semi sintesis senyawa 2,4,6-trinitrofenilhidrazon kalanon

Molekul, Vol. 6. No. 2. Nopember, 2011: 66 - 73
SEMI SINTESIS SENYAWA 2,4,6-TRINITROFENILHIDRAZON KALANON
DAN UJI AKTIVITAS TERHADAP SEL LEUKIMIA L1210
Mochammad Chasani1)*, Ponco Iswanto1), Eva Vaulina1), Winkanda Satria Putra1),
M. Hanafi2)
1)
Program Studi Kimia MIPA Fakultas Sains dan Teknik, Universitas Jenderal Soedirman
2)
Kimia LIPI, PUSPIPTEK, Serpong
email: [email protected]
ABSTRAK
Kalanon adalah senyawa antikanker yang diisolasi dari Calophyllum biflorum
Hends dan Ws. Aktivitas kalanon terhadap sel leukemia L1210 masih rendah yakni dengan
niali IC50 = 59,4 ug/mL. Suatu senyawa dikatakan aktif sebagai antikanker jjika memiliki
nilai IC50 di bawah 10 ug/mL. Penelitian ini ditujukan untuk mensintesis senyawa turunan
kalanon dan diharapkan diperoleh senyawa baru yang mempunyai aktivitas lebih tinggi
dibandingkan senyawa asal kalanon.
Senyawa turunan kalanon diperoleh melalui reaksi antara kalanon dengan 2,4,6trinitrofenilhidrazin. Reaksi dilakukan pada suhu 78 oC selama delapan jam. Analisis
pendahuluan senyawa hasil sintesis dilakukan dengan metode kromatografi lapis tipis
(KLT) menggunakan eluen n-heksana dan etil asetat (2:1, v/v). Pemurnian senyawa hasil
sintesis menggunakan teknik rekristalisasi dengan pelarut n-heksana dan diklorometan
(3:1, v/v). Senyawa hasil sintesis diperoleh dengan Rf = 0,6609 dan rendemen 5,125 %
( b/b) serta berupa kristal berwarna coklat.
Identifikasi senyawa hasil sintesis dilakukan dengan spektrometer massa dan
spektrofotometer IR. Hasil identifikasi menunjukkan bahwa senyawa hasil sintesis yang
diharapkan telah terbentuk. Data spektrometer massa diperoleh ion molekul M+ = 647
dengan lepasnya molekul H2. Fragmen-fragmen yang terbentuk adalah pada m/e = 504,
m/e = 479, m/e = 451, m/e = 429, m/e = 405, m/e = 377, m/e = 341, m/e = 316, m/e = 281,
m/e = 253, m/e = 233, m/e = 207, m/e = 177, m/e = 156, m/e = 135, m/e = 96, m/e = 73,
dan m/e = 41. Hasil spektrofotometer IR menunjukkan pita serapan pada 1654.8 cm-1 yang
merupakan daerah regang ikatan rangkap C=N, pita serapan pada 3000 cm-1 – 3400 cm-1
adalah pita getaran OH fenol dan pita pada 1380 cm-1 menunjukkan rentangan simetri
gugus nitro (NO2). Hasil uji sitotoksik terhadap sel leukemia L1210 menghasilkan nilai
IC50 sebesr 47.69 μg/ml.
Kata kunci: Kalanon, sel leukemia L1210, 2,4,6-trinitrofenilhidrazin kalanon
SEMISYNTESIZED OF 2,4,6-TRINITROPHENILHIDRAZONE CALANONE AND
ACTIVITY TEST TOWARDS LEUKEMIA CELL L1210
ABSTRACT
Calanone is kind of anticancer compound that was isolated from
Calophyllum biflorum Hends dan Ws. The biological activity of calanone towards
leukemia cell L1210 is relatively low, it is by IC50 value at 59.4 μg/ml. A compound have a
66
Semi sintesis senyawa 2,4,6-trinitrofenilhidrazon... (Mochammad Chasani, dkk)
high biological activity if it’s value of under 10 μg/ml. The aim of the research to
synthesize the derivative calanone compound and hoped that there would be obtained such
a new compound that has a higher activity than calanone.
Derivate calanone compound is got through with react calanone and 2,4,6trinitrophenilhidrazine. The reaction was conducted at 78 ºC for 8 hours. Initial analysis
for the compound that sintesized product is done within layer cromatrography (TLC) using
n-heksan and etil acetate 2:1 (v/v) eluent. Recrystalization was used to pure the compound
that synthesized product with n-heksan and methilen chloride 3:1 (v/v) solvent. The
product synthesized give Rf= 0.609 and rendement 5.125 % (b/b), forming brown crystal.
Identify of compound product was done by mass spectrophotometer and IR
spectrophotometer. The result mass spectrophotometer showed that the compound that
synthesized is 2,4,6-trinitrophenilhidrazone calanone. Mass spectra give molecular ion M+
647, after loss H2 as molecule. The fragments done as: m/e = 504, m/e = 479, m/e = 451,
m/e = 429, m/e = 405, m/e = 377, m/e = 341, m/e = 316, m/e = 281, m/e = 253, m/e = 233,
m/e = 207, m/e = 177, m/e = 156, m/e = 135, m/e = 96, m/e = 73, and m/e = 41.
Spectrophotometer IR vibration show spectra at: vibration at 1654.8 cm-1 as split double
bonding range, 3000 cm-1 – 3400 cm-1 as vibration OH fenol that have hydrogen bonding
and at 1380 cm-1 as stretching form nitro symetry (NO2). Cytotoxic test to leukemia cell
L1210 yield the value IC50 equal to 47.69 μg/ml.
Key words: Calanone, leukemia cell L1210, 2,4,6-trinitrophenilhidrazone calanone
PENDAHULUAN
Kanker
merupakan penyakit
pembunuh nomor satu di dunia setelah
kardiovaskuler dan penyakit infeksi
seperti tuberkolosa dan malaria. Tahun
2002 terdiagnosa lebih dari 10 juta kasus
kanker baru di seluruh dunia dan 6 juta
penderita meninggal (Sanofi-afentis,
2006). Kanker disebabkan karena pola
hidup yang kurang sehat seperti
kebiasaan merokok dan mengkonsumsi
lemak dalam jumlah yang berlebih. Saat
ini kanker menjadi penyebab kematian
tertinggi
bagi
umat
manusia.
Kemungkinan
sembuh
pengidap
pernyakit kanker jarang melampaui 20%.
Berbagai usaha menanggulangi
kanker terus berkembang diantaranya
dilakukan pencarian senyawa aktif
sebagai obat anti kanker. Senyawa aktif
anti kanker diisolasi dari hasil alam dan
dimodifikasi menjadi senyawa baru yang
memiliki aktivitas yang lebih tinggi. Saat
ini banyak dikembangkan pencarian
senyawa bioaktif dari tanaman yang
mempunyai khasiat sitotoksik atau
antikanker yang potensial atau selektif.
Lebih dari 400 spesies dalam 315 genus
dan 97 famili mempunyai aktifitas
sebagai
penghambat
kanker
dan
leukemia.
Kalanon
merupakan
derifat
kumarin yang dapat diisolasi dari getah
Callophilum biflorum Hands & Ws.
Potensi anti leukimia kalanon pertama
kali dilaporkan oleh Swee Hock Goh dari
Chemistry
Department,
National
University of Singapore pada tahun 1999
(Hanafi, 2006). Aktifitas kalanon dalam
menghambat pertumbuhan sel kanker
belum diketahui secara pasti, tetapi salah
satu kemungkinannya adalah dengan
menghambat pembentukan fibrin pada
permukaan sel tumor yang bermigrasi
(Wibisono, 1997).
Penelitian Harjono (2005) melalui
perhitungan komputasi menggunakan
teknik analisis PCR dan pendekatan
model persamaan HKSA terbaik berhasil
memprediksikan tiga senyawa turunan
kalanon yang memiliki aktivitas anti
leukemia lebih tinggi dibanding senyawa
67
Molekul, Vol. 6. No. 2. Nopember, 2011: 66 - 73
asal kalanon (IC50 59,4 µg/ ml) (Chasani,
2002). Aktivitas prediksi tiga senyawa
turunan kalanon
tersebut adalah:
Senyawa prediksi 1 (gem-diol kalanon):
57, 811 µg/ ml; senyawa prediksi 2
(2,4-dinitrofenilhidrazon
kalanon):
30,935 µg/ ml dan senyawa prediksi 3
(2,4,6-trinitrofenilhidrazon
kalanon):
18, 964 µg/ ml. Suatu senyawa dikatakan
berpotensi aktif sebagai anti leukemia
bila daya hambatnya terhadap sel
leukemia L1210 dibawah 10 µg/ ml.
Berdasar latar belakang di atas,
maka penelitian ini akan mensintesis
senyawa
2,4,6-trinitrofenilhidrazon
kalanon. Produk semi sintesis yang
diharapkan
adalah
suatu
imina
(2,4,6-trinitrofenilhidrazon
kalanon).
Analisis
pendahuluan
produk
2,4,6-trinitrofenilhidrazon
kalanon
dilakukan dengan metode kromatrografi
lapis tipis, sedangkan pemurniannya
dilakukan dengan kromatrografi kolom
dan rekristalisasi. Identifikasi senyawa
produk
(2,4,6-trinitrofenilhidrazon
kalanon)
dilakukan
dengan
spektrofotometer FT-IR dan spektrometer
massa. Senyawa produk semi sintesis
kemudian diuji aktivitas anti leukemia
terhadap sel leukemia L1210.
METODE PENELITIAN
Alat dan Bahan
Alat-alat yang akan digunakan pada
penelitian adalah timbangan analitik, labu
alas Bulat, corong pisah, erlemeyer,
beaker glass, pipet ukur, pipet tetes, hot
plate,
alat
ukur
melting
point,
Spektrometer massa, spektrometer FT-IR
8201PC, bejana KLT, lampu UV 254 nm
dan 366 nm dan rotari evaporator Buchii.
Bahan-bahan yang digunakan pada
penelitian adalah Kalanon (LIPI Kimia
Puspitek,
Serpong-Banten),
2,4,6-trinitrofenilhidrazin, Etanol, Asam
Asetat Glasial, Heksana, Etil Asetat, HCl
5%,
Natrium
Sulfat
Anhidrat,
68
Diklerometan, Silika Gel G60, Asam
Sulfat pekat, Asam Nitrat pekat,
Amonium Hidroksida, Aseton, Plat KLT
dan Aquades.
Prosedur Penelitian
1. Sintesis 2,4,6-trinitrofenilhidrazon
kalanon
Kalanon (424,1283 mg, 1 mmol)
ditambah
2,4,6-trinitrofenilhidrazin
(328,768 mg, 1,2 mmol) dilarutkan dalam
etanol 20 ml dan ditambahkan asam
asetat glasial 1 ml dimasukkan ke dalam
labu alas bulat, kemudian direflux pada
suhu 78 oC selama 8 jam. Produk hasil
reaksi dianalisis dengan Kromatografi
Lapis Tipis (KLT) dengan fase gerak
n-heksana : etil asetat (2 : 1).
Penampakan noda dilakukan dibawah
lampu UV pada panjang gelombang (λ)
254 nm dan 366 nm. Noda produk hasil
sintesis dibandingkan dengan noda
senyawa asal kalanon.
Selanjutnya
produk
reaksi
diekstrak menggunakan pelarut etilasetat
: n-heksana (3 : 2). Ditambahkan natrium
sulfat anhidrat pada fase etilasetat untuk
menarik air yang masih terdapat pada
fasa etilasetat ini dan kemudian disaring.
Produk
hasil
sintesis
diuapkan
menggunakan rotari evaporator Buchii
pada temperatur di bawah 78 oC agar
etanol teruapkan dari produk sehingga
didapatkan larutan pekat. Larutan pekat
didiamkan sampai terbentuk padatan.
Produk
hasil
sintesis
(padatan)
dimurnikan menggunakan kromatografi
kolom dengan fasa gerak n-heksana : etil
asetat (7 : 2,5), kemudian direkristalisasi
menggunakan kloroform : n-heksana
(2 : 1) dan sedikit metanol. Produk hasil
rekristalisasi selanjutnya ditimbang.
2. Pemurnian senyawa hasil sintesis
a. Kromatografi Kolom
Kromatografi kolom dilakukan
berdasar hasil uji KLT. Campuran reaksi
diuapkan pelarutnya dan dihomogenkan
dengan sedikit silica gel. Kolom diisi
Semi sintesis senyawa 2,4,6-trinitrofenilhidrazon... (Mochammad Chasani, dkk)
dengan silica gel sampai ketinggian 6 cm
dengan dibasahi eluen. Eluen yang
digunakan adalah n-heksan : etil asetat
(7 : 2,5). Kecepatan tetesan diatur hingga
40 tetes/ menit. Setiap fraksi hasil reaksi
ditampung dan dianalisis dengan KLT
untuk
mengetahui
produk
yang
diharapkan.
b.Rekristalisasi
Pemurnian
senyawa
2,4,6trinitrofenilhidrazon kalanon dilakukan
dengan metode rekristalisasi. Kristal yang
diperoleh dilarutkan dalam n-heksana dan
diklorometan (3 : 1, v/v), kemudian
dipanaskan di atas hot plate sampai
semua kristal larut. Larutan kemudian
didekantasi dalam keadaan panas dan
didiamkan pada suhu kamar sampai
terbentuk kristal. Kristal kemudian
dipisahkan
dari
larutannya
dan
dikeringkan dengan cara diuapkan di
udara terbuka (Pasto et al. 1992) yang
selanjutnya
diuji
kemurniannya
menggunakan KLT fasa gerak n-heksana
: etil asetat (2 : 1), dan diuji titik lelehnya.
3. Uji Sitotoksisitas terhadap Sel
Leukimia L1210 (Sumatra, 1998)
Bioasai
dilakukan
dalam
multiwell plate tissue culture. Sel
leukemia L1210 dipipet dan dimasukkan
ke dalam lubang multiwell plate tissue
culture (1ml sel leukemia L1210 /lubang
yang mengandung 20 x 105 sel leukemia
L1210 /ml). Ke dalam sel tersebut
kemudian dimasukkan 10 µl larutan yang
mengandung sampel kristal dalam
metanol dengan variasi dosis 60, 30, 10
dan 5 µg/ml medium. Sebagai
kontrol/blanko digunakan 10 µl metanol
(harus sesuai dengan pelarut sampel). Sel
selanjutnya diinkubasi selama 48 jam
dalam inkubator CO2 pada suhu 37 oC.
Setelah masa inkubasi selesai, jumlah sel
dihitung
di
bawah
mikroskop
menggunakan haemocytometer Fuch
Rosental (0,200mm x 0.0625 mm2).
Persentase
inhibisi
(penghambatan
pertumbuhan) sel oleh
dihitung dengan rumus :
% inhibisi = (1-
sampel
uji

) x 100%
 sel
α = Jumlah sel hidup dalam medium yang
mengandung sampel yang akan diuji
∑ = Jumlah sel hidup dalam kontrol
Aktivitas inhibisi dinyatakan
dengan nilai IC50 yaitu konsentrasi
ekstrak dalam mg/ml medium yang dapat
menghambat perkembangbiakan sel
sebanyak 50 % setelah masa inkubasi 48
jam (Chasani, 2002).
HASIL DAN PEMBAHASAN
Sintesis
senyawa
2,4,6Trinitrofenilhidrazon Kalanon
Senyawa
2,4,6trinitrofenilhidrazon kalanon diperoleh
melalui
reaksi
antara
2,4,6trinitrofenilhidrazin dan kalanon. Gugus
Amina pada 2,4,6-trinitrofenilhidrazin
berperan
sebagai
nukleofil
yang
menyerang gugus karbonil keton dari
kalanon dengan membebaskan sejumlah
molekul air. Pembentukan 2,4,6trinitrofenilhidrazon kalanon dari 2,4,6trinitrofenilhidrazin
dan
kalanon
ditunjukkan pada Gambar 1.
Pemurnian senyawa hasil sintesis
Senyawa
produk
reaksi
dimurnikan dengan metode kromatografi
kolom dan rekristalisasi. Kromatografi
kolom dilakukan berdasarkan hasil KLT
dengan perbandingan eluen n-heksan :
etil asetat (7 : 2,5 ) v/v. Produk didapat
pada fraksi ke-16 sampai fraksi ke-26.
Uji KLT produk hasil pemurnian
menggunakan perbandingan eluen nheksan : etil asetat
(3 : 1) v/v,
menghasilkan satu spot pada Rf = 0,467,
perbandingan eluen n-heksan : etil asetat
(2 : 1) v/v, menghasilkan satu spot pada
Rf = 0,609 dan perbandingan eluen nheksan : etil asetat
(1 : 1) v/v,
menghasilkan satu spot pada Rf = 0,703.
69
Molekul, Vol. 6. No. 2. Nopember, 2011: 66 - 73
Rendemen produk pemurnian metode
kromatografi kolom sebesar 20% (b/b),
dengan total perolehan massa produk
murni sebesar 143 mg.
Rekristalisasi dilakukan dengan
menggunakan
perbandingan
eluen
n-heksana dan diklorometan (3 : 1, v/v).
Hasil rekristalisasi diperoleh senyawa
produk berupa kristal berwarna coklat
tua, dengan perolehan total massa produk
metode rekristalisasi 37,5 mg. Rendemen
pemurnian metode rekristalisasi sebesar
27% (b/b). Rendemen akhir metode
pemurnian total sebesar 5,125 % (b/b)
dari perolehan massa produk pemurnian
sebesar 37,5 mg.
Uji kemurnian senyawa hasil sintesis
Uji titik leleh dilakukan untuk
mengetahui
kemurnian
produk
semisintesis.
Kristal
2,4,6-
trinitrofenilhidrazon
kalanon
yang
dihasilkan diuji titik lelehnya dengan
menggunakan alat
melting point.
Senyawa meleleh pada suhu 245-247 ○C.
Sedangkan titik leleh senyawa asal
kalanon 172 ○C.
Identifikasi struktur dengan FT-IR
Hasil analisis FT-IR senyawa
2,4,6-trinitrofenilhidrazon
kalanon
menunjukan puncak-puncak pergeseran
yang kemudian dibandingkan dengan
puncak-puncak pergeseran senyawa
kalanon. Spektrum IR senyawa 2,4,6trinitrofenilhidrazon kalanon ditampilkan
pada Gambar 2 dan kalanon pada
Gambar 3.
Puncak-puncak
pergeseran
senyawa
2,4,6-trinitrofenilhidrazon
kalanon dan kalanon ditampilkan pada
Tabel 1.
Gambar 1. Reaksi pembentukan 2,4,6-trinitrofenilhidrazon kalanon dari
2,4,6-trinitrofenilhidrazin dan kalanon
70
Semi sintesis senyawa 2,4,6-trinitrofenilhidrazon... (Mochammad Chasani, dkk)
Gambar 2. Spektrum IR senyawa 2,4,6-trinitrofenilhidrazon kalanon
Gambar 3. Spektrum FT-IR senyawa Kalanon (Chasani, 2003)
Tabel 1. Data puncak-puncak pergeseran spektrum IR Senyawa 2,4,6-trinitrofenilhidrazon
kalanon dan senyawa kalanon.
Gugus
Karakteristik
Gugus
Hidroksil
Gugus Amina
Ikatan C-H
Sp3
Ikatan C-H
Sp2
Ikatan C-C
gugus metil
Ikatan C=C
Aromatic
Gugus Nitro
Ikatan C=N
imin
Gugus
Karbonil
Jenis Vibrasi
Vibrasi ulur –OH
Bilangan Gelombang (cm-1)
2,4,6-Trinitro fenilhidrazon
Kalanon
Kalanon
3435 cm-1 3355,9 cm-1
Virasi ulur –N-H
simetrik
Vibrasi rentangan
C-H
Vibrasi rentangan
C-H
Vibrasi rentangan
C-C
Vibrasi rentangan
C=C
-
3500 -3100 cm-1
2979 cm-1
2893 cm-1
3065 cm-1
2974 cm-1
1442 cm-1
1419,5 cm-1
1607 cm-1
1597 cm-
1454,2 cm-1
Vibrasi rentangan
asimetri dan
simetri (-N=O)
Vibrasi tekuk
(-N=O)
Rentangan C=N
-
1380,8 cm-1
-
1654,8 cm-1
Vibrasi ulur –
C=O ester
Vibrasi gugus
C-O ester
Vibrasi ulur
1738 cm-1
1720,4 cm-1
1270 cm-1
1276,8 cm-1
Keterangan
Serapan
lebar
Serapan
sedang
Serapan
sedang
Serapan
sedang
Serapan
kuat
Serapan
kuat dan
tajam
Serapan
tajam
756,0 cm-1
Serapan
kuat
Serapan
kuat
71
Molekul, Vol. 6. No. 2. Nopember, 2011: 66 - 73
–C=O keton
Gambar 4. Spektrum MS senyawa 2,4,6-trinitrofenilhidrazon kalanon
Gambar 5. Pola fragmentasi dari spektrum massa senyawa 2,4,6-trinitrofenilhidrazon
kalanon
Identifikasi
menggunakan
Spektrometer Massa
Berdasarkan data hasil analisis
spektrometer massa (CG-MS) diperoleh
M+ = 647. Spektrum CG-MS senyawa
2,4,6-trinitrofenilhidrazon
kalanon
ditampilkan pada Gambar 4.
Selain fragmen M+ = 647 muncul
fragmen-fragmen lain yaitu: m/e = 504,
m/e = 479, m/e = 451, m/e = 429, m/e =
72
405, m/e = 377, m/e = 341, m/e = 316,
m/e = 316, m/e = 281, m/e = 253, m/e =
233, m/e = 270, m/e = 177, m/e = 156,
m/e = 135, m/e = 96, m/e = 73, dan m/e =
41. Fragmen-fragmen ini diperkirakan
mengikuti pola fragmentasi seperti
ditunjukkan pada Gambar 5.
Uji sitotoksik terhadap sel leukimia
L1210
Semi sintesis senyawa 2,4,6-trinitrofenilhidrazon... (Mochammad Chasani, dkk)
Hasil uji sitotoksisitas 2,4,6trinitrofenilhidrazon kalanon terhadap sel
leukimia L1210 memberikan harga IC50
sebesar 47,69 µg/mL sedangkan kalanon
memiliki daya hambat (IC50) terhadap sel
leukemia L1210 sebesar 59,4 µg/mL.
Hal ini menunjukkan senyawa hasil
modifikasi memiliki daya hambat
terhadap pertumbuhan sel leukemia
L1210
yang
lebih
besar
bila
dibandingkan dengan senyawa asal
kalanon. Modifikasi yang dilakukan
terhadap senyawa kalanon pada situs
aktif karbonil (posisi C-19) menghasilkan
produk semisintesis senyawa 2,4,6trinitrofenilhidrazon
kalanon
telah
berhasil
meningkatkan aktivitas anti
leukemia terhadap sel leukemia L1210.
KESIMPULAN
Berdasarkan hasil penelitian ini diperoleh
kesimpulan sebagai berikut :
1. Senyawa 2,4,6-trinitrofenilhidrazon
kalanon dapat disintesis dari
senyawa kalanon dan 2,4,6trinitrofenilhidrazin.
2. Produk hasil sintesis senyawa
2,4,6-trinitrofenilhidrazon kalanon
menghasilkan rendemen sebesar
5,125 % (b/b).
3. Senyawa 2,4,6-trinitrofenilhidrazon
kalanon memiliki daya hambat
terhadap sel Leukimia L1210
sebesar 47,69 µg/mL.
DAFTAR PUSTAKA
Chasani, M., 2002, Sintesis Senyawa
Benzoilfenilalanin Ester Kalanon
dan Uji Aktivitasnya Terhadap
Larva Udang A. Salina, Leach,
Tesis, Universitas Indonesia,
Jakarta.
Harjono, 2005, Kajian Hubungan
Kuantitatif Struktur- Aktivitas
Antikanker Senyawa Turunan
Kalanon dengan Pendekatan PGR
(Principal
Componen
Regression), Sripsi, Program
Sarjana
MIPA
Universias
Jenderal Soedirman, Purwokerto.
Kompas, 2004, Jakarta terancam Kanker
Darah,
www.kompas.com
/kesehatan/news/0406/07/082726.
htm, Diakses tanggal 1 april 2007.
Made, S., 1998, Bioasai In Vitro dengan
sel Leukemia L1210, Sebuah
Metode Skrining Zat Antitumor
dari Bahan Alam, Prosiding
Seminar Bioteknologi Kelautan
Indonesia, Jakarta.
Siswono, 2004, Leukemia Peringkat
Pertama Penyakit Kanker Pada
Anak,
www.en.wikipedia
/leukemia/leukemia%20peringkat
%20pertama.htm, Diakses tanggal
1 April 2007.
Sukardiman, 2007, Efek Anti Kanker
Isolat Flavonoid dari Herba
Benalu Mangga (Dendrophtoe
petandra).
www.kalbefarma.com., Diakses
tanggal 4 Mei 2007.
Sumatra, M., 1998, Bioasai In Vitro
dengan Sel Leukemia L1210,
Sebuah Metode Skrining Zat
Antitumor dari Bahan Alam,
Proseding Seminar Bioteknologi
Kelautan Indonesia, Jakarta.
Wibisono, L.K., 1997, Penentuan struktur
Molekul Derivat kumarin dari
Kulit Batang C. biflorum Hends
dan
Pengaruhnya
Terhadap
Pertumbuhan In Vivo Tumor
kelenjas Susu Mencit C3H, Tesis,
Magister Sains Ilmu Kimia
Universitas Indonesia, Jakarta.
Yuliati,
2007,
Diagnosis
dan
Penatalaksanaan
Leukemia
Nonlimfoblastik Akut Pada Anak,
www.society.com,
Diakses
tanggal 1 April 2007.
73