Pengklonan Gen-gen yang Diinduksi oleh

HASJL DAN PEMBAHASAN
I. Pemilihan Genotipe dan Penentuan Kadar A1 Untuk Induksi Gen
Agar ekspresi gen hasil induksi menampakkan hasil atau ada perbedaan dengan
yang tidak diiiduksi, maka respon bagian tanaman yang mengalami induksi atau
menarnpakkan gejala cekaman harus mempunyai perbedaan yang cukup jelas.
Penentuan kadar cekaman A1 untuk induksi gen, didasarkan pada perbedaan (reduksi
panjang dan atau bobot kering akar mutlak) antam kontrol deng& perlakuan cekaman
minim1 sebesar 50 persen (Basu et al., 1994; Hoa Le Van et al., 1994: Ryan et al.,
1994:
dan Samuels et al., 1997).
Sedangkan untuk menentukan genotipe yang
mewakili galur toleran dan peka, didasarkan pada konsistensi hasil diantara kedua
peubah (panjang dan bobot kering akar) tersebut terhadap cekaman A1 untuk setiap
galurnya.
Hasil percobaan (Tabel 5, Gambar 7) menunjukkan bahwa: galw-galur toleran
(YBL,Sicinang, Genjah Jepang, Sriyono, Sindon, dan Slamet) memberikan respon yang
berbeda untuk mencapai penurunan minimal 50 persen ( A l y s ~ )panjang dan bobot
kering mutlak akar dari kontrol, yakni mulai dari cekaman 1,60 m M A1 sampai 2,80 m M
Al. Bila dibmdingkan dengan menggunakan kedua peubah tersebut (Lampiran 1 dan 2),
hasil yang konsisten diantara galur toleran ini adalah galur-galur YBL, Sicinang,
Sindoro dan Slamet, sehingga galur-galur ini dapat dipakai untuk tahapan selanjutnya
dengan cekaman A1 yang dipiiih sebesar 2,4 mM Al.
Selain ity pada galur-galur yang dianggap peka (Lurnut dan Arksoy), juga
terdapat variasi respon panjang dan bobot kering akar mutlak terhadap perlakuan Al.
Untuk galur Arksoy, pemberian cekaman A1 sampai 3,2 mM belum menunjukkan
reduksi hasil SO%, sedangkan galur Lumut memberikan penurunan hasil50% terhadap
Tabel 5. Perbandingan rataan panjang dan bobot kering mutlak akar (%) relatif
terhadap kontrol pada beberapa galur kedelai oleh cekaman aluminium
Table 5. Relative ratio between root Iength and mass of root of soybean by A1 stress and control
Ketennean (Notes):
4.0tO.wi media la& 4.0 dan tanpa AI;
4,OIO,&pH4,0olnmdkam' M A S
4,010.4=pH media laMm 4.0dan 0.4 mM Al;
4,OIO,4=pH4,Qofmedi..rd O,4mMM;
4.W.8.pH medialaam 4,0da10,8 nhlN
4,OIO,&pH4,0ofmed/a am'0.8mMAP
4.0+1.*
medialanam 4Pdm 1.2 mM Al;
4,Wl.Z;pnCOofmedianrI1.2MAP
4,O+lb=pH media tanam 4.0 dan 1.6 mM Al:
CWf,&M4,Oolmedmardf,BmMAl;
4,012.4;pH media laarn 4.0 dan 2.4 mM Al;
4.012,4=pH4,0afrmdk d 2 . 4 mM N;
4.012,W msda tanam4.0 dm 2 8 mM Al
4,DI2,8.pH4.0ofmediaardZBMAl
4 . D t 3 , W medmtnam4PMm32 mM Al
4,0+3,2==4,0afmed~~3,2~N
"
"
= Ikra
=k
kedua peubah tersebut terjadi pada cekaman A1 sebesar 0,8 mM.
Ketidakkonsistenan
hasil dari galur Akrsoy ini juga dilaporkan oleh Sopandie et al. (1996) dan ada
kemungkiian disebabkan oleh tidak murninya lagi sumber benih yang digunakan. Dari
hasil tersebut dapat disimpulkan bahwa genotipe dan kadar cekaman A1 terpilih pada
galur toleran (YBL, Sicinang, Sindon, dan Slarnet) untuk penginduksian gen dapat
dilakukan dengan induksi cekaman A1 sebesar 2,4 mM, sedangkan pa& galur peka
(Lumut) dapat dilakukan induksi sebesar 0,8 mM Al. Selanjutnya dipilii Lumut @eka)
dan Yellow Biloxy (toleran) untuk percobaan-percobaan berikutnya.
II. Pengklonan Gen-gen Yang Diinduksi Oleh Aluminium
1. Konstruksi Pustaka cDNA
Gambaran ringkas proses konstruksi cDNA disajikan pada Gambar 8 di bawah
ini. RNA total yang dihasilkan sangat baik. Integtitas mRNA, rRNA, dan tRNA yang
baik dan tidak mengalami degradasi, dicirikan oleh pita rRNA (28s dan 18 s) yang utuh
dan pita mRNA berupa usapan (smear,Gambar 8A). Dari mRNA telah berhasil
Gambar 7. PenampiIan bibit kedelai hasil cekaman aluminium
Figure 7. Performance of soybean's seedling by AI stress
disintesis cDNA pada galur Lumut dan YBL, baik utas pertama maupun utas kedua,
dengan kualitas yang sangat baik dan mempunyai ukuran berkisar antara 500 bp sampai
8000 bp, suatu ukuran cDNA yang sangat baik (Gambar 8B). Untuk selanjutnya, hanya
cDNA yang berasal dari galur Lumut saja yang dijadikan sumber pembuatan pustaka
cDNA, sedangkan cDNA yang berasal dari YBL hanya digunakan sebagai pelacak.
Hasil fiaksinasi menunjukkan bahwa cDNA berukuran cukup besar (Gambar 8C) dan.
dari fiaksi P saja, yang merupakan gabungan dari fiaksi no.5-13, yang berukuran di atas
500 pb selanjutnya digunakan untuk pembuatan pustaka cDNA. Klon yang diambil
secara acak dari pustaka cDNA dan dikeluarkan sisipannya dengan pemotongan
menggunakan enzim NotI-SalI menunjukkan bahwa ukuran sisipan berkisar antara 500
bp sampai 3000 bp (Gambar 8D), suatu ukuran cDNA yang cukup bewariasi dan baik.
Secara kuantitatif hasil isolasi RNA total, pemurnian mRNA dan sintesis cDNA
tercantum pada Tabel 6. Untuk setiap gram ujung akar kedelai dapat dihasilkan 1,88 mg
sampai 2,13 mg RNA total. Sedangkan mRNA yang dapat dimumikan dari populasi
RNA total tersebut berkisar antara 15,68 pg/mg sampai 16.00 pg/mg total RNA (1,57%1,60% dari total RNA). Hasil pernumian ini tergolong baik, karena populasi mRNA
pada suatu organisme berkisar antara 1-2%. Demikian pula, hasil yang baik didapatkan
pada sintesis cDNA yang dibuat dari populasi rnRNA, memberikan hasil 187% sampai
195% dari mRNA (secara teoritis maksimal dihasilkan 200%).
Transformasi cDNA ke dalam Escherichia coli DHlOB menunjukkan hasil yang
baik, yang dicerminkan oleh nilai efisiensi transformasi yang tinggi sebesar 8,25 x 10'
cfdug dan rasio koloni yang mcngandung vektor r e k o m b i i (vektor yang mengandung
sisipan klon) dan yang mengandung vektor nonrekombii (vektor yang tidak
mengandung sisipan klon) tergolong tinggi yaitu sebesar 85: 15. Selanjutnya pustaka
cDNA ini ditapis dari populasi 140.000 koloni (Tabel 7).
TOTAL RNA
mRNA
first strand
synthesis
XtI
1
I
.
second strand 1
synthesis
1
Not1 digestion I
cut
[
Vektor
size fractionation
3
1
Transformation ke E.coli -b
0.1
Gambar 8. Ringkasan konstruksi pustaka cDNA
A =total RNA, B = Utas pertama dan kedua cDNA
dari galur YJ3L dan Lumut, C = Fraksinasi cDNA dan
D = variasi ukurm sisipan klon cDNA
Figure 8. Summmy of cDNA librmy construction
A = RNA t o t 4 B = First andsecondstrand of cDNAfrom
YBL and Lumut lines, C =fractionation of cDNA and
D = variation of insert of the cDNA clone
Tabel 6. Hasil ekstraksi RNA Total, mRNA dan cDNA ujung akar kedelai
Table 6. Ertraction of total RNA. mRNA and cDNAfrom the root tips ofsoybean
9.36 (187%)
15.68 (1.57%)
2.13
1. Lumut
I
I
I
Tabel 7. Hasil transfonnasi pustaka cDNA ujung akar kedelai Lumut
Table 7. Yield of cDNA libraries tramformation of the root tips ofsoybean
8.25 x lo8cfu/ug
15:85
Keterangan (note) : cfu = colonyforming unit
140.000 (120.000putih)
2. Penapisan Pustaka cDNA
Penapisan Diferensial.
Sebanyak 140.000 koloni ditapis secara diferensial.
Penapisan pertama (Gambar 9) mendapatkan 68 kandidat klon untuk selanjutnya ditapis
ulang (Gambar 10). Dari 68 kandidat tersebut 25 klon menunjukkan positif secara
diferensial. Delapan dari 25 klon ini dilanjutkan untuk konfirmasi melalui bibridisasi
dot-blot (hibridisasi DNA-DNA).
Kedelapan klon tersebut dinamai gmalil, gmalr2,
gmalil5, gmali22, gmalil4, gmali20, gmali49, dan gmali50 Cgmali singkatan untuk
Glycine max &luminium induced).
-
L
i
m
a
diantara delapan klon tersebut, yaitu gmalil,
gmalil4, gmala20, gmali49, dan gmali50 dilaporkan dalam disertasi ini. Sedangkan tiga
lainnya masing-masing gmala2, gmalil5, data gmali22 tidak dilaporkan dalam penelitian
ini.
Gambar 10. Penapisan diferensial kedua pustaka cDNA yang dilacak
dengan pelacak cDNA yang mendapat cekaman A1 (A) dan
cDNA kontrol (B). -+ Kandidat klon yang terinduksi A1
Figure 10.
Second d~~erentiol
screening of cDNA libraries by d l N A probejiom
Al stress (A) and control (B). Candidate of cDNA clone ( + )
Penapisan Pustaka eDNA dengan tehnik P C R
Dengan menggunakan tiga
macam primer, yaitu Plf dan PIr, P2f dan P2r, P3f clan P3r, untuk melacak pustaka
cDNA, maka didapatkan beberapa kandidat klon cDNA. Dengan primer PI (Gambar
11) dihasilkan dua pita. Karena pita yang d i i p k a n bendcuran sekitar 650 pb, yaitu
yang sesuai dengan ukuran gen awal primer, maka hanya pita yang diiaksud saja yang
diklonkan Iangsung ke plasmid pGEM-T. Dengan primer P2 (Gambar 12) didapatkan
satu jenis pita dan ukurannya sesuai dengan yang diharapkan, yaitu sekitar 816 pb dan
juga diionkan pada pGEM-T. Demikian pula hasil yang sama dengan menggunakan
primer jenis P3, d i i i l k a n satu pita berukuran sekitar 1100 pb (Gambar 13). Satu
diantara tiga kandidat klon tersebut dilaporkan dalam disertasi ini (klon cDNA dengan
menggunakan primer PI), sedangkan dua klon lainnya w o n cDNA dengan
menggunakan primer P2 dan P3) tidak dianalisis pada penelitian ini.
Gambar 1 1. Hasil amplifikasi
pustaka cDNA dengan primer
P1, menghasilkan dua pita
masing-masing berukuran a =
85Opbdanb=650bp(A).
Reamplifikasi pita berukuran
650 pb (B) dan 850 pb (C).
M = penanda ukauaa DNA
1,2,..6 = contohlsampel.
Figure 11. Amplij?cPtrcPtron
of cDNA
libraries by primer PI result two
band, each a = 850 bp and b = 650
bp (A). Remnplifcation of each band
650 bp (B) and 850 bp (C).
M
=markerDNA
I,2..,6 =sample
Gambar 12. Hasil amplifikasi pustaka cDNA dengan
primer P2, menghasilkan
satu pita berukuran850 pb.
M = penanda ukuran DNA
1,2,..6 = contohlsampel
Figure 12. Ampl~~cation
of
cDNA libraries by primer P2
result one band 850 bp.
M = marker DNA
1.2. ..,6=sample
Gambar 13. Hasil amplifih i pustaka cDNA dengan
primer P3, menghasilkan
satupitabetukuran IlOOpb
M = penanda ukuran DNA.
1,2,..6 = contoWsampe1.
Figure 13. Ampl~j?cationof
cDNA Iibrmies by primer P3
result one bmd 1100 bp
M = marker DNA
1.2. ..,6
-sample
3. Konfirmasi Klon cDNA Sasaran
Konfirmasi klon cDNA dilakukan terhadap kandidat klon yang telah melewati
penapisan tahap kedua. Setelah plasmid diisolasi, kemudian sisipannya (cDNAnya)
dikeluarkan dengan cara dipotong dengan enzim restriksi NotI-Salk dilanjutkan dengan
analisis hibridisasi southern (hibridisasi DNA-DNA) dengan menggunakan pelacak
yang sama dengan sebelumnya, yalcni cDNA yang mendapat cekaman A1 dan cDNA
kontrol. Hasil konfimasi hibridisasi southern ditunjukkan pada Gambar 14.
Gambar 14. Hibridisasi southern kandidat klon cDNA dengan pelacak
cDNA perlakuan (A) dan cDNA kontrol (B). Hibridisasi
diferensial tejadi pada Won no. 14,20,49 dan 50.
Figure 14.
Southern hybridization of the candidace's cDNA clone with cDNA probe
from A1 stress (A) and control (B). Clone no.14.20.49 and 50 shown
dt@ierential hybridization
Dari Garnbar 14 tersebut dapat ditunjukkan bahwa sinyal hibridisasi tejadi pada
sisipan kaodidat klon cDNA nomor 14, 20, 49 dan 50 dengan menggunakan pelacak
cDNA dari tanaman yang terkena cekaman Al, tetapi sinyal itu tidak didapatkan bila
menggunakan pelacak cDNA dari tanaman kontrol. Sehingga dapat dipastikan bahwa
kandidat Won cDNA tersebut (sisipan) benar-benar merupakan hasil induksi dari
cekaman Al. Klon-klon tersebut dinamai dengan gmalil4, gmali20, gmali49, dan
gmali50. Untuk klon nomor 1 (gmalil), hasil konfinnasi menunjukkan bahwa gmalil
rneningkat ekspresnya mulai 8 jam setelah mendapat cekaman 0.8 mM A1 (Gambar 15).
Gambar 15. Induksi gen gamlzl
selama eekarnan
0.8 mM A1 24 jam
Figure IS. Innkction of gmcrlil
gene during 24 hours
aposurc lo A1
Untulc klon yang diisolasi dari pustaka cDNA melalui teknik penapisan pita pada
PCR dengan menggunakan dua macam primer Plf dan Plr, m e n g h a s i i dua pita
(Gambar 16) masing-masing berukuran 850 pb (pita 1) dan 650 pb (pita 2). Karena
klon yang diharapan berukuran 650 pb, sesuai dengan disain primer awal, maka hanya
pita 2 yang diisolasi dan diklonkan di pGEM-T. Klon ini diberi nama sapali (goybean
aminoacyl geptidase aluminium induced), karena dari hasil penelusuran di bank data
Gen Bank mempunyai kesamaan dengan peptidase arninoacyl (sdah satu jenis serine
protease) Arabidopsis thaliana.
Hasil transkrip (Gambar 17) menunjukkan bahwa
sapali ekspresinya diiduksi oleh Al. Hasil ini mengindikasikan adanya peningkatan
aktivitas enzim proteolitik khususnya peptidase aminoacyl oleh cekaman Al.
sapali
Gambar 16. Pola pita gen sapali
hasil PCR (2)
Figure 16.
Bandpanern of sapallgene
by PC" (2)
Gambar 17. Induksi gen sapali
oleh cekaman A1
selama 24 jam
Figure I Z Indudion of sopoUgene
by Al stressfor 24 h
111. Pengurutan cDNA Klon
Pengurutan (secara parsial) cDNA dilakukan terhadap klon-klon gmali dan
sapali. Hasil pengurutan clan penelusuran pada data bank gen secara ringkas tertera
pada Tabel 8.
Tabel 8. Karakteristik klon gen basil isolasi dan identifikasi
Table 8. Characteristics of the clonegenes
KLON
Clone
gmalil
gmalil4
gmal120
gmali49
gmali50
sapali
*)
KARAKTERISTM
GENEBANK/EMBL
Characteristics
GeneBankBMBL
265 pb, 88 aa, tidak ada
kodon awal dan akhir.
771 pb, 137 aa, ATG=57-59
TAGz465-467.
780 pb, 164 aa, ATG=235-237
TGA=727-729.
517 pb, 134 aa, ATG=66-68
TAAz468-470.
731 pb, 197 aa, ATG=65-67
TAA=656-658.
657 pb, 202 aa, ATG = 1-3
TGA = 607-609
= Hsyati - IPB Journal (submitted)
~ ~ ~ a s eton')
- ~ r o
Membran Plasma
Histone H3 **)
Catalase *')
Dehydrogensse NADH*')
Auxin Induced Protein *'I
Peptidsse ~ r n i n o a c ~ l * )
**
)
= Aspac Journal (submitted)
Klon gmalil mempunyai ukuran 265 pb dengan 88 asam amino (Gambar 18),
tidak mempunyai kodon awal maupun akhiir. Hasil ini mengindikasii bahwa klon
gmalil ini merupakan gen yang tidak utuh. Dari peneluswan di bank data GeneBank
menunjukkan bahwa klon gmalil mempunyai kesamaan yang tinggi dengan gen
penyandi ATPase-proton Membran Plasma (mendekati ujung 3', Gambar 19), yang
mempunyai peranan dalam mengatur keseimbangan konsentrasi H'lproton rntara di luar
d m di dalam membran plasma (sel). Hasil ini menunjukkan bahwa cekaman A1 &pat
meningkatkan hiperpolarisasi membran plasma sel (Lino et al, 1998; Macdonald, 1997)
dan berakibat pada : (1) peningkatan kebutuhan energi (dalam bentuk ATP) dan (2)
sebagai tanda sinyal pada "K+-channel" untuk meningkatkan aktivitasnya (Maathuis et
al, 1997); yang pada gilirannya bersama-sama dengan "anion channel" menstimulir
sintesis asam-asarn organik untuk proses adaptasi tanaman terhadap cekaman Al.
1 CAATCCGCTACGTCCTGAGTGGGAAGGCTTGGGATAATCTTTTGGAGAACMGACTGCCT
I R Y V L S G K A W D N L L E N K T A F
60
6 1 TCACTA~GAAAGACTATGGCAAAGAAGAGAGAGAAGCACAGTGGOCAACTGCTCAGA 1 2 0
T
T
K
K
D
Y
G
K
E
E
R
E
A
Q
W
A
T
A
Q
R
1 2 1 GGACTCTTCATGGTCTTCAGCCACCTGAAACAACCAACCTTTTCAATGACAAGAACAGTT 1 8 0
T
L
H
G
L
Q
P
P
E
T
T
N
L
F
N
D
K
N
S
Y
1 8 1 ACAGGGAGCTTTCAGAGATTGCTGAGCAAGCTAAGAGACGTGCCGAGGTTGCAAGGCTCA2 4 0
R
E
L
S
E
I
A
E
Q
A
K
R
R
A
E
'
V
A
R
L
R
2 4 1 GGGAGCTTCATACTCTGAAAGGACA 2 6 5
E
L
H
T
L
K
G
Jenis enzim vang d a ~ a tmemotone :
CviJI
Act1 AIuI
DdeI
Eco571 Mae11
Jenis enzim vanp tidak d a ~ a tmemotonp:
BamHI
Sau3AI
ClaI
Sau96I
Gambar 18.
WoRI
SmaI
Hind111
Xba I
PstI
XhoI
Sal I
Susunan nukleotida dan asam amino klon
gmalil yang rnenyandikan ATPase-proton
Membran Plasma. Susunan asam amino
terletak di bawah susuaan nukleotida.
Susunan nukleotida ini dapat diakeee
di data Bank Gen dengan nomor AF91303.
Figure 1 8 . Nucleotide and amino a c i d sequence o f the gmalil
Clone encoded Plasma Membrane proton-ATPase.
The amino a c i d sequnce i s under t h e n u c l e o t i d e
sequence. This sequence could b e accessed i n
GeneBank database no. AF91303.
Klon gmalil4 mempunyai ukuran sekitar 771 pb dtngan 137 asam amino dan
menyandii protein Histon H3 (posisi kodon awal ATG = 57-59 dan kodon akhir TAG
= 465-467).
Protein Histon H3 ini bersama-sama dengan protein Histon lainnya (HI,
H2A, H2B, H4 dan H5) serta protein nonhiston berperan dalam membentuk
-
Zea mays
:840
I R P V L S Q I U W D N L W ) ~ I ~ ~ L ~ Q E ~ A T T Q P P E 8 L899
K S S Y
G. m u
:
1 8 3 RELSEIA8QAKMA8VARLRELETLKQ 2 6 3
Zea mays
:
9 0 0 R8LSEIA8QMRRAEIARLRELNTLKQ 926
-
Gambar 19. Perbandingan asam amino ATPase-proton Membran Plasma
kedelai terhadap ATPase-proton Membran Plasma tanaman
Lain
Figure 19.
Alignment of amino acld sequence of soybean PIema Membranprofon-ATPase
(PM.4) with other plans PMAs
struktur nukleosomfluomatin saat sel membelah (Lewin, 1985). Fenomena ini &pat
menduga bahwa pada saat tejadi cekaman A1 protein histon H3 ini diinduksi untuk
berperan melindungi DNA dari kerusakan. Susunan nukleotida dan deduksi urutan asam
amino dari klon gmalil4 ditunjukkan pada Gambar 20 dan perbandingan asam amino
penyusun Histone H3 pa& tanaman kedelai dan spesies lainnya ditunjukkan oleh
Garnbar 21. Kesamaan identifikasi ini berkisar antara 94% @a& Arabidopsis thaliana,
nomor akses S06250; Oryza saliva, nomor akses x13678 dan ~13680)sampai 98%
@a& Medicago sativa, nomor akses ~13674,~000937dan AF26803; Tritimm
aestivwn, nomor akses U09459).
Untuk gnraIi20, yang mempunyai nukleotida sepanjang 780 pb dan 164 asam
amino dengan kodon awa1 ATG pa& posisi nuklcotida ke 235-237 dan kodon akhir
TGA=727-729,menunjukkan kesamaan dengan enzim Catalase yang berperan sebagai
,
61 C T C G T A C G A A ~ C A G C ~ G n : C A C C G G A ~ G C T C C M G G M G C A G C T 120
cG
A R T K Q T A R K S T G G K A P R K Q L
121
181
CCACCMGGCAGCAC~Gn:C~GGNWCGGGCGGCG~(SM(3CCCCACCGT
180
T
A T K A A R K S A P G T G G V K K P E R
~GOCCUj00ACAGTGGCn:TOAGGGAGATIY:GOAAGTM:CAGAAGAGWU3~TPC240
F
241
S
P
G
T
V
A
L
R
E
I
R
K
Y
Q
K
S
T
E
L
m m O O M G C m C 1 T K : m O A ~ G m ~ T C U : m G A C ~ O A C 300
C G
L
I
R
K
L
P
F
Q
R
L
V
R
E
I
A
Q
D
F
K
T
361 ~ ~ ~ T A C C M C C n : T G C ~ I T C A T G C T M G A G O G ~ C 42
A 0~ T O C
V G L F E D T W L C A I E A K R V R I M
I T A ~ T O A ~
421 C U L A ~ ~ A ~ ~ G C n : O ~ T G A ' I T A ~ ~ G A O C I T A 480
P K D I Q L A R M I R G E R A *
Gambar 20.
Susunan nukleotida den amam amino klon
60na.2114 yang lnenyandikan Hiatone H3.
Kode aaam amino terletak di bawah suaunan
nuklsotida.
Figure 2 0 . Nucleotide and amino a c i d sequence o f the -1114
clone enooded Histone X3. me amino a c i d sequence
i s under the n u c l e o t i d e seqaence
0.
sativa
:
61
U I ~ P P Q R L V I ( E l l Q D F K T D L R F Q S S A V M L Q ~ A ~ V Q L F E ~ C I I ~120
RVT1
Gambar 21. Perbandingan asam amino Histone H3 kedelai terhadap Histone H3
tanaman lainnya.
Figure 21.
antioksidan
.
Alignment of amino acidsequence of soybean Histone H3 with other plants
Histone H3
Hasil ini dapat menjelaskan bahwa protein gmali20 mempunyai peran
dalam proteksi sel baik terhadap cekaman A1 maupun oksidasi. Susunan nukleotida
hasil pengurutan dan asam aminonya tertera pada Gambar 22. Sedangkan perbandingan
asam amino penyusun Catalase tanaman kedelai dengan Catalase jagung ditunjukkan
pada Gambar 23.
Klon gmali49 berukuran 517 pb yang menyandikan 134 asam amino (kodon
awal ATG-66-68 dan kodon akhir TAA=468-470). Dari penulusuran GeneBank/EMBL
menunjukkan bahwa grnali49 mempunyai kesamaan dengan Dehydrogenase NADH dari
Flexarnia picta (nomor akses U88510). Dehydrogenase NADH merupakan salah satu
enzim yang berperan di dalam transfer elektron dalarn proses oksidasi-reduksi untuk
penyediaan sumber energi yang dibutuhkan dalam metabolisme tanaman khususnya
dalam siklus sitrat dan detoksifikasi cekaman oksidasi bersama-sama dengan beberapa
senyawa antioksidan lainnya seperti Catalase, SOD (Superoxide Dismutase), GST
(Gluthation S-Transferase), Peroxidase dan Phenylalanin Amonia Liase (PAL).
2 4 1 GTTATATGTCTTGGGGGATCCACTAGTTCTAAAGCGGCCCCCACCGCGQTGQAGCTCCAG3 0 0
V
I
C
L
G
G
S
T
S
S
K
A
A
A
T
A
V
E
L
Q
3 0 1 CTTTTGTTCCCTTTAGTGAGGGTTMTTGCGCGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTT360
L
L
F
P
L
V
R
V
N
C
A
L
G
V
I
M
V
I
A
V
4 2 1 GTGTTAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACT 4 8 0
V
L
S
L
G
C
L
M
S
E
L
T
H
I
N
C
V
A
L
T
4 8 1 GCCCGCTTTCCAQTCGGGAWL!CTGTCGTGCCAGCTGCATTMTGAATCGGCClULCDCGC540
A
R
F
P
V
C
K
P
V
V
P
A
A
L
I
N
R
P
T
R
5 4 1 G G G G A G A G G C G G T T T G C G T A T T O O O C G C T C T T C C G C T T C T G A C G C T C 600
G
E
R
R
F
A
Y
W
A
L
B
R
F
L
A
H
D
'
S
L
R
6 0 1 TCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAACGGTATCAGCTCACTCMAGGCGGTMTACGGTTATCC660
S
V
661 A
V
R
L
I
A
R
G
C
T
E
R
R
T
I
~
T
R
G
V
S
A
E
~
K
T
T
H
S
K
F
M
Y
Q
T
A
V
I
K
G
A
T
C
R
L
S
K
T
D
Q
C
G 7 2 0G
7 2 1 U U I C C ( 3 ~ ~ T T Q C T o O C G T T T T T C C A T A G G G C a c C C C C C C C7T8 0~
K
P
*
Jenis enzim vanp daaat memotone:
AciI
AluI
ApoI
DpnI
DraI
MseI
Not1
Sau3AI
EcoRI
H i m
TaqII
Jenis enzim vanp tidak dapat memotonp:
AatII AccI
Mu1
PstI
RIoI
PYUI
Gambar 22.
AhvNI
SaZI
ApaI
SmaI
BgZII
Tag1
ClaI
XbaI
on1
&I
Susunan nukleotida dan amam amino klon
Oma1120 yang menyandikan Catalase.
Kode asam amino terlstak di bawah eueunan
nukleotida.
Figure 2 2 .
N u c l e o t i d e and amino a c i d sequence o f t h e gmali20
c l o n e encoded C a t a l a s e . The amino acid sequence
i s under t h e n u c l e o t i d e sequence.
C
Kedelai
327
Jagung
478
LRAWRNHGHSCFLCEIVIRSQFHTTYEPEA 416
+RAWRNHGH CFLCEIVIRSQFHTTYEPEA
IRAWRNHGHRCFLCEIVIRSQFHTTYEPEA 5 0 7
Gambar 23. Perbandingan asam amino Catalase kedelai terhadap Catalase
tanaman jagung.
Figure 23.
Alignment of amino acid sequence of soyheon's catalase with maize S
catalase
Hasil ini menunjukkan bahwa cekaman A1 menstimulir penyediaan salah satu
surnber energi dalam bentuk ATP melalui peningkatan aktivitas Dehydrogenase NADH
untuk tetap mempertahankan kelancaran proses metabolisme tanaman.
nukleotida clan asam aminonya tercantum pada Gambar 24.
Susunan
Sedangkan perbandiigan
asam amino penyusun Dehydrogenase NADH tanaman kedelai dengan Dehydrogenase
NADH Flexamiapicta ditunjukkan pada Gambar 25
Untuk gmali50, urutan nukleotida dan deduksi asam aminonya tertera pada
Gambar 26. Gen gmali50 mempunyai nukleotida sekitar 73 1 pb dengan "open reading
fiame/ORF" sepanjang 594 pb dengan start pada asam amino methionin (ATG kodon
pada posisi nukleotida 65-67; TAA kodon pada posisi 656-658; dm mengandung 197
asam amino).
Hasil penelusuran menunjukkan bahwa gmali50 ini mempunyai
kesamaan dengan Auxin-Induced Protein GIycine mux (56% pada tingkat DNA dan
64% pada tingkat protein). Perbandingan asam amino penyandi Auxin Induced Protein
dari tanaman kedelai dengan Auxin Induced Protein tanaman lainnya ditunjukkan pa&
Gambar 27. Fenomena ini mengindikasikan adanya peran auksin dalam proses toleransi
terhadap cekaman Al.
Empat dari lima klon tersebut, yalcni ATPase-proton Membran Plasma, Histone
H3, Dehydrogenase NADH dan Auxin-Induced Protein merupakan temuan gen baru
yang ekspresinya diinduksi oleh Al.
6 1 T T T A T ~ A T A A T ~ C T C A R A T A T A T A C A T T A A W G C C T A T T T A T T G A C C T T A1
T2 0
Y I I K K T Q I Y T L K A Y L L T L Y
121 ACGGCCAAACACCCTTACAARTTACTCCTATTCTAAGCTOCAATAAGATAATCCAAAATA 180
G Q T P L Q I T P I L S C N K I I Q N R
181 G M T A T T T T T T T C T A A A T T A C A A A T G A C G A T A A A T T A T T d C 2 4 0
I F F S K L Q M T I N Y C I P K I L N K
241 AGTCATGGAAACTGATAAACAAATTTACATTATGTAGTGAGACGATGTGGAMAATATGT 300
S W K L I N K F T L C S E T M C X N Y Y
3 0 1 ATAAGAAGGAAGGCAACTTCTCCAATTTTTTTTTTTTAATCCCTTCTGTTATTTTCTGTT 360
K K E G N F S N F F P L I P S V I F C L
361 TGTTATTATTATTTTATTYATTTTTTTTCTCTCTTTTMTTTGGGTGmmTTTTW 420
L L L F Y L F F F S L L I W V L N P Q R
421 G G C G A A T G T G C A A A T C C A C T G A W A W i T G C G T T C T D A 4 8 0
R M C K S T E K M R S E L N T *
4 8 1 AAAAAAAAAGGGCGGCCGTCGCGATCTAAAACTAGTC 517
Jenis enzim vang dapat memotong:
AciI
AluI
ApoI
CviRI
DdeI
DpnI
Haen Sau3AI
Ssp1 Tsp509
Jenis enzim vang tidak dapat memotonp:
AIwM ApaI BamHI BglZ
SmaI Tag1 XhoI
Gambar 24.
Figure 2 4 .
ClaI
DraI
MspI
Psi1
SaA Sfir
Susunan nukleotida dan asam amino klon
Gmali49 yang menyandikan Dehydrogenase
NADH. Kode asam amino terletak di bawah
Susunan nukleotida.
Nucleotide and amino a c i d sequence o f t h e gmali49
clone encoded NADH Dehydrogenase. The amino a c i d
sequence i s under the n u c l e o t i d e sequence.
Kedelai: 261 CLSVSMTYLGFLVCNNLSSWI+KKINFOLSYCSLE*E'FVRVFDRIRSINRPLMY
91
CL +S+++L FL C++L
+GL C
+ G IRSI++ + Y
F. p i c t a : 9 5 CLEMSLSFLFFLCCSSLG---------IYGLMICGWSSNSIYSMU;CIRSIS~ISY
142
Gambar 25. Perbandingan asam amino Dehydrogenase NADH kedelai
terhadap Dehydrogenase NADH Flexamiapicta.
Figure 25.
Alignment of amino acidsequence of soy6erm's NADH Dehydrogenme
with Flexamiapicta 's NADH Dehydrogenase
1TACTMTCCGCCAGCT~Wa06TGGTTDaTTWCACa~~TCATAC
60
A~
C2 0
M T C A G
61 O M ~ A T A Q C A G T A ~ ~ ~ G C A A ~ ~ D T A ~ T M T A C T A 1
X
I
A
V
Q
K
V
S
N
E
E
V
A
D
N
T
T
I
S
1 2 1 CACTCTTOCTMTTCT0000CGTPTGTCCAOOTTTCCATCU3ATDOA~CCTTACCIT~
180
T
L
A
N
S
G
A
F
V
Q
V
S
I
D
G
A
P
Y
L
R
1 8 1 C M C a T D O A C C T C C C M T C C P A ~ G ~ A C A T M G A C T T A T C E C X T O C C T T D D2C
40
~
K
V
D
L
P
M
Y
K
S
Y
I
R
L
I
G
C
L
G
Q
N
2 4 1 T G T T C A a C r C ~ C C A ~ T A C C T A T 0 0 0 0 C C C T A ~ ~ T A T A ~3 0
C0A ~ M A
V
Q
L
L
H
H
G
Y
L
W
G
P
R
N
D
I
F
M
N
D
T
D
301 TAGCAAATTGATGGATCTTCCTCCCAGCTCTOAGTATC(T
S
K
L
Y
D
L
P
P
S
S
E
Y
V
P
P
H
Q
N
360
3 6 1 TGGTGACTGGATGCTCGTGGGTGATGTCCCATGGQAGATGTTTGTGGTGGTCATGCAACC4 2 0
G
D
W
X
L
V
G
D
V
P
W
E
M
F
V
V
V
M
Q
P
4 2 1 O C C T ~ ~ T T A T C A A T O O A T C A ~ C D A T T G G T C C T T G C G T C ~ C A R G G4A
80
AA
P
G
E
I
M
N
G
S
E
T
I
G
P
C
V
Q
N
I
G
K
4 8 1 M T O ~ ~ ~ C C h A T A C A l r C G ~ C T A ~ Q A T C C C ( C P5 A
4 0C Q C
X
Q
K
Q
K
G
K
L
A
E
Y
N
V
L
R
E
I
P
Y
A
-
5 4 1 U L ~ C C T A T O O ~ T T A T A T C A C C C A C T T C M E C T A ~ C T A ~ C O O M T 600
QTT
T
G
P
X
E
Q
I
I
S
P
T
S
A
T
L
W
S
G
X
L
-
661 ~ O C ~ M C C T A T A ~ G T G T P E A D D A T G T ~ T C O T C C A 7
~2T0 C C G
7 2 1 GATGGTATTTG 73 1
Jenis enzim vane d a ~ amemotong:
t
AM
AciI
AluI
AheI
Sau3AI Tag11 Tthl 1111 XcmI
Apal
BccI
VePI
CviRI
DdeI
DpnI
Hid1
EcoRII
Jenis enzim vanP tidak davat memotong :
AatU
ApoI
BamHI
BglI
Bsal
ClaI
DraI
EcoRI
en1
Not1
PstI
SalI
SmaI
Tag1
XbaI
XhoI
Gambar 26. Susunan nukleotida dan asam amino klon
QnaliSO yang menyandikan Auxin Induced
Protein. Kode asam amino terletak di
bawah sueunan nukleotida.
Figure 2 6 .
Nucleotide and amino acid sequence o f the gmali50
clone encoded Auxin Induced Protein. The amino
acid sequence i s under the nucleotide sequence.
-
~~
~
-~
- - - - -
--
A. thaliana: 19 V R N Y R I ( N V H R N Q K S G B A G E A M S S G G G N A - - - - N K V S ~ R P Y L R K M ~ S Y K D L74
S
V. radiacs : 77 IRSYR)(NNVQQRKBEESE--- - - - - - - --GNGMYVKVSWYLRKIDLKVYKSYPELL 125
P. sativvn
7 7 I R S Y R L M S L H E I \ D V G - - - - - - - - - - - - - - - - G I F W S ~ ~ R X I D L R W O G Y 120
SELL
.
A. thaliana: 75 D A L A ~ F ~ S P T H G ~ S Y G A Q G M I D F H N E S K V W L & S P E W P S ~ D W D D ~ L V G D V P W P M133
V. radidca :I26 ~ E l * r P K C - - - - - - - - - - - - - I F G E Y S E R E G Y N G S - E Y A P ~ E D K D O D W M L V G D V 172
PWNH
P. sacivum :I21 W E T M F K L T - - - - - - - - - - - - - I G E Y S E H E G Y M S - E Y A P ~ B U 1 ( U O U W M L V G D V P W165
D-
Gambar 27. Perbandingan asam aminoAuxin Induced Protein kedelai
terhadap Auxin Induced Protein taoaman lainnya
Figure 27.
Alignment of amino acidsequence ofsoybean's Auxin Induced Protein
with other plant's Aurin Induced Protein
Klon sapali mempunyai ukw:an 637 pb dengan 202 asam amino dan
menyandikan protein peptidase aminoacyl (posisi kodon awal ATG = 1-3 clan kodon
akhir TAG = 607-609). Karena dalam ekspresinya gen ini terinduksi o1eh cekaman Al,
maka diberi nama sapali (Soybean gminoacyl peptidme gluminium induced). Hasil
pengurutan nukleotida dan asam amino tercantum pada Gambar 28, dan perbandingan
asam amino penyandi peptidase aminoacyl kedelai dengan peptidase aminoacyl
Arabidopsis thaliana ditunjukkan pa& Gambar 29. Adanya kesamaan klon sapali ini
dengan peptidase aminoacyl (salah satu jenis serine protease) Arabidopsis thaiiana
mengindikasikan adanya peningkatan aktivitas enzim proteolitik khususnya peptidase
aminoacyl oleh cekaman A1 untuk proses ketahanan terhadap aluminium
1
BTOOCAOCTACTCAOGAAGATGTGTACTCTDATCCCGGTTCTCCTAT~T~OOAGAACT 60
M A A T Q E D V Y S D P G S P W M R R T
61
CAAGCTGGGACATACATTATTGCCAGGATJAAGAAGGAAAGTGATGAAGGAAGATATATT 120
Q A G T Y I I A R I K K E S D E G R Y I
121
ATACTGAATGGAAATGGTGCTACACCAGAAGGAIACATTCCATTCCTTGATCTGTTTGAC 180
1 L N G N G A T P E G N I P F Y . D L F D
181
ATAAATACAGGTAAIUAAATGGAACGAATCTGGGAGAGCGATAAGGAGAAGTATTATGAG 240
I N T G K K M E R I W E S D K E K Y Y E
241
ACTGTTGTTGCTCTAATGTCTGATCAAGAAGAAGGGGATTTGTATTTAGATJAACTGAAG 300
T V V A L M S D Q E E G D L Y L D K L K
301
ATACTGACTTCTAAAGAGT~CTGAAAACACCCAATACTACTTTGTTAGCTGGCCA
I
361
481
K
E
S
K
T
E
N
T
Q
Y
Y
F
V
S
W
360
P
K
N
I
V
Q
V
T
N
F
P
H
P
Y
P
Q
L
A
S
L
480
CTACCACCAGGTTACAATCCATCAACAGATGGCCCTTTGCCATGCCTGGTTTGGTCTTAC 540
P
P
G
Y
N
P
S
T
D
G
P
L
P
C
L
V
W
S
Y
CCAGGAGAATTTAAGAACAAAGATGCTGCTGGACAAGTTCGTGGTCTCCARATGAATTTG 600
P
601
S
CAGAAAGAGATGATCAGATATGRRAGAAAAGACGGGGTTCAACTTACTGCTACATTATAC
Q K E M I R Y E R K D G V Q L T A T L Y
L
541
T
GAT~CATAGTTCAGGTTA~TTTCCCTCATCCATACCCTCAGCTTDCATCATTG 420
D
421
L
G
E
F
K
N
K
D
A
A
G
Q
V
R
G
L
Q
M
N
L
CMOAATBEGCTCCACATCTTCCTGAGTAGCTGCCATCGCCCGAAACTTCATTCGTT
L
E
*
Jenis enzim vane daaat memotong:
Ah1 ApoI
BsaI
DdeI
DpnI
MboII
Jenis enzim vane tidak daaat memotong:
AatlZ AloZ
ApaI A v d BarnHz BgU
~ p n z~ d e z Notl ~ s t l P V ~ S&
SwaI TaqZ
XbaI XhoZ XmnZ
Gambar 28.
MseI
Clal
SmaI
TaqII
Tat1
XcmI
DraI EcoRZ Hindlll
~ p d~ p ssp1
h ~
Susunan nukleotida dan aeam amino klon
Saali yang menyandikan Aminoacyl peptidaee
Kode asam amino terletak di bawah sueunan
nukleotida. Sekuen ini dapat diaksee pada
Bank Den Data No. AF91304
Figure 28. Nucleotide and amino a c i d sequence of the s a p a l i
Clone encoded Aminoacyl peptidase
The amino acid sequnce i s under t h e nucleotide
sequence.
This sequence could be accessed i n
GeneBank database no. AF91304.
.
G.max
1 5 4 QLTATLYLPPGYNPSTDGPLPCLVWSYPGEFKNKDAAGQVRG 195
A.thaliana
665 QLTATLYLPPGYDPSKDGPLPCLFWSYPGEFKSKDAAGQVR5 7 0 6
IIIIIIIIIIII.I1 1 1 1 1 1 1 1 1 l l l l l l l . l l f l l l l l l
Garnbar 29. Perbandingan asam amino peptidase aminoacyl kedelai
dengan peptidase aminoacyl Arabidopsis thaliana.
Figure 29.
Alignment of amino acid sequence of soybean's Aminoacylpeptidase
Arabidopsis thaliana's Aminoacylpeptidme
IV. Studi Permulaan Ekspresi Klon cDNA di Escherichia coli
Studi ini bertujuan untuk mengkaji peran Mon cDNA terpilih dalam sifat
ketoleranan terhadap cekaman aluminium di Escherichia coli pada taraf A1 yang bersif5t
toksik baginya.
Hasil percobaan terhadap penentuan kadar aluminium yang bersifat toksii bagi
bakteri E. coli DHlOB memperliitkan bahwa : (1) pertumbuhan bakteri kontrol (tanpa
a& vektor) menemui kematian hanya setelah diberi 100 ppm A1 (tanpa antibiotik), (2)
pertumbuhan bakteri transforman (mengandung vektor pengklonan, pBluescript dan
pGEM-T) mengalami p e n m a n pertumbuhan sampai 25% pada taraf A1 300ppm dan
tidak &pat tumbuh pa& 500 ppm A1 (Gambar 30). Perbedaan pertumbuhan ini, antara
bakteri kontrol dan transforman, disebabkan adanya peran vektor yang menghasilkan
beberapa produk genlprotein seperti p-lactamase (resisten terhadap ampisilin) dan
galaktosidase (akibat adanya induksi senyawa IPTG).
P-
Dengan hasil tersebut rnaka kadar A1 300 ppm digunakan untuk menentukan sifat
ketoleranan klon-klon terpilih seperti gmalil, gmalil4, gmali20, gmali49, gmali50, dan
sapali. Hasil percobaan (Gambar 31, 32, 33, 34, 35 dan 36) mengindikasikan bahwa
semua klon gen tersebut terlibat dalam sifat detoksifikasi terhadap cekaman Al, yang
ditunjukkan oleh masih tumbuhnya bakteri sampai umur 48 jam.
Dengan kata lain,
produk dari klon gen tersebut diduga berperan di dalam meliidungi bakteri terhadap
cekaman aluminium. Hasil awal ini sebagai dasar untuk pengujian lebii lanjut semua
klon gen terhadap karakteristik protein produk hasil ekspresinya dengan menggunakan
vektor ekspresi khusus, sekaligus peluang untuk membuat antibodiya untuk dipakai
sebagai alat deteksi dini dan cepat terhadap seleksi galur-galur tanaman terhadap sifat
ketoleranan aluminium.
Gambar 30. Pertumbuhan Ecoli DH103 (kontrol dan transforman)
terhadap cekaman aluminium selama 24 jam
Figure 30.
E
m of A1 slrcss to growth of EscherWIia CON DHlOB for 24 h
Jam
Gambar 31. Ekspresi Mon gmalil (PMA) selama 48 jam oleh cekaman
300 ppm A1 di Escherichia coli DHlOB
Figure 31.
Expression of thegmalil clone (PW)in Escherichia colt DHlOB
by 300ppm A1for 48 h
Jam
1
Gambar 32. Ekspresi Mon gmalil4 @istone H3) selama 48 jam oleh
Cekama 300 ppm A1 di Escherichia coli DHlOB
Figure 32.
Expression of thegmalil4 clone (Hisone H3) In Escherichia w l i
DHIOB by 300ppm A1for 18 h
Gambar 33. Ekspresi klon gmali20 (Catalase) selama 48 jam oleh
Cekama 300 ppm Al di Escherichia coli DHlOB
Figure 33.
Expression of the gmalt20 clone (Catalase) in Escherichia coli
DHl OB by 300 ppm A1for 48 h
INo Vec
N o nR
Jam
Gambar 34. Ekspresi klongmali49 (Dehydrogenase NADH)selama 48
jam oleh cekaman 300 ppm A1 di Escherichia coli DHlOB
Figure 34.
Expression of the gmali49 clone (NADHDehydrogenase) in Escherichia
coli DHIOB by 3OOppm A1for 48 h
Gambar 35. Ekspresi Mon GmaliSO (Auxin induced protein) selama 48
jam-oleh cekaman 300 ppm Al di ~schhichiacoli DHlOB
Figure 35.
fipression of the gmali50 clone (Auxin Induced Protein) in Escherichia
c o ~Di H I O B 360ppm
~~
AIfor 48 h
Gambar 36. Ekspresi Mon sapali (soybean aminoacyl peptidase aluminium
induced) selama 48 jam oleh cekaman 300 DDm Al di
~scherichiacoli DHGB
-
m
Figure 36. Expression of the sapali clone (soybean aminoaql peptidase aluminium
induced) in Escherichia coli DHIOB by 300ppm A?for 48 h