Level of Messenger Ribonucleic Acid and Enzymatic Activity In Vivo
and In Vitro, Clinical Pharmacology and Therapeutics, 74(1), 69-76.
Yoshida, R., Nakajima, M., Watanabe, Y., Kwon, J-T., and Yokoi, T., 2002, Genetic
Polymorphisms in Human CYP2A6 Gene Causing Impaired Nicotine Metabolism, Br.
J. Clin. Pharmacol., 54(5), 511-517.
Yusof, W. and Gan, S.H., 2009, High Prevalence of CYP2A6*4 and CYP2A6*9 Alleles
Detected Among a Malaysian Population, Clinica Chimica Acta: International Journal
of Clinical Chemistry, 403(1-2),105–9.
Zhu, A.Z.X., Renner, C.C., Hatsukami, D.K., Swan, G.E., Lerman,C., Benowitz, N.L., dkk.,
2013, The Ability of Plasma Cotinine to Predict Nicotine and Carcinogen Exposure is
Altered by Differences in CYP2A6: the Influence of Genetics, Race, and Sex, Cancer
Epidemiology Biomarkers and Prevention, 22(4), 708-718.
12
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
LAMPIRAN
13
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Lampiran 1. Ethical clearance
14
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Lampiran 2. Go Taq Green Master Mix Certificate of Analysis
15
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Lampiran 3. Usage Information of Go Taq Green Master Mix
16
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Lampiran 4. Product Datasheet of DNA Ladder & Markers
17
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Lampiran 5. Hasil Analisis Kualitatif Isolat DNA menggunakan Teknik Elektroforesis
9
10
11
12
13
14
15
16 M
17
Isolat DNA
3000
1500
1000
500
200
100
18
19
20
21
22
23
24
25 M
26
Isolat DNA
3000
1500
1000
500
200
100
Hasil analisis kualitatif isolat DNA menggunakan teknik elektroforesis
Keterangan:
M
: Marker (100 bp DNA Ladder Geneaid)
9-25
: Isolat DNA
Kondisi Elektroforesis : Fase diam agarose 1%; Fase Gerak Larutan TBE 0,5%; Kecepatan 100 V/cm;
Vol. Injeksi 6 μL
18
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Lampiran 6. Hasil PCR pada Optimasi Volume Primer
A
A
M
B
B
C
C
3000
1500
1000
500
200
100
Produk PCR 368-bp
Produk PCR pada berbagai volume primer
Keterangan:
A
B
C
M
Kondisi Elektroforesis
V/cm; Vol. Injeksi 6 μL
: 1 μL
: 1,25 μL
: 1,5μL
: Marker (100 bp DNA Ladder Geneaid)
: Fase diam Agarose 1,5%; Fase Gerak Larutan TBE 0,5%; Kecepatan 100
19
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Lampiran 7. Simulasi penempelan primer pada CYP2A6*1 dengan NCBI
20
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Lampiran 8. Hasil Uji Reprodusibilitas PCR
a b c
d e
f
g
h M i
j
k
l mn
o p
3000
1500
1000
500
200
100
Isolat DNA
q
r s
t
u
v
w
x M
y
z
1
2
3
4
5
6
3000
1500
1000
500
200
100
Isolat DNA
Elektroforegram produk PCR pada kondisi optimum dari berbagai isolat DN
Keterangan:
M
: Marker (100 bp DNA Ladder Geneaid)
a-ff
: Produk PCR dari berbagai isolat DNA yang berbeda
Kondisi Elektroforesis : Fase diam Agarose 1,5%; Fase Gerak Larutan TBE 0,5%; Kecepatan 100
V/cm; Vol. Injeksi 6 μL
21
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Lampiran 9. Hasil Sekuensing Produk PCR
22
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Lampiran 10. Tahapan manual editing pada BioEdit
23
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
24
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
25
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
26
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Lampiran 11. Hasil manual editing pada BioEdit
>ConsensusA (primer forward)
TGATTCCTCTCCCCTGGAACCCCCAGATCCACMACTTTGGGGTGCATTCTCACT
CTCAGACCCCAAATCCAAAGCCCAAGTGCTCCCCTATGCAAATATTCCAAACTC
CTCAGTTCTACAGCTTATCTGTTGCCCCCTCCTAAATCCACAGCCCTGCGGCACC
CCTCCTGAAGTACCACAGATTTAGTCTGGAGGCCCCCTCTCTGTTCAGCTGCCC
TGGGGTCCCCTTATCCTCCCTTGCTGGCTGTGTCCCAAGCTAGGCAGGATTCATG
GTGGGGCATGTAGTTGGGAGGTGAAATGAGGTAATTATGTAATCAGCCAAAGTC
CATCCCTCTTTYTCAGGCAGTATAAAGGCAAACCACCCCAGCCA
>ConsensusB (primer reverse)
TGATTCCTCTCCCCTGGAACCCCCAGATCCACAACTTTGGGGTGCATTCTCACTC
TCAGACCCCAAATCCAAAGCCCAAGTGCTCCCCTATGCAAATATTCCAAACTCC
TCAGTTCTACAGCTTATCTGTTGCCCCCTCCTAAATCCACAGCCCTGCGGCACCC
CTCCTGAAGTACCACAGATTTAGTCTGGAGGCCCCCTCTCTGTTCAGCTGCCCT
GGGGTCCCCTTATCCTCCCTTGCTGGCTGTGTCCCAAGCTAGGCAGGATTCATGG
TGGGGCATGTAGTTGGGAGGTGAAATGAGGTAATTATGTAATCAGCCAAAGTCC
ATCCCTCTTTTTCAGGCAGTATAAAGGCAAACCACCCCAGCCA
Dibandingkan dengan sekuens CYP2A6*1 pada GenBank :
CCCTTACGCCCTCCTGAAGCAGGACACTCTTATGCCCTCAATGACACCTGAGACAACACACA
GAGCCCTC
TTGGCACCAAACATGACTTCAATATTCTCCTGGTGTCAAGTTCAGTGCCAACTTGTTTCCCAT
CCTCGCA
TACACCTGGGGGCAGTCCCAAAGCCAACACGATGCCTTTCCCTCCCTGGCCATACCTGATGC
TGATATCA
GAACCCACCAATGTCATCAGTGTGTCCACTGCTGATGCCAGTCCCAGCACTCACCTCCTGCT
AAGGCTGG
CCTGCACTTGACTCCCAGGGTGATCTAGGCCAGTCAATGAAGGGGGGTGAGGAGAAAGTTC
ACATCCCAG
CTCCCTCACTTACTCCCTGTGTGACCTCACTCAAGAGGATTTATGGAGTCTAGATCTGCTCAT
CTTCAAA
ATGAGGATGATCATGATGAACCAACCTCATTGTTACAAAGATTCAACCAGATCATACACACCT
AGACTTA
ATCTTCCCGTATACGACCATGCTCACCAAAGGGTAACTGTCCTGTTTACTAAGGAAGAATTTC
CCTGAGG
GAAGGACAGGAGGGCTACTCATCCCTTCTCCACTCACACCCACCCCAGGATCTGCCTCTGTG
CCTAATAC
TGGAGTTTACCCCAATCTCTTCTGCCACTGTTCCCTCTGCCTGCTAATAGTAGTAGCCCCTGA
CAAAGCA
GGAATCATTCTTAAAGGAGACTTAACTCACCCTCGAATGTGATCTTCTCTTCCCAAACACTCC
CTTTCCA
CTGGCAGGAAAACCAAATCCAGAAAGGGGAACTAAGTACACAGAGCAGGAGAGATGGGAG
TTCAGGGCCA
CTCACACATGTCCCCTGCCCACTGTCTGTTTTCTGTCCTCTGTAGATCTTTATATAAAATGAGA
AACATA
AACAACAATCATAATATTAATAGGGATGATACAATCAATCTAGTGGGTTTCCCTGAGGATCTG
GGTTGGA
AACCAGCGGACAACCCTTGGGACACTTGAGATTTTTCCACCATTTGGGGGTTGTTATTACTAT
TTCTCCA
GACCTAGCCAATCCCTCTGCCAACCGCTAACTCCAGGTACTCTTCTCCAGGTGTGGGGAAAG
27
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
TTCCCCTG
AAATATGGCTCTGGTCTTCCTCCCCTTCCCAATCAGAGATGGGCAGTGGAGGTTCTATGGCA
CCCATCCT
GGCCTCACTCTGAGGTTCCAATGAGGATTCTGGGCATCAAGAGACAGCTCTGGGCAAAAGC
AAAATCAAG
TCAGCCCCTGGACCCAGTGCTGGGCTGCTGGGCTTTCTGGGAGAACCCGCTGGGCTTGCTA
CACACTCCT
CCTCCCAGAAACTCCACACCCACAGCCCTGGGTCTTCCTAGCCCCGAGACTTTCAAGTCCAT
ATGCCTGG
AATCCCCCTTCCTGAGACCCTTAACCCTGCATCCTCCACAACAGAAGACCCCTAAATGCACA
GCCACACT
TTGTCTTACCCTAATAAAACCCAGACCTTTGGATTCCTCTCCCCTGGAACCCCCAGATCCACA
ACTTTGG
GGTGCATTCTCACTCTCAGACCCCAAATCCAAAGCCCAAGTGCTCCCCTATGCAAATATTCC
AAACTCCT
CAGTTCTACAGCTTATCTGTTGCCCCCTCCTAAATCCACAGCCCTGCGGCACCCCTCCTGAA
GTACCACA
GATTTAGTCTGGAGGCCCCCTCTCTGTTCAGCTGCCCTGGGGTCCCCTTATCCTCCCTTGCTG
GCTGTGT
CCCAAGCTAGGCAGGATTCATGGTGGGGCATGTAGTTGGGAGGTGAAATGAGGTAATTATGT
AATCAGCC
AAAGTCCATCCCTCTTTTTCAGGCAGTATAAAGGCAAACCACCCCAGCCGTCACCATCTATC
ATCCCACT
ACCACCATGCTGGCCTCAGGGATGCTTCTGGTGGCCTTGCTGGTCTGCCTGACTGTGATGGT
CTTGATGT
CTGTTTGGCAGCAGAGGAAGAGCAAGGGGAAGCTGCCTCCGGGACCCACCCCATTGCCCTT
CATTGGAAA
CTACCTGCAGCTGAACACAGAGCAGATGTACAACTCCCTCATGAAGGTGTCCCAAGGCAGG
GAGATGGGT
GGCACGGGGTGGGGGCTGCCTAGTTGGCTGGGGCTTTGTGGCAGGGGGTTGACCAGTGTG
GACCAGAGTC
TTAGGAAATGGAGTTTTGGAGTTTCAGCATCAGAAAGACAGGATCTTGGGATGTCCAGCTCC
CTGACTGT
GAGAACCTGGGTGCGAAGCATCCCAGCACATGACATCTCGGTGCTGGGCCCCATTCAGAGT
GGAGGCTTC
TCCCTCTAACCACTCCCACCCACCTCCATCAGATCAGTGAGCGCTATGGCCCCGTGTTCACC
ATTCACTT
GGGGCCCCGGCGGGTCGTGGTGCTGTGTGGACATGATGCCGTCAGGGAGGCTCTGGTGGAC
CAGGCTGAG
GAGTTCAGCGGGCGAGGCGAGCAAGCCACCTTCGACTGGGTCTTCAAAGGCTATGGTGAG
GGGGTGCCCA
AGAGGGGGAAGGTGGCCAGGTGGACACGAAGGTCTCAGTGTTCCCAGCCTTCTCCCTGACT
CTCCTGCCA
ACTGGAGGCTAAGGCAGAGTCCCCAGTCTGGTCTTCCCTCCCCATCTCCCTTCATTGTGGCC
TCTCCATG
TGTATCCCTCACCTGTCTCCAGCGTCCCTGTCCTGATTCCTCCCTGCCTCTCTCTGCCCCACC
TCCTTAT
TCTCTCTCACTGGAGTCTCCTCTTTCCCCTCTCTCTCCATCTCTAAGGACATCCTGGGTTTCT
GTTTTCC
AGCCCTGGTTCTCTGTCTTCATTTGTCTTTTTGTCCCTCTTAGCTTCTGGGCTTCTCTGTGTTT
CTCATC
TCTCCGCATCCCTTTCTCACTTCTTCCTCTGTCTTAGGATTTCAGGGTATTCCTACTTCCACAT
CTTCAG
CCTCCATCTCCTGGTAACAGTCTCTCTTCCTTCCAGACCCTCTCTGTTTCTATCTCAATATTTT
TCTCTC
TTCTCCAGCTCAGCTTAAGAATGTTTCACCATTTTTATTTCCTCCTCCCAGATCTCCCCATATC
28
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
TCACTT
CCCCTCCCTCCATCCTCTTCCTCCATCACTCTCTTTCTCTCCCCACTTCCTTCCCTTCCTCCAT
GGAGTG
TCCCCTTATCCCTCTGTTTCTATGTGCATCTCTCTGTCTGGCCTTTCTGTTTCTTTTCTGATTGT
CTTAT
TCTTTAAACCTGGTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCCTCTCTCT
CTTCT
CTCTCTCTCTCCTCTCTCTCTTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCCTCTCTCTCTTCTCTCTCTC
TCTCT
CTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTACCTCGACATCGTGTTTCTCTGACTGAGTTTGCAGCTCTGC
TGGGCAA
TGGCGCTGAATCCATCTCTCTCCCACCCTACTCCCTCTCTCCTCCACCCTTGGGGAGCCCCTT
GGAGCTG
CTCCGCTCCTGCCCCCGCCGCCCCCTGGCCTGTCTCCATTCCCGCGTTCACCTCCCCAGGCG
TGGTATTC
AGCAACGGGGAGCGCGCCAAGCAGCTCCGGCGCTTCTCCATCGCCACCCTGCGGGACTTCG
GGGTGGGCA
AGCGAGGCATCGAGGAGCGCATCCAGGAGGAGGCGGGCTTCCTCATCGACGCCCTCCGGG
GCACTGGCGG
TGAGCAGGGGACCCCGAGTGCGGGGGCAGGAGAAGGAAAACACCCAGGACGAGGAACCC
GCGCGCGTTCT
GCCTGGGGATGGGGACTAGGTGGGGAAAGGCGCCCGCACTTCCAGCCCTGGAGTCTGGCG
CTGGGAATTT
GGCTCAACAAGGCCCTGCCTCCTGGAATTCTGACTCTCCTCAGACCTCTGAGTTGACTCTCT
CCCCAACC
CCCTTCTCCCGCCATACCCGCAGGCGCCAATATCGATCCCACCTTCTTCCTGAGCCGCACAGT
CTCCAAT
GTCATCAGCTCCATTGTCTTTGGGGACCGCTTTGACTATAAGGACAAAGAGTTCCTGTCACT
GTTGCGCA
TGATGCTAGGAATCTTCCAGTTCACGTCAACCTCCACGGGGCAGGTAACTGGCTGCAGCCC
GGCCCGTGA
CGCCCCTACCACAACCTGCCAACTGCTCCCCTACCTGGAGACAGGTGCCCCAAACTCCCAC
CGCCCTCCA
GACAGTGTCCCCTCAAAATCAGTCCCCGATATTGGACAACTGGACAGTTGCACCAGAACCC
AGGATGGAT
GTCCAATACCCTGTCTCCAAGGACACCTGGATAGCTCAACAGATGCTCCCCAAAACAGAGC
CTGCTGGCA
GGATGCATACCCTCAGCTCAGCTCTCTCACCTGGGCACATGTTCCCATCCCCAACTTACCGTA
ATTTCTA
ACAGATGCTCCCTACCCAGTTCTTCTGAATATTTTAACACCTGGACAAGTGACTGCGTCAAC
CGGCCTCC
TGCATACCTGAACACCTGGTGCTGCAAAATCCAGCCCATCATAATCATTTCACATCTACACAA
ATGTCCC
AGATTAGCCCACTGGAATATCTGGCCAAGCGCCCTCTACTTCACCCACTTAAATACCTGAAA
ACATGGAC
AGCTGCCCTAACCAACACCTTAAACACATAAATATCTAGACAGATTGTTCCCTGACACACAA
ATAAGTGT
TCCCCAACCCTTTCCAATCACACACCTTACAGAGGTGCTCCCAGTGCATCCCACTTGGATAG
GTAAACAC
CTCAACAGGTATCCCCTCCACTTCAACATCTTCACCAGCCCCACTTTAATACCTGAGCACCTG
AACAAAA
GCCCCCAATCCAGACCCAGTAAGTATCTGGACAGCTGTCTCCAACCAAGCCTACTTGAATGC
CTAAATAC
CTAGACAGGTGACACTCACCTCATACCAGCCCCACCTGAAGAGCTAAACACCTGGACAGGT
GTCTTCCAA
CTCAACTTCACTTGAATATCTGAACACCTAGATGTGTGCTCCAATCCAGCCTCGTTTAAATAC
29
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
CTGAAAC
CTGGATATATGTCTCAGTTCTTCTCACCTAAATTACTAGACCGTGGCCCTGGTACCTAACCTTC
CTGAAA
ACTTAGATATAAGTTCCTATCCGGCCCCACTGAAATACCTAAACAACGAGACAGATGCCTTTA
ACTCAGT
TCCTTCCTTGCTATGAAACAAATCCCATTCCCATCAGCTCCTGCCCCGTGACAGCTGTCCTTC
CCTTCCC
ATCCTCTCTCTGCAACCCCAGCTCTATGAGATGTTCTCTTCGGTGATGAAACACCTGCCAGG
ACCACAGC
AACAGGCCTTTCAGTTGCTGCAAGGGCTGGAGGACTTCATAGCCAAGAAGGTGGAGCACA
ACCAGCGCAC
GCTGGATCCCAATTCCCCACGGGACTTCATTGACTCCTTTCTCATCCGCATGCAGGAGGTAC
ACCCCAGC
AGCCACTGCGGGGAGATGCAAAGCCAGGCAGAGGGAAATCAGTCTGGGAGTGGGGCAGGC
AGATGACACA
GGCCCATTCAAATTAACCCTCATCATAATAATCCTCACAATTGGCTGGGTGCCGTGGCTAACA
GCCTGTA
ATCCCAGCACTTTGGGAGGCCGAGGCAGGTGGATCACCTGAGGTCAGGAGTTCGAGACCA
GCCTGGCCAA
CATGGTCAAACCCCGTCTCTACTAAAAATCCAAAAATTAGTTGGGCATGGTGGCGCGAAGG
GGGGCAGAG
GTTGCAATGAGCCAAGATCACGGCATTGCACTCCAGTCTGGGTGACAGAATGAGGCCCTGT
GTCAAAAAA
AATTAATTAATTGTTTAAAAAGTAAGTGAGCCTGCATGGTCATGCGCATGTGCAGTTCCAGCT
ACTCAGG
AGGCTGAGGCTGGAGGATTGCTTGAGCTCAGGAGTTGGAGTCCGGCCTGTGCAACTTAGCA
AGACCAAGT
CAGTATAAGAAAAAAAAAAACAAAAAAAAACTGACAGCTAAGTTGATAATTGAAGGACAG
ATGGTCAGCA
AGGTAAAGAAGGTGAGAAGGAAGAGCATTTTGGGCAAAGCCAGCAGCCAGGGCAAGGGC
TGGAACCTAGA
GCGAGTCTGGTAGATCTAGGGTCCCTCTTTCCACCTTTGGTCTGAACCAAAGAGAGGTAGAT
CCAAAGGA
AAAGCCCTAGAAGGGCCCTGAGGGCAAGAGGAGTGAGGTTGGCCTAAAGCCCCCTCTCCC
TGCAGGAGGA
GAAGAACCCCAACACGGAGTTCTACTTGAAAAACCTGGTGATGACCACGTTGAACCTCTTC
ATTGGGGGC
ACCGAGACCGTCAGCACCACCCTGCGCTATGGCTTCTTGCTGCTCATGAAGCACCCAGAGG
TGGAGGGTA
AGGCTGGAGGGGGACGGAAGTGGAGGGCCCCAGACCCTCAAAATTCCCCTTCGACTGGTG
CAATGTCCCC
ACCTGTCCCAGATCCCGGGACCCTGAGACGTGACTTGCTGTCCAGAGACAGGGCAACATTC
AGCTGGTAG
GCATCAGCTGAGTCTCATTAGATATTAAAATATTGAAAATGTCTGCACTGATTGGTCAGTCAC
TTCTGTC
CCAAGCCCACTGAGTGCCCACTGCCCGTTCCACCGGGTCATCCCCTAAGTTCCTCCCTGTGC
CTCCCCTG
TGATTCTGGCACAACCTGGTTAACAGGATCCTACTCCAACAATGCGAATGGCTGATGTCTGT
TCTGTTAT
GAATGCTCTACTTCCGTCTCATAGGCGGAGCCATATCATCCACCCCATTTTGCCTATTCGGACT
ATCATT
TCCTGCTCTGAGACCCCTAGATACCTAAACACATTCCCCCTCCTCCCCCAGCCAAGGTCCAT
GAGGAGAT
TGACAGAGTGATCGGCAAGAACCGGCAGCCCAAGTTTGAGGACCGGGCCAAGATGCCCTA
CATGGAGGCA
GTGATCCACGAGATCCAAAGATTTGGAGACGTGATCCCCATGAGTTTGGCCCGCAGAGTCA
30
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
AAAAGGACA
CCAAGTTTCGGGATTTCTTCCTCCCTAAGGTGCTATCCGCCCCCACCCCCCAGACTACGGGG
ACTTCCAG
CCCCTCTCTGTGTCCCCAGCATCCCACCCACATTAGAAGCTTTCTAGACCCTGTCCCACTCCC
TCAATCA
GTCAAAAAAGACTTCCCCAACCACCACATCCGTTCCACCTTTCCACTTAGACACTCCTGAGT
CCTGCATC
TCTCCAGACTCTTTGTGTCAGGAGAATCAAACACATGTTCCCAAACTTCCTATCTTAAGAAA
CAGAAGCC
CCCTTTCCATTCGGCCTTTTGTCATAGGGACAGAAATCTCAGGTCCCCCAAACTCCTGCCTA
GAAGGACA
TGGACCCCATGTCTCCCAAACTTCCTGTTTCAGAGATGTGAACCTTCTATCCCCCAAAGCTC
CTCCATCA
GAGGACCCCAACTCCTCCATGCCTGCCACTTCCCCTTACCTGGGGCACACTAGTTCCCCCTC
CAGCCCCT
GTGTACTTTCACCAATCCCCCGACCCTCCTCATCACACACAACTTCCTCCTCCCTACCAGGG
CACCGAAG
TGTACCCTATGCTGGGCTCTGTGCTGAGAGACCCCAGTTTCTTCTCCAACCCCCAGGACTTC
AATCCCCA
GCACTTCCTGAATGAGAAGGGGCAGTTTAAGAAGAGTGATGCTTTTGTGCCCTTTTCCATCG
GTAAGAGA
CCACTGTTTGCTGCCAGGCCACGGCTCACACCAGCAGGGGCCTCCCTCACCCTCCTCCCCTC
TCTGCGGT
GTAGCCTGGTATTTCTCCAGCTTGGAAGTTCCTGTTAGAATCTACCCTTGAGCCAGCAGCTGA
TACTTCC
TTAACTACCAAGCACCCAGTACCTGCGCCCAGGTAAAATGAAAGGAAACATCTTTCCCCGTA
GATGTATT
TCTCTAGGGTCACACAGCAGATTCCTCAGATCCCTAAAAAGGAGATGACGGCACAGCAGTC
ATATTTGCA
AGTGTACCTGGCAGGAAAGGACATCTAAACCTCCCATTGCTACACCTGGCATGGATCACCCC
ATCTATGA
TGGATGTGTGACATTATGCCTTTTTCAAAACCCATAGAACTGTATAACACAGAGTAAACCCTA
ATGTAAA
CTATGGACTTTGTTAGTAATAATATATCAATATTGGTTCACCATTGTTACATCTCTTATAGAAAG
AAATT
GAGGCTCAGGGAGGATCAGAGCCTCCTCTGAAACTCTCTCAGGCCATAATATTCCACCCTTC
CTCCCTGG
GAGAGCCGCAGCTGGAGGTCGGTACTGGGGCGAGGCTGCACTGAGAGTGGGCTTCACCTC
CACCCCTCCC
GCCTCTCCTCCTCAGGAAAGCGGAACTGTTTCGGAGAAGGCCTGGCCAGAATGGAGCTCTT
TCTCTTCTT
CACCACCGTCATGCAGAACTTCCGCCTCAAGTCCTCCCAGTCACCTAAGGACATTGACGTGT
CCCCCAAA
CACGTGGGCTTTGCCACGATCCCACGAAACTACACCATGAGCTTCCTGCCCCGCTGAGCGA
GGGCTGTGC
CGGTGCAGGTCTGGTGGGCGGGGCCAGGGAAAGGGCAGGGCCAAGACCGGGCTTGGGAG
AGGGGCGCAGC
TAAGACTGGGGGCAGGATGGCGGAAAGGAAGGGGCGTGGTGGCTAGAGGGAAGAGAAGA
AACAGAAGCGG
CTCAGTTCACCTTGATAAGGTGCTTCCGAGCTGGGATGAGAGGAAGGAAACCCTTACATTAT
GCTATGAA
GAGTAGTAATAATAGCAGCTCTTATTTCCTGAGCACGTACCCCCGTGTCACCTTTGTTCAAAA
ACCATTG
CACGCTCACCTAATTGCCACAAACCTCTGCGAAGGGCGTTCATGCCCATTTTACACGTGACA
AAACTGAG
GCTTAGAAAGTTGTCTCTGATGTCTCACAAAACATAAGTGCCCAGAAAATCTTTGAACACAG
31
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
ATCTGTGC
CCATAGCCTTCTAGACAGATTCTTAAAAAGCACCTATTCCTCACGTAAAACAGCTTAGTATAG
CATCACA
TGGCCTGAACATCCCTGTCCTGGGGAGTTTTCCAGAGACCTGGCGGGTGGCTGTCCTGCCTT
CACTGCAC
ACATGCCCACACTCTCACCTACTCAACATGCTTTGAATACCCGGGTGTAATCTGTGCTTGCTA
CCAGATA
AGGCCACTGTAGCCCATTCAGAGTCAGTCCAGGGACACAACGAGACATGAATGGACATACA
GAGTCAGTC
CATTAACAATTTTTTGCAGAGCAGAAGTTTTTAATTTTAATGACATTCTGTCAATATATCCCTT
AATGAA
GAAGTTGAAGGAAAGAATCACTTACAGAGAATGAGAGAACTCTGGATCAGGACATAGCCAT
ATTCATGTG
TGTGATCATGTTCAGACATGCATGTGAGCATATGACTGCATATTCTCCTCCGTGTATGCATGAA
ACATAT
TCCACTATGGGTTCTGAAGGCTGGGCTCTCCTGATGGATCTGGGGTCTGTTGTAAGACCCAG
CTGAGAGT
TTCACAATCACTGCCCACTCTCAAAGAAGTTAGTGTGTGTCCCCCTTAGAAGCTCCCTTACG
GCTTTCAC
GAAAATTAACTCCAAGTTTATTGTAGACCTAAATGAATAGTGAGTACAAAACTTCTAGAAGA
TAATGTAG
GAGAAAATCTAGATGACCTTAAGTTTGGTGATGGCTTATTAGATACAACACCAAAAGCACAA
TCCTTGAA
AGAAGCAATTGATAAGTTCTGTGTCATTAAAATTAGAAGCTTCTGCTCTGCAAAAGAATTGT
CAAGAGAA
TGACAATACAAGCTACAGACTAGGAGAACATATTTGCAGGGGACATACCTGATAAGGGACTT
ACATTCAA
AATACACAAAGAACTGTTAAAACTCAATAGAAAACAACCCAATTAAAGAATGGGCAAACGA
TCTGAGCAG
ACACCTCACCAAAGAAAATATACACATAGCAAATAAGCATAAGGAAAGATGCTCCATATCATA
TGTCAGT
AGCCATTTCAAATTGAAACAATAATGATGTACCACTACTCACCTATTAGAATGGCTAAAATCC
AAAGCTG
ACAACATCAAATGCTGACAAGGAGGTGGCTCAACAGGAACTGTCATTCATTGATGGTGGGA
ATGCAAAAT
GACACAGCTACTTTGAAAGACAATTTGGCGGTTTCTTGCAAAGCTAAACATATTCTTACCAT
GTGCTACA
GCAATCATGTTCTTCGGTATTAACCCAAATGAGTTGAAAACATATAGCAACACAAAAACCTC
TGCACAGA
TGTTTATAGCAGCTTTATTCATAATTGCCAAATCTTGTAAGCAACCAAGATGTTCTTCAACAA
GTGAATG
GATAAATGAACTGTAATATGTTCATACAATGAAATACGGCAGGGCTTGATGGCTCATACTGTT
AATTATA
GCACTATGGGAGGCCGAGGTGGGCAGATCACTTGAGGTCAGGAATTCGAGACCAGCCTGGC
CAACATGGT
GAAACCCCATCTCTACTAAAAATACAAAAATTAGCCGGGCACGGTGGCATGCGCCTGCAGTT
GCAGCCAC
TTGGGAGGCTGAGGTGGGAGAATTGCCTGAACCCATAAGGCAGAGGTTGCAGCGAGCTGA
GATGGAGCCA
CTGCACTCCAGCCTGGGCGACACAGTGAGATTAGAAGAAGCAATATTGTTAAAATGTTCATA
CTACTCAA
AGCAATCTACAGATTCAATGCAATTCCTATCAAAATACCAATGACATTCTTCACAGAAACAG
AAAAAA
32
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
BIOGRAFI PENULIS
Penulis mempunyai nama lengkap Cindy, dilahirkan di Surabaya,
pada tanggal 13 April 1995, serta merupakan anak ketiga dari enam
bersaudara dari pasangan Tjua Nyit Fui dan Henny Susana. Penulis
menempuh pendidikan TK hingga SMA di Kota Sambas, Kalimantan
Barat, yaitu TK Amkur (1999-2001), SDS Amkur (2001-2007), SMP
Amkur (2007-2010) dan SMA Santo Bonaventura (2010-2013).
Penulis melanjutkan studi di Program Studi S1 Farmasi Universitas
Sanata Dharma Yogyakarta pada tahun 2013. Selama masa kuliah, penulis aktif dalam
kegiatan akademik dan non akademik di dalam maupun di luar kampus, yaitu Dewan
Perwakilan Mahasiswa Fakultas (DPMF) Farmasi sebagai anggota Divisi Advokasi (2014),
Bendahara (2015), dan Ketua (2016); Kepanitiaan Inisiasi Fakultas Tiga Hari Temu Akrab
Farmasi (Titrasi) sebagai anggota Kesekretariatan (2014) dan Koordinator Kesekretariatan
(2015); anggota Patient Counseling Club; anggota Herbal Garden Team; asisten Praktikum
Kimia Dasar (2014), Kimia Organik (2015-2016), Kimia Analisis (2015), Biologi Sel dan
Molekuler (2015-2016); Tim Farmasi Bakti Sosial Pengobatan Gratis Yayasan
Persaudaraan Masyarakat Yogyakarta; peserta Kalbe Pharmaceutical Professional
Program (2016), peserta Good Manufacturing Practice education (GMPed) dan Patient
Counseling Event (PCE) dalam Pekan Ilmiah Mahasiswa Farmasi Indonesia (PIMFI) di
Universitas Padjadjaran Bandung (2015), Juara 3 Pharmaceutical Industry Case Study di
Institut Teknologi Bandung (2016), Semifinalis Nutrifood Leadership Award (2016), 15
Besar Olimpiade Sains Mahasiswa Tingkat Nasional Bidang Kimia (2016), Juara 1 Aksi
Penulisan Ilmiah Nasional (2016), 10 Naskah Terbaik Lomba Karya Tulis Ilmiah Tingkat
Nasional (2016), Peserta Phase Paper of Innovation Challenge, Peringkat II Olimpiade
Nasional MIPA bagi Mahasiswa Perguruan Tinggi (ONMIPA-PT) Swasta Tingkat Wilayah
2016 Bidang Kimia, 50 besar Lomba Essay Nasional (2016), Peserta Olimpiade Farmasi
Indonesia 8 di Universitas Andalas Padang (2016), Peserta Pharmacy Competition (2016);
Peserta Clinical Pharmacy Skill Event dalam kegiatan Kompetisi Farmasi Seluruh
Indonesia di Universitas Airlangga (2016); Peserta Kompetisi Kefarmasian Mahasiswa
Tingkat Nasional Pharmadays di Universitas Gadjah Mada (2015); Peserta Lomba Cerdas
Cermat Farmasi dalam Pharmacy Festival di Universitas Indonesia (2015); dan peserta
Student Exchange Program di Mahasarakham University, Thailand (2017).
33