keragaman bakteri tanah mineral pada perkebunan kelapa sawit

KERAGAMAN BAKTERI TANAH MINERAL PADA PERKEBUNAN
KELAPA SAWIT MENGGUNAKAN TEKNIK TERMINAL TERMINAL
RESTRICTION FRAGMENT LENGTH POLYMORPHISM (TRFLP)
(Bacterial Diversity in Oil Palm Plantation Mineral Soil by using Terminal
Restriction Fragment Length Polymophism (TRFLP)).
Irman Januar1, Oom Komala2, Elizabeth C Situmorang3
1.2
Program Studi Biologi FMIPA Universitas Pakuan
ABSTRAK
Tanah mineral merupakan tanah yang banyak digunakan sebagai lahan
pertanian dan perkebunan kelapa sawit. Namun, komunitas bakteri yang ada di
dalam tanah mineral masih banyak yang belum dipahami dan perlu diidentifikasi.
Oleh karena itu, perlu dilakukan identifikasi terhadap komunitas bakteri tanah
mineral tersebut. Tujuan dari penelitian ini adalah menginvestigasi keragaman
komunitas bakteri tanah mineral pada perkebunan kelapa sawit PT. SMART Tbk.
Metode Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism (TRFLP) dengan
enzim restriksi MspI, dan HhaI Metode TRFLP menunjukkan 14,5% komunitas
bakteri dapat dikultur dan 85,5% komunitas bakteri belum dapat dikultur. Selain
itu, metode TRFLP juga dapat menunjukkan genus bakteri dominan dalam tanah.
Genus bakteri dominan tersebut adalah Bacillus, Aeromonas, Deinococcus,
Pseudomonas, Burkholderia, Marinobacter, Flavobacterium, Maribacter,
Tannerella, Exiguobacterium.
Kata kunci: tanah mineral, TRFLP, kelapa sawit, komunitas bakteri, enzim
restriksi
ABSTRACT
Mineral soil is used as agriculture and oil palm plantation. However there
are many kind of bacterial communities in mineral soil which have to be
understood and investigated. The identification is needed toward diversity of
microbial community in mineral soil.The aim in this study is investigated the
diversity of microbial community in mineral soil of oil palm plantation at PT
SMART Tbk. TRFLP method using HhaI and MspI enzymes showed that the
percentage of cultured bacteria was 14.5% and uncultured bacteria was 85.5%.
TRFLP method can also elucidate dominant genera of bacteria in was soil. They
were Bacillus, Aeromonas, Deinococcus, Pseudomonas, Burkholderia,
Marinobacter, Flavobacterium, Maribacter, Tannerella, Exiguobacterium.
Keyword: Mineral Soil, TRFLP, Oil Palm, Bacterial Community,
Restriction Enzime
PENDAHULUAN
Tanah
merupakan
suatu
ekosistem
yang
mengandung
berbagai jenis mikroba dengan
morfologi dan sifat fisiologi yang
berbeda-beda. Jumlah tiap kelompok
mikroba sangat bervariasi, ada yang
hanya terdiri atas beberapa individu,
ada pula yang jumlahnya mencapai
jutaan per gram tanah.
Mikroorganisme dalam tanah
memegang peranan penting dalam
siklus biogeokimia, siklus nutrisi,
penguraian bahan organik dan
pembentukan tanah. Berbagai jenis
mikroba tanah dalam hal ini bakteri
telah diketahui berpotensi sebagai
pupuk hayati, indikator kualitas dan
kesuburan tanah. Bakteri yang
umum dijumpai adalah Rhizobium,
Azobacter,
Azosprilium,
Nitrosomonas, Pseudomonas, dan
Bacillus (Sutanto, 2002).
Bakteri tanah sangat menarik
untuk dipelajari dalam rangka
memahami keragaman dan manfaat
dari bakteri tanah tersebut. eksplorasi
dan telaah pemanfaatan bakteri tanah
perlu ditunjang oleh suatu penuntun
analisis yang memadai agar data
yang dihasilkan dapat diandalkan
dalam
menyusun
teknologi
pengelolaan tanah yang tepat.
Struktur bakteri berdasarkan uji
molekuler dilakukan menggunakan
Polymerase Chain Reaction (PCR)
untuk analisis gen 16S rRNA. Gen
ini adalah gen yang mengkodekan
RNA ribosomal pada sub unit kecil
ribosom dan memiliki urutan khas
dan berbeda pada setiap bakteri
sehingga bisa dijadikan penanda
molekuler untuk proses identifikasi.
Metode TRFLP digunakan pada
penelitian kali ini karena dapat
menganalisa sampel dalam jumlah
besar dengan waktu yang efisien,
database banyak tersedia, serta tidak
dibutuhkan
keahlian
maupun
kemampuan khusus untuk pelaku
operasi alat tersebut (Mulyo, 2009).
TRFLP
memiliki
beberapa
keuntungan dibandingkan metode
sidik jari genetik lain, seperti
memberikan sidik jari ulangan yang
sama (Osbom et al., 2000), resolusi
yang lebih tinggi (Mars, 1999), serta
lebih sensitif.
Tujuan dari penelitian ini adalah
untuk
memperoleh
keragaman
bakteri pada tanah mineral dengan
menggunakan teknik TRFLP.
METODE PENELITIAN
Penelitian
dilaksanakan
di
laboratorium teknologi Mikrobiologi
mikrobioma PT SMART Tbk pada
bulan Maret-Juni 2014.
1. Pengambilan Sampel
Sampel tanah yang digunakan
berasal dari perkebunan PT SMART
Tbk yang terletak di lampung.
Sampel tanah diambil pada bagian
permukaan dengan kedalaman 0-20
cm. Teknik pengambilan sampel
yang digunakan cara acak sesuai
dengan kententuan dari Balittanah
(Husen, 2004). Pengambilan sampel
dilakukan dengan sistem acak,
diambil 9 titik untuk mewakili satu
area.
2. Ekstraksi DNA
DNA bakteri dalam tanah
diekstraksi menggunakan MOBIO
PowerSoil@ Isolation kit mengikuti
langkah-langkah dasar yang ada pada
lembar protokol. Setelah DNA
berhasil diisolasi, DNA diuji
kuantitatif
menggunakan
spektofotometer NanoDrop dan uji
kualitatif
dengan
metode
elektroforesis.
3. Amplifikasi Gen 16S rRNA
Bakteri
Hasil
isolasi
genom
diamplifikasi menggunakan teknik
PCR menggunakan mesin Thermal
Cycler
ESCO.
Bahan
yang
digunakan adalah KAPPA2G™
Robust PCR kit. Komposisi PCR mix
terdiri dari 5X KAPPA2G Buffer B
sebanyak 10 µl, Enhanher sebanyak
10 µl, dNTP Mix 10mM sebanyak 1
µl, DNA Polymerase 0,24 µl, primer
yang digunakan sebagai Forward
adalah 8F berlabel Fluoresent (5’/56FAM/AGAGTTTGATCCTGGCTC
AG-3’) dan Reverse 1510R (5’GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)
masing-masing sebanyak 3 µl,
sampel DNA sebanyak 2 µl dan
ddH2O hingga mencapai 50 µl
kedalam tabung PCR. Hasil mix PCR
diletakan didalam mesin PCR
Thermal Cycler dengan kondisi yang
di atur yaitu pre-denaturation 95°C
selama 5 menit, denaturation 95°C
selama 30 detik, annealing 60°C
selama 15 detik, extention 72°C
selama 1 menit, post extention 72°C
selama 10 menit, dan suhu
penyimpanan 4°C selama waktu
yang tidak ditentukan dengan total
siklus sebanyak 35 siklus.
4. Purifikasi PCR Product
PCR
Product
dipurifikasi
menggunakan MOBIO Powersoil@
DNA Purification Kit . Hasil
purifikasi
diuji
kuantitatif
menggunakan
spektrofotometer
NanoDrop.
5. Pemotongan Gen 16S rRNA
DNA
hasil
purifikasi
selanjutnya direstriksi menggunakan
enzim restriksi HhaI dan MspI.
Dalam campuran reaksi 25µl terdiri
atas 12 µl
purified PCR product, 2,5 µl
Buffer 10x, 0,5 enzim restriksi, dan
ddH2O hingga mencapai volume 25
µl. Untuk enzim HhaI Campuran
diinkubasi pada suhu 37°C selama
120 menit dan suhu dinaikan menjadi
65°C selama 20 menit untuk
menghentikan reaksi, sedangkan
untuk enzim MspI suhu inkubasi
37°C selama 120 menit. Visualisasi
menggunkan gel agarose 1% dengan
perbandingan sampel dan loading
dye 1 : 1 (100V, 50-60 menit).
6. Analisis Data Fragment DNA
Hasil restriksi dikirim ke First
Base Laboratories Malaysia untuk
dilakukan elektroforesis kapiler. Data
yang diperoleh berupa peak dan
ukuran fragmen DNA yang disebut
elektroferogram.
Elektroferogram
dianalisis menggunakan database
MiCA
III
pada
situs
http://mica.ibest.uidaho.edu/, dengan
menggunakan database MiCA III
diperoleh data mengenai keragaman
bakteri.
HASIL DAN PEMBAHASAN
1. Hasil Uji Kuantitatif dan
Kualitatif Isolat Genom
Berdasarkan hasil isolasi genom
bakteri tanah mineral dengan
menggunakan
kit
MOBIO
PowerSoil@ DNA isolation kit,
diperoleh
hasil
DNA
yang
berkualitas baik yang ditunjukan
dengan adanya pita DNA genom.
Hasil elektroforesis menunjukan
fragmen pita DNA yang dihasilkan
berukuran lebih dari 10000 base pair
(Gambar 2) dengan konsentrasi
genom yang berbeda dari 9 isolat,
seperti pada Tabel 1.
Dari hasil pengukuran diperoleh
rata-rata konsentrasi genom 20,4
ng/µl. Menurut Wilkerson et al.
Dalam Mulyani (2011),
bahwa
konsentrasi genom yang baik untuk
PCR berkisar antara 0,5 sampai 6,5
µg/ml.
Gambar 2. Profil Isolat Genom
Menggunakan Elektroforesis Gel Agarose
Tabel 1. Konsentrasi Genom Dari 9
Isolat Tanah Mineral Perkebunan
Kelapa Sawit.
No
Kode
Sampel
Asal
Konsentrasi
(ng/ul)
1
2
3
4
5
6
7
8
9
RataRata
1
2
3
4
5
7
43
45
46
Lampung
Lampung
Lampung
Lampung
Lampung
Lampung
Lampung
Lampung
Lampung
4,6
26,1
13,8
12,2
11,7
8,8
12,2
36,1
57,7
20,4
Dari data Tabel 1 bahwa
konsentrasi isolat genom yang
didapatkan pada penelitian ini sudah
dapat digunakan untuk tahap PCR.
Jika nilai konsentrasi terlalu tinggi
harus dilakukan pengenceran hingga
konsentrasi tertentu agar dapat
digunakan
pada
proses
PCR
(Mulyani et al., 2011).
2. Hasil Amplifikasi Gen 16S
rRNA
Berdasarkan penelitian yang
telah dilakukan gen 16S rRNA dari 9
genom
berhasil
diamplifikasi
menggunakan primer 8F berlabel
fluoresens FAM dan 1510R dengan
ukuran fragmen sebesar 1500-2000
bp (Gambar 3a).
Pada
hasil
elektroforesis
memperlihatkan adanya pita terang
tebal sejajar satu sama lain (Gambar
3a). Munculnya pita tersebut
menunjukan bahwa pasangan primer
yang digunakan bersifat spesifik
hanya menempel pada posisi yang
diharapkan. Ketebalan pita DNA
yang beragam dari 9 isolat hal ini
disebabkan oleh konsentrasi DNA
yang dihasilkan pada tiap-tiap
sampel berbeda (Mulyani, 2011).
Munculnya pita DNA ganda
dari 9 isolat (Gambar 3a) pada hasil
uji kualitatif dikarenakan proses PCR
pada tahap annealing suhu terlalu
tinggi sehingga terbentuk pita DNA
yang tidak spesifik (Asy’ari dan
Saifuddin, 2005). Setelah suhu
diturunkan dari 60°C menjadi 56°C
pada tahap annealing didapatkan satu
pita DNA tunggal (Gambar 3b).
Gambar 3a. Amplifikasi Gen 16S rRNA.
3. Hasil Purifikasi
Pengukuran kemurnian DNA
dilakukan
dengan
metode
spektrofotometri
UV-Vis
pada
panjang gelombang 260nm. Dalam
penelitian ini menggunakan alat
spektrofotometri NanoDrop. Hasil
pengukuran rasio A260/280 terhadap
DNA purification Product dari 9
isolat diperoleh kadar kemurnian
yang
beragam
seperti
yang
ditunjukan pada Tabel 2. Menurut
Sambrook et al. Dalam Mulyani
(2011) DNA murni untai ganda
mempunyai nilai rasio A260/A280
sebesar 1,8-2,0.
Gambar 3b. Optimasi PCR Mendapatkan
Satu Pita DNA Tunggal
Tabel 2. Konsentrasi purification
Product Dari 9 Isolat Tanah Mineral
Perkebunan Kelapa Sawit
No.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Kode
Sampel
1
2
3
4
5
7
31
45
46
kemurnian
Konsentrasi (ng/ul)
1,94
1,93
1,78
1,74
1,75
1,89
1,95
1,87
1,83
31,4
68,0
27,0
28,5
31,2
48,3
49,3
68,0
40,8
Dalam penelitian ini diperoleh
beberapa purification product kode
sampel 3,4,5 dengan nilai rasio yang
lebih rendah dari rasio 1,8 hal ini
menunjukan purification product
tersebut masih terdapat kontaminan,
sangat penting untuk menghilangkan
substansi-substansi pengotor seperti
primer, nukleotida, dan garam yang
akan mengganggu pada proses
restriksi.
4.Hasil Restiksi dengan Enzim
HhaI dan MspI
Fragmen DNA yang dipotong
oleh enzim restriksi HhaI dan MspI
dapat ditentukan berapa besar
ukurannya dengan menggunakan
eklektroforesis gel agarose. Hasil
purifikasi tersebut berhasil di
restriksi oleh enzim HhaI (Gambar
4) dan MspI (Gambar 5), sehingga
menunjukan pita DNA yang berbedabeda. Masing-masing enzim restriksi
menunjukan ukuran fragmen yang
beragam. Hasil restriksi dianalisa
lebih
lanjut
menggunakan
elektroforesis kapiler oleh First Base
Laboratory untuk pembacaan yang
lebih spesifik mengenai ukuran dari
sekuen
DNA
yang
telah
diidentifikasi. Kedua enzim restriksi
tersebut
(HhaI
dan
MspI)
menghasilkan fragmen-fragmen 16S
rRNA untuk membedakan beberapa
kelompok strain bakteri.
Gambar 4. Pita DNA Hasil Pemotongan
Enzim Restriksi HhaI
Analisis Data
Data DNA yang dihasilkan
elektroforesis kapiler berupa peak
yang disebut elektroferogram. Data
sampel yang didapatkan berupa
Terminal
Restriction
Fragment
(TRF) dalam satuan base pair (bp)
dan tinggi/luas area puncak untuk
masing-masing
TRF
dalam
elektroferogram.
Gambar 5. Hasil Pemotongan Enzim MspI
Satu
TRF
dalam
elektroferogram dianggap sebagai
satu filotipe, sementara luas area
dibawah
puncak
menunjukan
kelimpahan relatif dari TRF tersebut
(Pangastuti 2008). Setiap data TRF
dapat
diidentifikasi
dengan
mencocokan ukuran TRF dengan
database. Database yang digunakan
adalah MiCA III.
Hasil dari analisis keragaman
bakteri dengan metode TRFLP
menggunakan enzim HhaI dan MspI
menunjukan
keragaman
yang
berbeda (Gambar 4 dan 5). Untuk
enzim restriksi HhaI menunjukan
presentase 12,47% untuk bakteri
yang dapat dikulturkan dan 87,39%
untuk bakteri yang tidak dapat
dikulturkan, 0,10% untuk yang tidak
dapat teridentifikasi, dan 0,04% yang
tidak diketahui. Sedangkan untuk
enzim MspI presentase yang didapat
untuk bakteri yang dapat dikulturkan
16,43% dan 83,57% untuk bakteri
yang tidak dapat dikulturkan, 0,19%
tidak teridentifikasi, dan 0,02% yang
tidak diketahui (Gambar 6). Hasil
analisa
menggunakan
database
MiCA III menunjukan ada beberapa
genera dominan untuk masingmasing enzim restriksi. Untuk genera
yang dominan menggunakan enzim
restriksi HhaI menurut hasil analisis
dari database MiCA III yaitu
Pseudomonas,
Flavobacterium,
Mycoplasma,
Ochrobactrum,
Sulfitobacter,
Exiguobacterium,
Bacillus,
Helicobacter,
Desulfovibrio,
Microbacterium,
Leuconostoc, Clostridium dengan
kelimpahan yang bervariasi (Gambar
7).
Berdasarkan database MiCA III
Untuk enzim MspI genera bakteri
yang dominan Bacillus Aeromonas,
Deinococcus,
Burkholderia,
Pseudomonas,
Maribacter
Tannerella,
Marinobacter,
Enterobacter, Cardinium, dengan
kelimpahan tertinggi genus Bacillus
(Gambar 8) mencapai 44.8%. Hasil
kombinasi kedua enzim restriksi
tersebut menunjukan bahwa genera
dominan yang terdapat di tanah
mineral yaitu Bacillus, Aeromonas,
Deinococcus,
Pseudomonas,
Burkholderia,
Marinobacter,
Flavobacterium,
Maribacter,
Tannerella, Exiguobacteriu.
Berdasarkan hasil penelitian ini
Metode TRFLP terbukti lebih
efisien, mudah dilaksanakan, dan
dapat
menganalisis
komunitas
bakteri tanah secara langsung dalam
jumlah besar jika dibandingkan
dengan metode pengkulturan. Hal ini
sesuai dengan pernyataan Mulyo
(2009) bahwa metode TRFLP dapat
menganalisis sampel dalam jumlah
besar dengan waktu yang efisien, dan
database banyak tersedia. Data yang
diperoleh dari metode TRFLP
terbukti
lebih
sistematis
dan
terperinci dengan jelas sehingga hasil
data mudah dimengerti. Pada
penelitian ini metode TRFLP
memiliki
kelebihan
jika
dibandingkan
dengan
metode
pengkulturan, karena metode TRFLP
dapat menganalisis bakteri yang
belum dapat dikultur, berbeda
dengan metode pengkulturan yang
%
100.00%
%
87.39%
12.47%
0.00%
terbatas hanya dapat menganalisis
bakteri yang dapat dikultur.
Dari hasil analisis TRFLP lebih
lanjut menggunakan database MiCA
III diperoleh genera bakteri dominan
dari setiap enzim restriksi. Genera
bakteri dominan yang terdeteksi oleh
kedua enzim yang digunakan
memiliki beberapa perbedaan. Hal
ini dikarenakan bahwa setiap enzim
restriksi memiliki situs pemotongan
yang berbeda-beda (Kent et al.
2003).
cultured
83.36%
0.10% 0.04%
uncultured
HhaI
16.43%
unidentified
0.19% 0.02%
Enzim
unknown
MspI
Gambar 6. Distribusi Kelimpahan Bakteri yang Terkultur dan Tidak Terkultur
.
6%
6%
7%
6%
4%
4%
5%
3%
3%
4%
2%
2%
2%
2%
2%
2%
3%
2%
1%
0%
Genera
%
Gambar 7. Kelimpahan Genera Bakteri pada Enzim HhaI
50.0%
40.0%
30.0%
20.0%
10.0%
0.0%
44.8%
12.4% 11.1% 13.0%
9.0%
6.8%
6.5%
5.9%
5.1%
4.6%
Genera
Gambar 8. Kelimpahan Genera Bakteri pada Enzim MspI
KESIMPULAN DAN SARAN
Kesimpulan
Hasil
dari
penelitian ini
menunjukan bahwa metode TRFLP
dapat menyingkapkan keragaman
komunitas bakteri yang beragam.
Persentase rata-rata bakteri yang
dapat dikultur yaitu 14,4% dan yang
tidak dapat dikultur 85,5%. Metode
TRFLP dapat menentukan beberapa
genus
bakteri
yang dominan
berdasarkan
kelimpahan
yang
tertinggi
pada
tanah
mineral
perkebunan kelapa sawit yaitu
Bacillus, Aeromonas, Deinococcus,
Pseudomonas,
Burkholderia,
Marinobacter,
Flavobacterium,
Maribacter,
Tannerella,
Exiguobacterium.
Saran
Perlu digunakan enzim restriksi
lain seperti HinfI, HaeIII dan enzim
restriksi lain untuk mendapatkan
keragaman bakteri yang lebih akurat,
dan perlu dilakukan penelitian lebih
lanjut untuk pemanfaatan bakteri
pada tanah mineral
DAFTAR PUSTAKA
Asy’ari M, Saifuddin N. 2005.
Optimasi Konsentrasi MgCl2
dan Suhu Annealing pada
Proses
Amplifikasi
Multifragmens
mtDNA
Dengan Metoda PCR. JKSA
8(1).
Kent AD, Smith DJ, Benson BJ,
Triplett EW. 2003. Webbased
phylogenetic
assignment tool for analysis
of
terminal
restriction
fragment
length
polymorphism profiles of
microbial communities. J
Microbiol 69:11.
Marsh
TL.
1999.
Terminal
restriction fragment lenght
polymorphism (T-RFLP): an
emerging
method
for
characterizing
diversity
among
homologous
population of amplification
products.
Curr
Opin
Microbiol 2:323-327.
Mulyani Y et al. 2011. Perbandingan
beberapa metode isolasi DNA
untuk deteksi dini koi herpes
virus (KHV) pada ikan mas
(Cyprinus
carpiol).
Universitas Padjajaran Vol
2(1).
Mulyo LA. 2009. Reproduksibilitas
Teknik Terminal Restriction
Fragment
Lenght
Polymorphism
Untuk
Analisis Komunitas Bakteri. J
Microbiol 1:1.
Osborn AM, Moore ERB, Timmis
KN. 2000. An evaluation of
terminal-restriction fragment
lenght polymorphism (TRFLP) analysis for the study
of microbial community
structure
and
dynamics.
Environ Microbiol 2:39-50.
Pangastuti A. 2008. Analisis
Komunitas Bakteri Selama
Tahapan
Perkembangan
Larva
Udang
Putih
(Litopenaeus
Vannamei).
[DISERTASI]. Bogor.
Sekolah Pasca Sarjana Institut
Pertanian Bogor.
Saraswati
R,
Husen
E,
Simanungkalit RDM. 2007.
Metode Analisis Biologi
Tanah. Balai Besar Penelitian
dan Pengembangan Sumber
Daya
Lahan
Pertanian.
Bogor.
Sutanto R. 2002. Penerapan
Pertanian Organik. Kanisius.
Yogyakarta.