Identifikasi tomato infectious chlorosis virus dan
advertisement
HASIL DAN PEMBAHASAN Penyakit Klorosis pada Tanaman Tomat di Lapangan Penyakit klorosis ditemukan telah menyerang semua varietas tomat yang dibudidayakan oleh petani di beberapa daerah sentra produksi tomat di Indonesia. Penyakit klorosis pada tanaman tomat di Indonesia pertama kali dilaporkan oleh Hartono & Wijonarko (2007) di daerah Magelang, Jawa Tengah. Penyakit klorosis ini pada awalnya disebut sebagai “penyakit ungu” karena gejala lanjut pada daun menunjukkan warna merah kecokelatan hingga keunguan (Hartono & Wijonarko 2007). Penyakit klorosis ini juga sudah mulai masuk dan menyerang sejumlah sentra pertanaman tomat di Jawa Barat seperti, yaitu di daerah Cipanas, Lembang, dan Garut (Fitriasari 2010; Suastika et al. 2010). Penyakit klorosis ini menyerang dan menimbulkan gejala pada semua varietas yang ditanam, yaitu Shinta, Warani, dan Martha. Berdasarkan pengamatan di lapangan, terlihat bahwa gejala penyakit klorosis berasosiasi dengan adanya populasi kutukebul sebagai vektor penyakit. Gejala yang tampak di lapangan berupa menguningnya jaringan interveinal daun bagian yang lebih bawah. Gejala lebih lanjut menunjukkan perubahan warna dari kekuningan menjadi merah kecoklatan dan daun terlihat agak mengeriting (Gambar 1). A Gambar 1 B C D E Gejala penyakit klorosis pada pertanaman tomat di Cipanas (A), Lembang (B), Garut (C), D = gejala awal dan E = gejala lanjut penyakit klorosis 12 Vektor yang ditemukan di lapangan adalah kutukebul T. vaporariorum dan B. tabaci. Populasi vektor di lapangan pada ketinggian lebih dari 1000 m dpl lebih didominasi oleh T. vaporariorum, sedangkan pada ketinggian kurang dari 1000 m dpl jumlah populasi B. tabaci lebih banyak. Hal ini sesuai dengan hasil penelitian Fitriasari (2010) yang menyatakan bahwa faktor ketinggian tempat mempengaruhi jumlah populasi kutukebul yang berperan sebagai vektor penyakit klorosis. Selain itu, populasi kutukebul dipengaruhi juga oleh kondisi cuaca. Pada musim hujan, rata-rata populasi kutukebul di lapangan mengalami penurunan. Sebaliknya, pada musim kemarau populasi kutukebul di lapangan mengalami kenaikan. Deteksi dengan RT-PCR Sampel pada ketiga daerah survey yang diambil berasal dari varietas Warani, Sintha, dan Martha. Sampel tersebut kemudian dideteksi dengan RT-PCR untuk mendapatkan isolat yang positif mengandung virus TICV dan ToCV. Berdasarkan deteksi RT-PCR terlihat bahwa sampel dari ketiga daerah tersebut positif terserang Crinivirus (Andriani 2011, komunikasi pribadi). Pada penelitian ini, deteksi dengan RT-PCR hanya berhasil mengamplifikasi sample tanaman yang berasal dari daerah Cipanas. Kedua isolat dari varietas Warani dan Sinta positif mengandung virus TICV serta varietas Ratna positif mengandung virus ToCV (Gambar 2). 1 2 3 4 5 6 7 500 bp 417 bp 360 bp Gambar 2 Hasil amplifikasi sampel DNA Crinivirus dari lapangan dengan menggunakan metode RT-PCR. Lajur 1: ToCV varietas Ratna Cipanas (+), Lajur 2: marker DNA 100 bp, Lajur 3: sampel asal Lembang (-), Lajur 4: TICV varietas Sintha Cipanas (+), Lajur 5 dan 6: sampel asal Garut (-), Lajur 7: TICV varietas Warini Cipanas (+) 13 Amplifikasi dengan teknik RT-PCR menggunakan pasangan TICV-CF dan TICV-CR berhasil mendapatkan fragmen virus TICV dengan ukuran sebesar 417 bp. Adapun pasangan ToCV-CF dan ToCV-CR berhasil mendapatkan fragmen virus ToCV dengan ukuran sebesar 360 bp. Besaran fragmen DNA hasil amplifikasi ini sesuai dengan primer yang didesain untuk kedua virus tersebut (Hirota et al. 2009). Fragmen DNA hasil PCR selanjutnya digunakan dalam sikuen nukleotida. Sikuen Nukleotida dan Analisis Filogenetika TICV Analisis perunutan nukleotida dengan ClustalW menunjukkan bahwa gen protein selubung TICV asal Indonesia memiliki homologi dengan TICV yang berasal dari negara lain seperti Amerika, Italia, Jepang, Perancis, dan Spanyol (Gambar 3). AMERIKA INDONESIA ITALIA JEPANG PERANCIS SPANYOL 1:ACCTCAACTGACTTCTACACATTCGTTTTTAAAAATCGGTAGTGACACGAGTAGCATCAA 1:ACCTCAACTGACTTCTACACATTCGTTTTTAAAAATCGGTAGTGACACGAGTAGCATCAA 1:ACCTCAACTGACTTCTACACATTCGTTTTTAAAAATCGGTAGTGACACGAGTAGCATCAA 1:ACCTCAACTGACTTCTACACATTCGTTTTTAAAAATCGGTAGTGACACGAGTAGCATCAA 1:ACCTCAACTGACTTCTACACATTCGTTTTTAAAAATCGGTAGTGACACGAGTAGCATCAA 1:ACCTCAACTGACTTCTACACATTCGTTTTTAAAAATCGGTAGTGACACGAGTAGCATCAA ************************************************************ 60 60 60 60 60 60 AMERIKA INDONESIA ITALIA JEPANG PERANCIS SPANYOL 61:ACCTGTAAAAAATGATGTGTTAATAGAAAAAATAAAAACCTTTGAAGATATCCTGGTCGC 61:ACCTGTAAAAAATGATGTGTTAATAGAAAAAATAAAAACCTTTGAAGATATCCTGGTCGC 61:ACCTGTAAAAAATGATGTGTTAATAGAAAAAATAAAAACCTTTGAAGATATCCTGGTCGC 61:ACCTGTAAAAAATGATGTGTTAATAGAAAAAATAAAAACCTTTGAAGATATCCTGGTCGC 61:ACCTGTAAAAAATGATGTGTTAATAGAAAAAATAAAAACCTTTGAAGATATCCTGGTCGC 61:ACCTGTAAAAAATGATGTGTTAATAGAAAAAATAAAAACCTTTGAAGATATCCTGGTCGC ************************************************************ 120 120 120 120 120 120 AMERIKA INDONESIA ITALIA JEPANG PERANCIS SPANYOL 121:AGATGTTGAAGATCATAAAGACATAGAGGAAGATAGATCAAAATATGAACTACCTGACGT 121:AGCTGTTGAAGATCATAAAGACATAGAGGAAGATAGATCAAAATATGAACTACCTGACGT 121:AGATGTTGAAGATCATAAAGACATAGAGGAAGATAGATCAAAATATGAACTACCTGACGT 121:AGCTGTTGAAGATCATAAAGACATAGAGGAAGATAGATCAAAATATGAACTACCTGACGT 121:AGCTGTTGAAGATCATAAAGACATAGAGGAAGATAGATCAAAATATGAACTACCTGACGT 121:AGCTGTTGAAGATCATAAAGACATAGAGGAAGATAGATCAAAATATGAACTACCTGACGT **.********************************************************* 180 180 180 180 180 180 AMERIKA INDONESIA ITALIA JEPANG PERANCIS SPANYOL 181:AACGTCTGAATTTCAACAGGAAGATAAGATAAAACAAGTGAGGTTGTATGACGTGTTGGA 181:AACGTCTGAATTTCAACAGGAAGATAAGATAAAACAAGTGAGGTTGTATGACGTGTTGGA 181:AACGTCTGAATTTCAACAGGAAGATAAGATAAAACAAGTGAGGTTGTATGACGTGTTGGA 181:AACGTCTGAATTTCAACAGGAAGATAAGATAAAACAAGTGAGGTTGTATGACGTGTTGGA 181:AACGTCTGAATTTCAACAGGAAGATAAGATAAAACAAGTGAGGTTGTATGACGTGTTGGA 181:AACGTCTGAATTTCAACAGGAAGATAAGATAAAACAAGTGAGGTTGTATGACGTGTTGGA ************************************************************ 240 240 240 240 240 240 AMERIKA INDONESIA ITALIA JEPANG PERANCIS SPANYOL 241:TTGTGGTGGCAAATCTTTCTCCACTTTAACCATTAACGCAAAATTTAAGCCTTTCAAATT 241:TTGTGGTGGCAAATCTTTCTCCACTTTAACCATTAACGCAAAATTTAAGCCTTTCAAATT 241:TTGTGGTGGCAAATCTTTCTCCACTTTAACCATTAACGCAAAATTTAAGCCTTTCAAATT 241:TTGTGGTGGCAAATCTTTCTCCACTTTAACCATTAACGCAAAATTTAAGCCTTTCAAATT 241:TTGTGGTGACAAATCTTTCTCCACTTTAACCATTAACGCAAAATTTAAGCCTTTCAAATT 241:TTGTGGTGGCAAATCTTTCTCCACTTTAACCATTAACGCAAAATTTAAGCCTTTCAAATT ********.*************************************************** 300 300 300 300 300 300 14 AMERIKA INDONESIA ITALIA JEPANG PERANCIS SPANYOL 301:TGTAGATATGGTTAACTTATTGCAGTTGTGGTATGGAGACTCAAAATCTAACAATTTAGA 301:TGTAGATATGGTTAACTTATTGCAGTTGTGGTATGGAGACTCAAAATCTAACAATTTAGA 301:TGTAGATATGGTTAACTTATTGCAGTTGTGGTATGGAGACTCAAAATCTAACAATTTAGA 301:TGTAGATATGGTTAACTTATTGCAGTTGTGGTATGGAGACTCAAAATCTAACAATTTAGA 301:TGTAGATATGGTTAACTTATTGCAGTTGTGGTATGGAGACTCAAAATCTAACAATTTAGA 301:TGTAGATATGGTTAACTTATTGCAGTTGTGGTATGGAGACTCAAAATCTAACAATTTAGA ************************************************************ 360 360 360 360 360 360 AMERIKA INDONESIA ITALIA JEPANG PERANCIS SPANYOL 361:GCTGTTGATACGTTATGATGAATCACAACGAGATAGATTGACACTTCAACTATGTAT 361:GCTGTTGATACGTTATGATGAATCACAACGAGATAGATTGACACTTCAACTATGTAT 361:GCTGTTGATACGTTATGATGAATCACAACGAGATAGATTGACACTTCAACTATGTAT 361:GCTGTTGATACGTTATGATGAATCACAACGAGATAGATTGACACTTCAACTATGTAT 361:GCTGTTGATACGTTATGATGAATCACAACGAGATAGATTGACACTTCAACTATGTAT 361:GCTGTTGATACGTTATGATGAATCACAACGAGATAGATTGACACTTCAACTATGTAT ********************************************************* 417 417 417 417 417 417 Gambar 3 Perbandingan hasil sikuen nukleotida sebagian gen coat protein (CP) TICV asal Indonesia, Amerika, Italia, Jepang, Perancis, dan Spanyol menggunakan program ClustalW [tanda * menunjukkan nukleotida yang identik] Hal ini juga terlihat berdasarkan similaritas berdasarkan nilai penyejajaran (alignment score) yang mengindikasikan kesamaan urutan nukleotida antar isolat walaupun tidak semuanya 100% (Tabel 3). Hasil analisis pada Tabel 3 menunjukkan bahwa sikuen gen CPm isolat TICV asal Indonesia sama dengan yang berasal dari Jepang dan Spanyol, tetapi berbeda sedikit atau mempunyai kemiripan 99% dengan isolat asal Amerika, Italia, dan Perancis. Menurut Fauquet et al. (2005) apabila terdapat persamaan sikuen nukleotida dari gen protein selubung antara satu virus dengan virus yang lain dengan nilai lebih dari 90%, maka virus-virus tersebut merupakan spesies virus yang sama. Berdasarkan hasil tersebut maka dapat dikatakan bahwa isolat TICV yang menyerang sejumlah pertanaman tomat di beberapa negara termasuk Indonesia adalah spesies yang sama. Tabel 3 Tingkat kesamaan sikuen nukleotida sebagian gen coat protein (CP) isolat TICV asal Indonesia, Amerika, Italia, Jepang, Perancis, dan Spanyol menggunakan program Bioedit V.7.0.5 No. aksesi Asal isolat - Indonesia Indonesia Amerika Tingkat kesamaan (%) Italia Jepang Perancis Spanyol - FJ815441 Amerika 99 - EU881362 Italia 99 100 - AB085603 Jepang 100 99 99 - DQ355217 Perancis 99 99 99 99 - FJ542305 Spanyol 100 99 99 100 99 - 15 Analisis filogenetika pada kladogram menunjukkan bahwa hubungan kekerabatan keenam isolat tersebut terbagi menjadi dua sub kelompok (Gambar 4). Subkelompok pertama terbagi lagi menjadi dua subsubkelompok, yaitu subsubkelompok I yang terdiri dari isolat asal Jepang, Spanyol, dan Indonesia, sedangkan subsubkelompok II hanya terdiri dari isolat asal Perancis. Subkelompok ke dua terdiri dari isolat asal Amerika dan Italia. Kedekatan hubungan kekerabatan isolat TICV asal Indonesia dengan isolat TICV asal Jepang dengan homologi 100% sesuai dengan hasil penelitian sebelumnya yang dilaporkan oleh Hartono & Wijonarko (2007). Gambar 4 Filogenetika kekerabatan isolat-isolat TICV asal Indonesia, Amerika, Italia, Jepang, Perancis, dan Spanyol berdasarkan sikuen nukleotida sebagian gen coat protein (CP) menggunakan program Genetyx v7 Sikuen Nukleotida dan Analisis Filogenetika ToCV Analisis similaritas berdasarkan nilai penyejajaran (alignment score) menunjukkan bahwa isolat ToCV asal Indonesia memiliki nilai kesamaan lebih dari 90% dengan isolat dari tiga negara lainnya (Tabel 4). Berdasarkan Tabel 4 terlihat bahwa isolat ToCV asal Indonesia sama dengan isolat ToCV asal Amerika dengan nilai kemiripan sebesar 100%. Tabel 4 Tingkat kesamaan sikuen nukleotida sebagian dari gen minor coat protein (CPm) beberapa isolat ToCV menggunakan program Bioedit V.7.0.5 Tingkat kesamaan (%) Jepang Perancis No. aksesi Asal isolat - Indonesia Indonesia - AB513443 Jepang 99 - FM206382 Perancis 98 97 - DQ234675 Amerika 100 99 98 Amerika - 16 Analisis perunutan nukleotida dengan ClustalW menunjukkan bahwa gen protein selubung ToCV asal Indonesia memiliki homologi dengan ToCV yang berasal dari negara lain seperti Jepang, Perancis, dan Amerika (Gambar 5). NDONESIA JEPANG PERANCIS AMERIKA 1:ATATCTACCTTGACTCAGGAAGAGGATAAGATACTGAACTTTGCGCGATATCGGTAGACC 1:ATATCCACCTTGACTCAGGAAGAGGATAAGATACTGAACTTTGCGCGATATCGGTAGACC 1:ATATCTACCTTGACTCAGGAAGAGGATAAGATACTGAACTTTGCGCGATATCGGTAGACC 1:ATATCTACCTTGACTCAGGAAGAGGATAAGATACTGAACTTTGCGCGATATCGGTAGACC *****.****************************************************** 60 60 60 60 INDONESIA JEPANG PERANCIS AMERIKA 61:GACTAAATTTTCGTTTCTCAGTCTATGTGTCAGGCCATTGTAAACCAAGGGACCTCAGTT 61:GACTAAATTTTCGTTTTTCAGTCTATGTGTCAGGCCATTGTAAACCAAGGGACCTCAGTT 61:GACTAAATTTTTGTTTCTCAGTCTATGTGTCAGGCCATTGTAAACCAAGGGACCTCAGTT 61:GACTAAATTTTCGTTTCTCAGTCTATGTGTCAGGCCATTGTAAACCAAGGGACCTCAGTT ***********.****.******************************************* 120 120 120 120 INDONESIA JEPANG PERANCIS AMERIKA 121:AAAGCAGCCGGTAATAACAGTCTTGAAAACTACTTTGAGGTAGATGGTGCGAGATTTAAT 121:AAAGCAGCCGGTAATAACAGTCTTGAAAACTACTTTGAGGTAGATGGTGCGAGATTTAAT 121:AAGGCAGCCGGTAATAGCAGTCTTGAAAATTACTTTGAGGTAGATGGTGCGAGATTTAAT 121:AAAGCAGCCGGTAATAACAGTCTTGAAAACTACTTTGAGGTAGATGGTGCGAGATTTAAT **.*************.************.****************************** 180 180 180 180 INDONESIA JEPANG PERANCIS AMERIKA 181:GGAAAACTCCGGATTTGATAAATGAGGTTAGACCCAAAATGTCCGATGTTCCAAACGCTA 181:GGAAAACTCCGGATTTGATAAATGAGGTTAGACCCAAAATGTCCGATGTTCCAAACGCTA 181:GGAAAACTCCGGATTTGATAAATGAGGTTAGACCCAAAATGTCCGATGTTCCGAACGCTA 181:GGAAAACTCCGGATTTGATAAATGAGGTTAGACCCAAAATGTCCGATGTTCCAAACGCTA ****************************************************.******* 240 240 240 240 INDONESIA JEPANG PERANCIS AMERIKA 241:TACGTGGTACGCCAGAAGTCATGAAAAGATTATTCTTTATCCGGTCTTATTAAGCCTGAT 241:TACGTGGTACGCCAGAAGTCATGAAAAGATTATTCTTTATCCGGTCTTATTAAGCCTGAT 241:TACGTGGTACGCCAGGAGTCATGAAAAGATTATTCTTTATCCGGTCTTATTAAGCCTGAT 241:TACGTGGTACGCCAGAAGTCATGAAAAGATTATTCTTTATCCGGTCTTATTAAGCCTGAT ***************.******************************************** 300 300 300 300 INDONESIA JEPANG PERANCIS AMERIKA 301:TATCATTTACAATTCAAACATGGCGTATTACCAAGCCATGGTACCGGCGATTATATAAAT 301:TATCATTTACAATTCAAACATGGCGTATTACCAAGCCATGGTACCGGCGATTATATAAAT 301:TATCATTTACAATTCAAACATGGCGTACTACCAAGCCATGGTACCGGCGATTATATAAAT 301:TATCATTTACAATTCAAACATGGCGTATTACCAAGCCATGGTACCGGCGATTATATAAAT ***************************.******************************** 360 360 360 360 Gambar 5 Perbandingan hasil sikuen nukleotida sebagian dari gen minor coat protein (CPm) ToCV asal Indonesia, Jepang, Perancis, dan Amerika menggunakan program ClustalW [tanda * menunjukkan nukleotida yang identik] Seperti halnya dengan TICV, analisis filogenetika ToCV pada kladogram menunjukkan bahwa hubungan kekerabatan keempat isolat tersebut terbagi menjadi dua subkelompok (Gambar 6). Subkelompok pertama terbagi lagi menjadi dua subsubkelompok, yaitu subsubkelompok I yang terdiri dari isolat asal Indonesia dan Amerika, sedangkan subsubkelompok II hanya terdiri dari isolat asal Jepang. Subkelompok kedua adalah isolat ToCV asal Perancis. Analisis secara filogenetika (Gambar 6) menunjukkan bahwa kekerabatan isolat ToCV asal Amerika dan Jepang lebih dekat dengan isolat ToCV asal Indonesia dibandingkan dengan ToCV asal Perancis. Berdasarkan hal tersebut 17 dapat diindikasikan bahwa ToCV yang ada di Indonesia mungkin berasal dari Amerika dan Jepang. Hal ini diperkuat pada penggunaan primer spesifik pasangan ToCV-CF dan ToCV-CR yang pada penelitian sebelumnya juga digunakan untuk mendeteksi isolat ToCV asal Jepang (Hirota et al. 2010). Primer spesifik pasangan ToCV-CF dan ToCV-CR tersebut didesain berdasarkan pada kedekatan hubungan kekerabatan dengan isolat asal Amerika (Hirota et al. 2010). Gambar 6 Filogenetika kekerabatan isolat-isolat ToCV asal Indonesia, Jepang, Perancis, dan Amerika berdasarkan sikuen nukleotida sebagian gen minor coat protein (CPm) menggunakan program Genetyx v 7 Berdasarkan primer spesifik yang digunakan, deteksi melalui RT-PCR dan sikuen nukleotida baik pada TICV maupun ToCV hanya mampu mengamplifikasi sebagian panjang genom. Sikuen TICV sebesar 417 bp dan ToCV sebesar 360 bp dari panjang sebenarnya yang berkisar antara 740-780 bp. Deteksi dan identifikasi secara molekuler melalui RT-PCR dan sikuen nukleotida mempunyai beberapa kelebihan. Deteksi secara molekuler dinilai lebih akurat, praktis, dan efisien. Kelemahan dari deteksi dan identifikasi ini adalah membutuhkan peralatan dan biaya yang relatif lebih mahal.
