BAB III METODE PENELITIAN 3.1 Tempat dan Waktu Penelitian

BAB III
METODE PENELITIAN
3.1
Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Manajemen Sumberdaya
Perairan Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan Universitas Padjadjaran
Jatinangor Jawa Barat, penelitian ini dimulai pada bulan Mei 2013 hingga Juli
2013.
3.2
Alat dan Bahan
3.2.1 Alat
Alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain:
1.
Peralatan yang digunakan selama pemeliharan dan pengamatan:
a. Akuarium berukuran (40x25x25) cm³ sebanyak 20 buah, digunakan
untuk pemeliharaan dan pengamatan ikan
b. Perlengkapan aerasi (selang dan batu aerasi), digunakan untuk
mengaerasi air dalam akuarium agar kaya akan kandungan oksigen
c. Heater sebanyak 20 buah untuk menjaga suhu air dalam akuarium
d. Saringan ikan untuk mengambil ikan
2.
Peralatan yang digunakan pada pembuatan pakan:
a. Ember sebanyak 4 buah untuk menampung air dan menampung pelet
komersil yang akan ditambahkan vitamin
b. Alat pembuat pelet untuk mencetak kembali pelet yang sudah
dicampurkan vitamin
c. Karung sebanyak 3 buah sebagai tempat pelet pada saat pengeringan
3.
Peralatan yang digunakan dalam pengambilan bakteri:
a. Jarum ose untuk pengambilan bakteri
b. Bunsen untuk menciptakan keadaan aseptik pada saat pengambilan
bakteri
c. Tabung Falcon untuk menampung bakteri pada larutan NaCl
d. Vortex mixer untuk mencampurkan bakteri pada NaCl fisiologis
e. Cuvet sebanyak 2 buah untuk menampung bakteri yang akan dilihat pada
spectrophotometer
f. Spectrophotometer untuk melihat tingkat kekeruhan bakteri dalam
mengestimasi kepadatan bakteri yang diambil sesuai kebutuhan
4.
Peralatan yang digunakan untuk penginfeksian bakteri:
a. Jarum suntik, digunakan untuk menyuntikan bakteri pada ikan uji
5.
Peralatan yang digunakan untuk pengambilan sel darah putih:
a. Haemacytometer Neubauer Improved, yang terdiri dari pipet Thomma
cover glass dan counting chamber Neubauer Improved digunakan untuk
mengambil dan menghitung sel darah putih
b. Pisau bedah, digunakan untuk melukai ikan uji
c. Mikroskop, digunakan untuk melihat dan mengamati sel darah putih
d. Hand counter, digunakan sebagai alat bantu menghitung sel darah putih
3.2.2 Bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain:
1.
Ikan uji yang digunakan merupakan benih ikan lele dumbo berukuran 3-5 cm
sebanyak 500 ekor yang berasal dari Balai Benih Ikan Ciparay
2.
Pakan yang digunakan merupakan pakan komersil berupa pelet PF 1000
sebanyak 5 kg
3.
Vitamin A (retinol) sebanyak 200 mg dalam bentuk serbuk
4.
Vitamin C (asam askorbat) sebanyak 200 mg dalam bentuk serbuk
5.
Vitamin E (tokoferol) sebanyak 200 mg dalam bentuk minyak
6.
Bakteri yang digunakan adalah bakteri Pseudomonas fluorescens (jenis
bakteri penyebab penyakit Pseudomoniasis) sebanyak satu tabung kultur agar
miring yang didapat dari Laboratorium Mikrobiologi Sekolah Ilmu dan
Teknologi Hayati Institut Teknologi Bandung
7.
NaCl fisiologis sebanyak 500 ml untuk suspensi bakteri
8.
Larutan Turk sebanyak 200 ml untuk mengencerkan sel darah putih
3.3
Metode Penelitian
Metode yang digunakan dalam penelitian ini adalah metode eksperimental
menggunakan model RAL (Rancangan Acak Lengkap) dengan 4 perlakuan dan
4 ulangan, yakni:
Perlakuan A : Pemberian vitamin A dengan dosis 50 mg/kg pakan
Perlakuan B : Pemberian vitamin C dengan dosis 50 mg/kg pakan
Perlakuan C : Pemberian vitamin E dengan dosis 50 mg/kg pakan
Perlakuan D : Pemberian kombinasi vitamin A, C dan E dengan dosis 50 mg/kg
pakan (dosis masing-masing vitamin sebanyak 16.7 mg)
Model umum rancangan acak lengkap yang digunakan adalah sebagai
berikut :
Y =μ+τ +ε
Keterangan :
Y
: Hasil pengamatan pada perlakuan ke-i dan ulangan ke-j
μ
: Nilai rata-rata umum
τ
: Pengaruh perlakuan ke-i
ε
: Pengaruh faktor random perlakuan ke-i dan ulangan ke-j
3.4
Prosedur Penelitian
Penelitian
ini
meliputi
pembuatan
pakan,
pengambilan
bakteri,
penghitungan sel darah putih, serta pemeliharaan, penginfeksian dan pengamatan,
yang dijelaskan sebagai berikut:
1. Pembuatan Pakan
Pembuatan pakan (Lampiran 1) dilakukan sebelum penelitian dimulai yang
dijelaskan sebagai berikut:

Pakan komersil berupa pelet sebanyak 4 kg yang dibagi masing-masing
1 kg lalu dibasahi dengan air agar sedikit lunak

Dimasukkan vitamin A, C, E dan kombinasi vitamin (vitamin A, C dan
E) ke dalam masing-masing pelet sesuai perlakuan lalu diaduk kemudian
didiamkan selama 15 menit agar vitamin meresap

Masing-masing pelet pada setiap perlakuan dicetak pada mesin pencetak
pelet lalu disimpan di atas karung dan dikeringkan dibawah sinar
matahari hingga benar-benar kering

Pelet yang sudah kering lalu disimpan dalam suhu ruang agar pelet tahan
lama

Pelet siap digunakan dalam penelitian
2. Persiapan Akuarium

Akuarium dicuci bersih lalu dikeringkan kemudian diisi air sebanyak 20
liter dan ditambahkan garam ikan sebanyak 10 g dan dibiarkan selama satu
hari

Ikan uji dimasukkan ke dalam akuarium masing-masing sebanyak 20 ekor
kemudian diaklimatisasi selama tiga minggu, selama aklimatisasi diberi
pakan komersil sebanyak 3% dari bobot tubuh dengan frekwensi tiga kali
sehari, yaitu pada jam 08.00, 12.00 dan 16.00 WIB.

Pada akhir minggu ke tiga, empat ekor ikan uji diambil darahnya, lalu
dihitung sel darah putihnya
3. Pengambilan Sel Darah Putih
Pengambilan sel darah putih (Lampiran 3) pada penelitian ini dilakukan tiga
kali yang prosedurnya dijelaskan sebagai berikut:

Siapkan mikroskop dengan pembesaran 40 kali, lalu letakkan counting
chamber Neubauer improved dibawah mikroskop dan diamati hingga
terlihat kotak-kotak kecil sebagai tempat perhitungan sel darah putih
terlihat

Ikan uji diambil dari akuarium lalu dilukai pangkal ekornya dengan pisau
bedah

Darah yang keluar dihisap dengan menggunakan pipet Thomma sebatas
skala 0,5 lalu dihentikan hisapannya dengan menekan ujung lidah ke
ujung karet penghisap

Tambahkan larutan Turk sampai skala 11

Lepaskan karet penghisap dari pipet dan kedua ujung pipet ditekan
dengan ibu jari agar cairan tidak keluar, selajutnya digerakkan dengan
arah memutar selama 3 menit agar merata

Tetesi kamar hitung dengan cairan darah melalui parit haemacytometer,
diamkan beberapa saat kemudian ditutupi dengan cover glass

Dilakukan perhitungan sel darah putih dibawah mikroskop dengan
bantuan hand counter
4. Perhitungan Bakteri
Perhitungan bakteri (Lampiran 2) dilakukan pada saat ikan uji akan diinfeksi
yang dijelaskan sebagai berikut:

Tabung kultur bakteri agar miring didekatkan dengan api pada bunsen
agar pada saat pengambilan bakteri terjadi secara aseptik (menghindari
kontaminan/bakteri lain masuk)

Bakteri dalam tabung agar miring dengan menggunakan jarum ose yang
terlebih dahulu disterilkan dengan dibakar pada bunsen. Bakteri diambil
dengan jarum ose yang digoreskan pada permukaan agar miring dalam
tabung lalu dimasukkan kedalam tabung Falcon yang telah berisi NaCl
fisiologis sebanyak 3 ml

Bakteri dalam tabung Falcon dikocok menggunakan vortex mixer hingga
larut, ditandai dengan larutan yang menjadi keruh

Larutan dimasukkan ke dalam cuvet, kemudian dimasukkan kedalam
spectrophotometer untuk dilihat kekeruhanya sebagai estimasi kepadatan

bakteri dalam larutan sebanyak 10
Bakteri siap diinfeksikan pada ikan uji
5. Pemeliharaan, Penginfeksian dan Pengamatan Ikan Uji

Pada minggu keempat penelitian, ikan uji dipelihara selama satu minggu
dalam akuarium dengan tata letak perlakuan yang dilakukan secara acak
(Lampiran 4) dengan diberi pakan komersil yang telah dicampur dengan
vitamin secara ad libitum dengan frekwensi tiga kali sehari, yaitu pada
jam 08.00, 12.00 dan 16.00 WIB.

Pada akhir minggu keempat, empat ekor ikan uji pada masing-masing
perlakuan dilakukan perhitungan jumlah sel darah putih dengan diambil
darahnya

Pada minggu kelima dilakukan kohabitasi dengan menyuntikan bakteri
Pseudomonas fluorescens pada ikan uji dan juga menebarkan bakteri
dalam air pada masing-masing akuarium sebanyak 0.1 ml (2 x10 cfu)
dan dipelihara selama dua minggu lalu diamati gejala klinis yang timbul

Pada akhir minggu keenam, empat ekor ikan uji pada masing-masing
perlakuan dilakukan perhitungan jumlah sel darah putih dengan diambil
darahnya

Pengamatan kelangsungan hidup dilakukan setelah penginfeksian bakteri
hingga akhir penelitian

Pengukuran kualitas air sebagai data penunjang dilakukan tiga kali
(Lampiran 5) yaitu pada minggu ketiga (awal), minggu keempat
(pemberian
pakan
bervitamin),
dan
minggu
keenam
(setelah penginfeksian)
3.5
Parameter yang Diamati
Parameter yang diamati adalah sebagai berikut:
1. Jumlah Sel Darah Putih
Perhitungan sel darah putih menggunakan rumus Schaperclaus (1992)
sebagai berikut:
N = n x 500
Keterangan:
N
: Jumlah sel darah putih dalam 1 ml darah
n
: Jumlah sel darah putih yang terdapat pada 4 kotak besar yang
terletak pada sudut counting chamber
2. Tingkat Kelangsungan Hidup
Tingkat kelangsungan hidup ikan lele dumbo dihitung menurut Effendi
(2002), yaitu:
SR =
x 100%
Keterangan:
SR
: Kelangsungan hidup ikan (%)
Nt
: Jumlah ikan yang hidup pada akhir percobaan
No
: Jumlah ikan pada awal percobaan
3. Gejala Klinis
Pengamatan gejala klinis dilakukan dengan melihat kerusakan yang timbul
pada permukaan kulit tubuh ikan.
3.6
Analisis Data
Hasil perhitungan sel darah putih dan tingkat kelangsungan hidup diuji
dengan menggunakan uji Duncan pada taraf 5% (Gasperz 1991), sedangkan gejala
klinis dianalisis secara deskriptif.