Laporan Hasil Tahun Pertama Penelitian Hibah

BAB II. STUDI PUSTAKA
Salah satu sifat serangga adalah memiliki ketertarikan terhadap cahaya, dalam
praktek secara tradisional hal ini telah lama diaplikasikan misalnya menggunakan lampu
petromak untuk menangkap laron (serangga), menangkap lalat buah dengan warna kuning,
menangkap lalat dengan warna-warni yang mencolok dan menangkap nyamuk mengunakan
cahaya ultraviolet. Bahkan di Malaysia
dalam beberapa aplikasi yang terbatas juga telah
diterapkan dalam bidang pertanian. Namun belum ada yang meneliti secara komprehensip
mulai dari ukuran intensitas cahaya dan pengaruhnya terhadap perilaku serangga. Kenyataan
ini sangat menantang untuk dapat diteliti secara khusus seberapa besar intensitas cahaya yang
diperlukan untuk dapat menarik perhatian serangga secara optimal, hal ini akan sangat
berpengaruh untuk menentukan sumber energi yang diperlukan guna membangkitkan cahaya
yang dibutuhkan seefektif mungkin.
A. Mengukur Intensitas Cahaya.
Salah satu cara untuk mengamati energi cahaya dapat dilakukan dengan mengukur
pengaruh besaran dan distribusi partikel dalam Flow cytometers.
Flow cytometers pada dasarnya adalah microskop yang dilengkapi dengan komponen
yang berfungsi untuk melalukan individu cell secara sekuensial melalui berkas cahaya (laser)
yang akan dianalisis.
Komponennya antara lain:
1. Sumber cahaya, dan komponen pemfokus cahaya.
2. Fluidics, untuk mengarahkan cells melalui cahaya.
3. Elektronika, untuk mendeteksi cahaya dan mengubahnya ke bentuk sinyal digital.
4. Suatu komputer untuk penyimpanan signals yang akan dianalisis.
A.1. Sumber Cahaya
Sumber cahaya pada suatu flowcytometer adalah laser. Alasan penggunaan laser,
karena kemampuannya untuk difokuskan menjadi berkas cahaya elliptis. Ini terkait dengan
komponen-komponen fluidics terkait. Laser memancarkan cahaya koheren, dan merupakan
Laporan Hasil Tahun Pertama Penelitian Hibah Bersaing UHAMKA _______________1
berkas sangat paralel.
Hal ini memungkinkan dasar pengukuran yang berbasis pada
gangguan berkas (beam disturbance) dapat dilakukan (forward scatter, side scatter). Batasan
prinsip bagi lasers ditentukan oleh panjang gelombang yang dapat menimbulkan eksitasi.
Secara virtual semua cytometers mengikuti standar laser argon, yang memancarkan cahaya
pada 488nm.
Selanjutnya lasers lain dapat digunakan, untuk mendapatkan panjang
gelombang eksitasi lainnya.
Gambar 1. Karakteristik Cahaya.
Cahaya adalah suatu bentuk energi yang terdiri dari sejumlah partikel yang disebut photons,
tetapi memiliki sifat-sifat gelombang. Panjang gelombang cahaya/photon sebanding dengan
energi yang dimilikinya. Bertambah panjang gelombangnya akan bertambah kurang
energinya.
Kesimpulan Sumber Cahaya
Penggunaan laser memungkinkan berkas cahaya difokuskan pada cell yang melalui
cytometer.
Cahaya
koheren
memungkinkan
pengukuran
gangguan
cahaya
(light
disturbance). Penggunaan berkas terfokus yang elliptis dapat menghasilkan hanya cahaya
fluoresensi dari single cell (size dependent) yang dapat diukur setiap saat.
A.2. Fluidics
Fluidics adalah bagian yang paling sensitif pada setiap flow cytometer. Jika terjadi
kesalahan, semuanya akan salah, dan fatal.
Masalahnya termasuk:
Laporan Hasil Tahun Pertama Penelitian Hibah Bersaing UHAMKA _______________2
1. Clogs (celah pada aliran larutan sangat kecil).
2. Gelembung udara (akan menggangu aliran dan yang akan diinterpretasikan sebagai
cell).
3. Leaks (Kurangnya tekanan didalam sistem akan menggangu aliran cellular dan
mempengaruhi hasil).
4. Errors yang paling umum mempengaruhi fluidics adalah:
a) Clumps of cells. Hal ini akan “clog” mesin dan berakibat kesulitan utama dan
“headaches” . Kejadian ini dapat diatasi dengan pre-filtrasi populasi cell tidak
lebih besar dari 50um filter.
b) Konsentrasi cell yang tidak sesuai. Semua larutan memiliki proporsi partikel
debu yang rendah. Jangan percaya suatu flow rate yang lebih rendah dari 15
cells/sec. Tetapi, flow rates lebih besar dari sekitar 4000 cells/sec meningkatkan
risiko pada pengukuran multiple cells secara simultan.
c) Konsentrasi Optimal adalah sekitar 1x106 s/d 1x107 cells/ml
A. 3. Deteksi Sinyal.
Seperti dibahas sebelumnya, deteksi sinyal dilaksanakan dengan menggunakan
kombinasi
photomultiplier
(cathode-ray)
dan
rangkaian
elektronika.
Sinyal
yang
dibangkitkan oleh setiap individu cell pada dasarnya merupakan oscilloscope trace. Dengan
melakukan integrasi sinyal ini, akan dihasilkan suatu nilai numerik bagi fluorescensi maupun
nilai side scatter.
Photodeteksi : Forward Angle Light Scatter (FSC)
Ada dua dari parameter yang paling berharga didapatkan dalam flow cytometry, yang
menentukan bagaimana cahaya dari berkas laser dapat melalui suatu cell secara afektif.
Parameter pertama adalah forward angle light scatter. Anggaplah suatu cell (atau partikel
lainnya) merupakan suatu lensa. Jika cahaya koheren dari laser melaluinya, cahaya akan
menjadi “berbelok” tergantung pada ukuran dan indeks bias dari cell. Besar sudut cahaya di
belokkan atau lengkungan, diukur sebagai Forward Angle Light Scatter (FSC).
Laporan Hasil Tahun Pertama Penelitian Hibah Bersaing UHAMKA _______________3
Forward Scatter
Photo Multiplier Tube
Gambar 2. Bentuk Hamburan Depan
(Forward scatter).
Secara umum FSC berbanding langsung dengan ukuran cell. Tetapi cell yang mati (walaupun
penampakan mikroskopis sebaliknya) terlihat lebih kecil dibanding yang hidup. Cell darah
merah (juga berbeda terhadap sebenarnya) umumnya lebih kecil dari semua cell darah
lainnya. FSC pada umumnya diamati dalam skala linear (untuk PBL).
Photodeteksi : Side Scatter (SSC)
Selain memiliki forward detector, cytometers memiliki detektor lain pada posisi 90
derajat terhadap berkas cahaya. Sesuai namanya, detektor ini mengukur kesanggupan suatu
cell untuk “membelokkan” cahaya ke samping. Pada umumnya peningkatan side scatter
berkorelasi dengan peningkatan granularity (butiran kecil) dari cell (Umpamanya,
granulocytes, plasma cells, dll.). Tetapi Cells dendritic dan tipe cell kompleks lain memiliki
side scatter yang tinggi.
FSC
Detector
Laser Light
SSC
PMT
Gambar 3. Deteksi Samping (side scatter).
Laporan Hasil Tahun Pertama Penelitian Hibah Bersaing UHAMKA _______________4
Deteksi Sinyal : Fluorescence
Gambar 4. Skema Deteksi
Sinyal fluoresensi.
Deteksi Sinyal : PMT
Untuk mendeteksi sinyal, photons harus diubah menjadi besaran listrik (untuk
computer storage). Tegangan listrik yang dibangkitkan sebanding dengan jumlah photons
(jumlah cahaya) yang diemisikan oleh cell/partikel. Hal yang perlu diketahui CATHODERAY/PHOTOMULTIPLIER TUBES digunakan khusus untuk flowcytometer tertentu saja.
Gambar 4. Bentuk Fisik PMT.
Gambar 5. Bentuk Fisik PMT.
Kekuatan sinyal (tegangan listrik) tergantung dari perbedaan voltage antara katoda dan anoda.
Besarnya dapat dimanipulasi oleh user dan harus berada dalam orde yang tepat yang sesuai dengan
set up mesin. Pada umumnya FSC dan SSC dianalisis dengan menggunakan penguatan liner,
sedangkan fluoresensi dianalisis secara logarithmis.
Peningkatan voltage tidak perlu adanya
peningkatan disciminatory power dari FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting), hanya kekuatan
sinyal.
Deteksi Sinyal : Elektronika
Pada saat cell melalui tengah-tengah berkas laser, cahaya yang diemisi akan meningkat ke
puncak tertentu (puncak dari berkas) dan kemudian akan berkurang. Sinyal ini kemudian ditangkap
oleh rangkaian elektronika. Walaupun dimungkinkan untuk menganalisis pola ini (seperti tinggi
Laporan Hasil Tahun Pertama Penelitian Hibah Bersaing UHAMKA _______________5
puncak, yang dapat menginformasikan sesuatu tentang distribusi fluoresensi pada cell) tetapi hal ini
tidak umum dianalisis. Total cahaya/fluoresensi dihitung berdasarkan luas bidang dibawah kurva
(yaitu integrasi fluoresensi). Karena secara normal hanya dibaca nilai integrasi kurva fluoresensi,
perbedaan pola dari fluoresensi akan dapat memberikan pembacaan yang identik.
Gambar 6. Perbedaan Pola Fluoresensi
Deteksi Sinyal : Read out
Sebagai akibat dari sinyal yang diterima PMT, nilai integral dari total fluoresensi bagi
setiap
parameter yang diukur (FSC, SSC, FL1, FL2, FL3, FL4) ditampilkan bersama
histogram frekuensi. Histograms dapat menyimpan sebanyak 256 kanal, atau 1024 kanal
(default).
Jumlah kanal tergantung dari tingkat resolusi yang diperlukan dan kapasitas
memory yang tersedia.
Deteksi Sinyal : Jumlah Kanal
Miskonsepsi yang sering terjadi karena jumlah kanal berbanding langsung dengan
intensitas fluoresensi. Tanpa kalibrasi yang tepat, secara virtual tidak mungkin bekerja
secara “kuantitatif” dalam flow cytometry. Namun bertambah besar jumlah kanal, bertambah
Laporan Hasil Tahun Pertama Penelitian Hibah Bersaing UHAMKA _______________6
besar fluoresensi.
Pada umumnya
data yang terrekam mencapai
4-log 1024 kanal
histogram.
Deteksi Sinyal : Threshold
Untuk setiap parameter dapat ditentukan harga ambangnya.
Yang biasa
menggunakan harga ambang ini adalah pada Forward Scatter. Pada dasarnya, cara ini
adalah memerintahkan komputer untuk “membuang data” dari setiap partikel (umpamanya
debu) yang tidak memenuhi batasan minimum. Sebaliknya semua data dari setiap parameter,
terpilih direkam untuk setiap partikel yang melewati aliran.
A.4. Analisis data : Histograms.
Plot fluoresensi umumnya diamati sebagai kombinasi dari histogram parameter
tunggal. Sebagai tambahan bagi histograms parameter tunggal, histograms gabungan dapat
mencakupi plot dua parameter. Plot yang paling umum digunakan adalah dot-plot.
Kesemuanya merupakan representasi berbentuk gambar data flow cytometry.
Analisis data : Markers and Regions
Statistik yang paling umum dilaporkan dari plot histograms/dot cytometry adalah :
a)
Percent Positive untuk setiap populasi.
b)
Mean channel (intensitas fluoresensi).
c)
Peak channel (intensitas fluoresensi).
CATATAN : Data Flow cytometry bukan Gaussian. Tetapi, normal tstatistics TIDAK relevan.
d)
Jika benar-benar sangat diperlukan dan menarik, perlu dipelajari mengenai
fisika statistik yang agak rumit menyangkut statistik untuk cytometry.
Analisis data : Gating
Diskusi mengenai gating lebih rinci dalam kaitan dengan Software CellQuest. Gating
pada dasarnya merupakan cara untuk memerintahkan komputer agar hanya menampilkan
data dari subset cell, yang ditentukan berdasarkan pada karakteristik fluoresensi. Contoh
Laporan Hasil Tahun Pertama Penelitian Hibah Bersaing UHAMKA _______________7
yang mudah adalah gating berbasiskan pada karakteristik FSC/SSC bagi Peripheral Blood
Cells. Gating untuk keseluruhan nilai dilakukan melalui exclusion of populations cells yang
dipilih untuk menentukan karakteristik sepesifik dari populasi cell yang belum diketahui.
Dengan menggunakan darah secara keseluruhan dengan markers tertentu akan didapatkan
hanya informasi tentang granulocytes, lymphocytes dan lainnya.
488 nm laser
FALS Sensor
Fluorescence
detector
+
Charged Plates
Single cells
sorted
into test tubes
Gambar 7. Contoh Eksperimen Fluoresence
Activated Cell Sorting.
Laporan Hasil Tahun Pertama Penelitian Hibah Bersaing UHAMKA _______________8
B. Serangga Hama
B.1. Bentuk Umum Serangga
Gambar 8. Bentuk umum serangga
B.2.Faktor Fisik yang Mempengaruhi Serangga Hama
Suhu / Temperatur : mempengaruhi aktivitas perilaku serangga, penyebaran geografis, dan
perkembangan fisik .
Gambar 9. Pengaruh suhu terhadap serangga
Kelembaban (RH) : mempengaruhi penguapan cairan tubuh serangga, preferensi tempat
hidup dan persembunyian (terutama iklim mikro)RH Optimum 73-100%.
Cahaya : mempengaruhi aktivitas serangga (diurnal, nokturnal,krepuskular), perilaku
serangga (tertarik gelombang cahaya, menghindar gelombang cahaya).
B.3. Pengendalian Hama
Tujuan pengendalian hama adalah :mengupayakan agar populasi hama tidak
merugikan, dengan cara-cara yang evektif, menguntungkan dan aman terhadap lingkungan.
Pengendalian hama dapat dilakukan dengan cara : karantina (melalui undangundang/peraturan), teknik cocok tanam, varietas resisten (bibit unggul), pengaturan
fisik/mekanik, pengendalian hayati, pengendalian geneti, dan kimiawi. Pengendalian hama
dengan memanfaatkan respon serangga hama terhadap cahaya termasuk dalam pengendalian
hama secara fisik.
Laporan Hasil Tahun Pertama Penelitian Hibah Bersaing UHAMKA _______________9