ISOLASI FRAGMEN cDNA DARI GEN PENYANDI

MAKARA, SAINS, VOL. 14, NO. 2, NOVEMBER 2010: 163-167
ISOLASI FRAGMEN cDNA DARI GEN PENYANDI AKTIN
DARI Melastoma malabathricum
Saleha Hannum1,2, Kinya Akashi3, Utut Widyastuti Suharsono1,2, Alex Hartana2,
Akiho Yokota3, dan Suharsono1,2*)
1. Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi, Institut Pertanian Bogor, Bogor 16680, Indonesia
2. Departemen Biologi, FMIPA, Institut Pertanian Bogor, Bogor 16680, Indonesia
3. Graduate School of Biological Sciences, Nara Institute of Science and Technology, Nara 630-0101, Japan
*)
E-mail: [email protected], [email protected]
Abstrak
Melastoma malabathricum adalah tumbuhan yang tumbuh baik pada tanah asam dengan kelarutan Al yang tinggi,
sehingga dapat digunakan sebagai tanaman model untuk toleransi terhadap cekaman aluminium dan asam. Analisis
ekspresi gen-gen yang diinduksi oleh aluminium pada M. malabathricum memerlukan kontrol internal. Aktin adalah
gen housekeeping yang biasa digunakan sebagai kontrol internal. Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi dan
mengklon fragmen cDNA MmACT yang menyandi aktin dari M. malabathricum. RNA total telah berhasil diisolasi dan
dijadikan sebagai cetakan untuk sintesis cDNA total melalui transkripsi balik. Empat fragmen cDNA MmACT telah
berhasil diisolasi dan disisipkan ke dalam plasmid pGEM-T Easy. Keempat fragmen ini selanjutnya dinamakan fragmen
MmACT1, MmACT2, MmACT3, dan MmACT4. Analisis urutan nukleotida menunjukkan bahwa fragmen MmACT1 dan
MmACT2 berukuran 617 pb, dan fragmen MmACT3 dan MmACT4 berukuran 735 pb. Antar keempat fragmen cDNA
MmACT ini memiliki kemiripan nukleotida sekitar 78%-99%, dan kemiripan asam amino sekitar 98-100%. Analisis
hubungan filogenetik berdasarkan urutan asam amino menunjukkan bahwa pada ketidakmiripan 1%, MmACT1,
MmACT2, MmACT3 mengelompok dengan ACT5 Populus trichocarpha sementara MmACT4 mengelompok dengan
ACT9 P. trichocarpa dan ACT1 Gossypium hirsutum. Kedua kelompok ini terpisah dari aktin tumbuhan monokotil.
Keempat fragmen MmACT ini telah terdaftar di GenBank/EMBL/DDBJ dengan nomor aksesi AB500686, AB500687,
AB500688, dan AB500689.
Abstract
Isolation of cDNA Fragment of Gene Encoding for Actin from Melastoma malabthricum. M. malabathricum
grows well in acidic soil with high Al solubility, thereby it can be used as a model plant for tolerance to aluminum and
acid stresses. Actin is housekeeping gene used as an internal control for gene expression analysis. The objective of this
research was to isolate and clone the cDNA fragments of MmACT encoding for actin of M. malabathricum. Total RNA
was isolated and used as the template for cDNA synthesis by reverse transcription. Four cDNA fragments of MmACT,
called MmACT1, MmACT2, MmACT3, and MmACT4, had been isolated and inserted into pGEM-T Easy plasmid.
Nucleotide sequence analysis showed that the size of MmACT1 and MmACT2 is 617 bp, whereas MmACT3 and
MmACT4 is 735 bp. The similarity among these four MmACT is about 78%-99% based on nucleotide sequence and
about 98%-100% based on amino acid sequence. Phylogenetic analysis based on amino acid sequence showed that at
1% dissimilarity, the MmACT1, MmACT2, MmACT3 and the ACT5 Populus trichocarpha are clustered in one group,
while the MmACT4 is grouped with ACT9 P. trichocarpa and ACT1 Gossypium hirsutum, and these two groups are
separated from actin group of monocotyledonous plants. The sequence of MmACT fragments were registered in
GenBank/EMBL/DDBJ database with accession numbers AB500686, AB500687, AB500688, and AB500689.
Keywords: actin, cDNA, cloning, internal control gene, Melastoma malabathricum
jaringan yang memberikan dukungan mekanik sel,
menentukan bentuk sel, pergerakan sel, dan juga
pembelahan sel [1,2]. Aktin juga penting dalam
morphogenesis sel pada tumbuhan, sebagai komponen
1. Pendahuluan
Aktin adalah protein yang sangat penting bagi sel
eukariotik. Protein ini berperan penting dalam membentuk
163
164
MAKARA, SAINS, VOL. 14, NO. 2, NOVEMBER 2010: 163-167
dinding sel, terlibat dalam pertumbuhan rambut akar, sel
trikom, tabung pollen, perpanjangan sel dan apikal
meristem [3].
Gen aktin termasuk housekeeping gene [4], yaitu gen
yang memiliki tingkat eksperesi yang stabil di berbagai
jaringan pada semua tahapan perkembangan. Sifat gen
yang seperti ini menjadikan gen aktin digunakan
sebagai kontrol internal pada analisis ekspresi,
khususnya analisis ekspresi gen dengan metode qRTPCR (quantitative reverse transcriptase polymorphisme
chain reaction) yang merupakan metode analisis
ekspresi yang berkembang saat ini. Gen aktin telah
digunakan sebagai kontrol ekspresi gen pada kentang
[5], kedelai [6], dan padi [7]. Aktin termasuk salah satu
kontrol internal yang paling stabil pada uji ekspresi gen
di daun dan akar Cichorium intybus [8].
Melastoma malabathricum adalah tumbuhan yang dapat
tumbuh dengan baik pada lahan asam dengan
konsentrasi aluminium (Al) yang tinggi [9]. Tumbuhan
ini sangat toleran terhadap cekaman asam dan Al
sehingga sangat baik digunakan sebagai tanaman model
untuk toleransi terhadap asam dan Al. Untuk mempelajari
ekspresi gen-gen pada M. malabathricum, informasi
housekeeping gene dari tumbuhan tersebut sangat
dibutuhkan sebagai kontrol internal. Sampai saat ini
informasi tersebut belum ada. Sementara itu, beberapa
gen dari M. malabathricum yang diduga terlibat dalam
toleransi tumbuhan tersebut terhadap cekaman asam dan
Al seperti, multidrug resistance associated protein [10],
metallothionein type 2 (Mt2) [11], dan H+-ATPase
membran plasma [12] belum dipelajari ekspresinya.
Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi dan
mengklon gen aktin dari M. malabathricum.
2. Metode Penelitian
Isolasi RNA total. Isolasi RNA mengikuti metode
CTAB [10] yang dimodifikasi. Daun sebanyak 0,1 g
digerus dengan bantuan nitrogen cair di dalam mortar
sampai menjadi tepung. Hasil gerusan dimasukkan ke
ependorf yang telah berisi 500 µL buffer ekstraksi (2%
CTAB, 2% PVP 40000, 100 mM Tris-HCl pH 8, 20
mM EDTA, 1,4 M NaCl dan 1% β-mercapto ethanol),
kemudian divorteks dan diinkubasikan pada suhu 65 oC
selama 10 menit. Sebelum ditambahkan 1 x volume
kloroform : isoamil alkohol (24 : 1), suspensi didinginkan
terlebih dahulu. Campuran kemudian divorteks dan
disentrifugasi pada kecepatan 18000 x g (TOMY MX205) pada suhu 4 oC selama 10 menit. Cairan bagian
atas dipindahkan ke ependorf baru, ditambahkan 0,25
volume 10 M LiCl, dan diinkubasi pada suhu -30 oC
selama 2,5 jam. Campuran disentrifugasi pada 18000 x
g pada suhu 4 oC selama 15 menit. Cairan dibuang, dan
endapan RNA total disuspensikan dalam 500 µL TE (10
mM Tris pH 7,4, 1 mM EDTA) dan ditambahkan 1 x
volume phenol pH 9, divorteks dan disentrifugasi pada
18000 x g pada suhu 20 oC selama 10 menit. Cairan
bagian atas yang mengandung RNA total diambil,
dimasukkan ke dalam tabung 1,5 mL dan diekstraksi
kembali dengan 1 x volume fenol : kloroform :
isoamilalkohol (25 : 24 : 1), divortek dan disentrifugasi
pada kecepatan 18000 x g suhu 4 oC selama 10 menit.
Cairan bagian atas diambil, dipindahkan ke tabung 1,5
mL yang baru kemudian ditambah dengan 0,25 volume
10 M LiCl dan diinkubasi pada suhu 30 oC selama 2,5
jam. Cairan disentrifugasi pada kecepatan 18000 x g,
suhu 4 oC selama 15 menit. Endapan RNA total dibilas
dengan 500 µL alkohol 70% dan disentrifugasi pada
18000 x g suhu 4 oC selama 5 menit. Endapan RNA
total dikeringkan dengan vaccum dryer dan
disuspensikan di dalam dH2O. Kualitas dan kuantitas
RNA ditentukan dengan spektrometer UV pada panjang
gelombang 260 nm dan 280 nm. Keutuhan RNA total
dianalisis dengan elektroforesis pada gel agarose 1% di
dalam larutan penyangga TAE 1x. Visualisasi RNA
total dilakukan di atas UV transiluminator GelDoc
(Labquip) setelah diwarnai dengan EtBr (0,5 µg/mL)
selama 15 menit dan dibilas dengan air.
Sintesis cDNA total. Sintesis cDNA total dilakukan
dengan mencampurkan 1 µg RNA total, 10 pmol
oligodT, dan ditambah dH2O untuk volume total reaksi
20 µL, kemudian inkubasi di 65 oC selama 5 menit dan
4 oC selama 5 menit. Ke dalam campuran ditambahkan
1x RT buffer, 1mM dNTP, 40 U RNAse inhibitor, dan
100 U enzim ReverTraAce (Toyobo). Campuran
diinkubasi 42 oC selama 30 menit, 99 oC 5 menit, dan
4 oC 5 menit.
Isolasi fragmen cDNA MmACT. Fragmen cDNA
MmACT diisolasi dengan PCR menggunakan degenerate
primer untuk aktin tumbuhan [13], yaitu PlAc46S
(ATGGTNGGNATGGGNCARAA) sebagai forward
primer, dan PlAc245N (GTDATNACYTGNCCRTCNGG)
dan PlAc284N (ATRTCNACRTCRCAYITCATDAT)
sebagai reverse primer. Komposisi PCR untuk
amplifikasi cDNA MmACT adalah 1 µL cDNA, 1x
buffer taq, 4 mM dNTP mix, 10 pmol primer forward,
10 pmol primer reverse, 2U enzim Taq DNA
polymerase (Toyobo), dan dH2O dengan volume reaksi
20 µL. PCR dilakukan pada kondisi pra PCR 94 oC, 5
menit, denaturasi 94 oC, 30 detik, penempelan primer
pada 52 oC, 30 detik, dan pemanjangan 72 oC, 1 menit,
dengan 30 siklus, dan pasca PCR pada 72 oC, 5 menit,
diikuti dengan 15 oC, selama 10 menit.
Pengklonan fragmen cDNA MmACT. Fragmen
MmACT diligasikan dengan pGEM-T Easy (Promega
Inc.) dengan mencampur 1 µL hasil PCR, 25 ng pGEMT Easy, 1,5 U T4 DNA ligase dan 2,5 µL 2x rapidbuffer
ligasi dan dH2O dalam volume total 5 µL, dan
diinkubasi 1 jam dalam suhu ruang. Hasil ligasi
diintroduksikan ke dalam E. coli galur DH5α mengikuti
prosedur [14].
MAKARA, SAINS, VOL. 14, NO. 2, NOVEMBER 2010: 163-167
Seleksi E.coli yang mengandung vektor rekombinan.
E. coli galur DH5α yang mengandung pGEMT-Easy
rekombinan diseleksi menggunakan seleksi resistensi
terhadap ampisilin dan seleksi biru putih. Konfirmasi
koloni putih mengandung vektor rekombinan yang
tersisipi fragmen MmACT menggunakan PCR koloni
dan memotong plasmid rekombinan dengan enzim
EcoR1 (Promega Inc.).
Pengurutan DNA dan analisis urutan DNA.
Pengurutan DNA dilakukan dengan menggunakan
automatid DNA sequencer (ABI Prism 3700 squencer,
Perkin Elmer, USA). Analisis kesejajaran cDNA
MmACT dilakukan menggunakan program BLAST [15].
Analisis phylogenetik dilakukan dengan menggunakan
program MEGA4 [16].
3. Hasil dan Pembahasan
Isolasi RNA total. RNA total dari M.malabathricum
telah berhasil diisolasi dari daun muda. Berdasarkan
pengukuran spektrofotometer, rasio OD260/OD280 dari
RNA total adalah 1,91 yang menunjukkan bahwa RNA
total yang diisolasi mempunyai kemurnian yang tinggi
dari kontaminan protein. Elektroforesis RNA total untuk
analisis keutuhannya menunjukkan adanya duapita
RNA yang dominan. Kedua pita ini adalah RNA
ribosomal (rRNA) 28S dan 18S. Hasil ini menunjukkan
bahwa RNA total yang diisolasi ini mempunyai
keutuhan yang tinggi sehingga sangat baik digunakan
sebagai cetakan (template) untuk sintesis cDNA total.
Isolasi fragmen cDNA MmACT melalui PCR. PCR
dengan cDNA total sebagai cetakan dan primer
degenerate PlAc46S dan PlAc245N menghasilkan
fragmen cDNA berukuran sekitar 600 pb dan dengan
primer PlAc46S dan PlAc284N menghasilkan 750 pb
(Gambar 1). Fragmen ini selanjutnya dinamakan
fragmen MmACT (aktin M. malabathricum).
PCR dgn primer reverse PIAc245N menghasilkan
fragmen cDNA yang lebih pendek (600 pb) dibanding
primer reverse PIAc284N (750 pb), menunjukkan
bahwa letak primer PIAc245 N lebih kearah hulu (ujung
5’) dibanding primer PIAc284N. Hasil ini sesuai dengan
posisi primer yang digunakan pada struktur umum gen
aktin Arabidopsis thaliana yang menunjukkan bahwa
primer PIAc254N berada lebih kearah hulu dari primer
PIAc284N [13].
Pengklonan fragmen MmACT kedalam plasmid
pGEM-T Easy. Fragmen cDNA kandidat MmACT
yang berukuran sekitar 600 pb dan 750 pb telah
diligasikan dengan plasmid pGEM-T Easy di tengah
gen lacZ. Hasil ligasi telah diintroduksikan kedalam E.
coli galur DH5α dan diseleksi di media seleksi yang
mengandung ampisilin, X-gal dan IPTG. E.coli yang
tumbuh di media seleksi mengandung plasmid,
165
sementara koloni yang berwarna putih mengandung
plasmid rekombinan, dan koloni yang berwarna biru
mengandung plasmid non-rekombinan. Adanya sisipan
fragmen MmACT di tengah lacZ menyebabkan gen lacZ
yang menyandi β-galactosidase(β-gal) yang mengubah
substrat X-gal yang tidak berwarna menjadi berwarna
biru, tidak diekspresikan sehingga E. coli yang
mengandung plasmid rekombinan menjadi berwarna
putih.
Empat koloni putih, yaitu masing-masing dua koloni
dari klon rekombinan yang tersisipi fragmen 600 pb dan
dua koloni dari klon rekombinan yang tersisipi 750 pb
dikonfirmasi dengan PCR. PCR terhadap koloni putih
menghasilkan fragmen DNA yang berukuran 600 pb
dan 750 pb (Gambar 2). Hasil ini menunjukkan bahwa
koloni putih mengandung fragmen MmACT. Untuk
memastikan bahwa fragmen MmACT tersisip di dalam
plasmid pGEM-T Easy, DNA plasmid telah diisolasi
dari koloni putih. Pemotongan terhadap DNA plasmid
rekombinan dengan enzim EcoR1 yang mengapit daerah
penyisipan menghasilkan dua fragmen, yaitu fragmen
DNA berukuran 3000 pb dan 600 pb untuk klon
rekombinan yang tersisipi fragmen cDNA 600 pb, dan
untuk plasmid yang tersisipi fragmen cDNA berukuran
750 pb, menghasilkan fragmen DNA 3000 pb dan 750
pb.
Fragmen DNA berukuran 3000 pb adalah vektor pGMT Easy, sementara pita yang berukuran 600 pb dan 750
pb merupakan fragmen MmACT (Gambar 3). Hasil ini
menunjukkan bahwa ke empat fragmen MmACT telah
berhasil disisipkan kedalam pGEM-T Easy.
1
2
1000 pb Æ
500 pb Æ
Gambar 1. Fragmen MmACT Hasil PCR Menggunakan
Primer PlAc46S dan PlAc245N (1), dan
Primer PlAc46S dan PlAc284N (2)
1
2
3
4
1000 pb Æ
500 pb Æ
Gambar 2. PCR Koloni dari Fragmen Target 750 pb (1 &
2) dan 600 pb (3 & 4)
166
MAKARA, SAINS, VOL. 14, NO. 2, NOVEMBER 2010: 163-167
Analisis fragmen MmACT. Pengurutan DNA terhadap
ke empat fragmen MmACT menghasilkan urutan DNA
(sequence) yang berbeda antara satu sisipan dengan
sisipan lainnya. Hal ini terjadi karena primer yang
digunakan untuk isolasi MmACT adalah primer
degenerate yang memungkinkan menghasilkan fragmen
DNA yang urutan nukleotidanya berbeda.
Analisis ekspresi gen secara kuantitatif dengan qRTPCR memerlukan gen referensi sebagai kontrol internal.
Gen aktin sudah digunakan sebagai kontrol internal
untuk analisis qRT-PCR pada kentang [5], kedelai [6],
padi [7], dan C. intybus [8]. Analisis ekspresi semua gen
di dalam M. malabathricum dapat menggunakan ke
empat gen MmACT ini.
Selain itu, aktin juga disandi oleh multigene family pada
tanaman [17,18]. Pada A. thaliana, famili gen aktinnya
terdiri dari 10 gen yang berbeda, delapan diantaranya
adalah gen fungsional dan dua gen adalah pseudogen
[13]. Dari kapas 15 gen aktin (GhACT) telah berhasil
diisolasi [17]. Ke empat sisipan yang berbeda ini
selanjutnya disebut MmACT1, MmACT2, MmACT3, dan
MmACT4. Pengurutan nukleotida fragmen MmACT1
dan MmACT2 menghasilkan 617 pb yang menyandi 192
asam amino, sementara MmACT3 dan MmACT4 735 pb
yang menyandi 231 asam amino. Ke empat fragmen
cDNA MmACT ini memiliki 78%-99% kemiripan
nukleotida (Tabel 1) dan ke empat MmACT memiliki
kemiripan asam amino sekitar 98%-100%.
Analisis kesejajaran local berdasarkan urutan asam
amino menunjukkan bahwa asam amino MmACT
memiliki kemiripan yang tinggi dengan aktin P.
trichocarpa, bahkan MmACT4 memiliki kemiripan
100% dengan bagian gen aktin 9 P. trichocarpa. Untuk
melihat hubungan genetik MmACT dengan aktin dari
tanaman lain, analisis phylogenetik yang berdasarkan
pada urutan asam amino telah dilakukan (Gambar 4).
Analisis kesejajaran lokal berdasarkan urutan nukleotida
dengan bank data di GenBank dengan program BLAST
(basic local alignment search tool) menunjukkan bahwa
fragmen MmACT1 dan MmACT2 memiliki kemiripan
83% dengan bagian aktin 7 P. trichocarpa, MmACT3
memiliki kemiripan 83% dengan aktin 5 P. trichocarpa
(XM_002316253), dan MmACT4 memiliki kemiripan
87% dengan aktin 9 P. trichocarpa (XM_002331844).
Adanya kesamaan yang tinggi (83%%-87%) fragmen
MmACT dengan urutan nukleotida gen aktin tanaman
lain yang telah lebih dahulu diisolasi (bank data)
menunjukkan bahwa fragmen MmACT yang telah
diisolasi dari M. malabathricum adalah kandidat gen
aktin. Ke empat fragmen MmACT ini telah didaftar
kandidat bank data GenBank/EMBL/DDBJ, masingmasing dengan nomor aksesi AB500686, AB500687,
AB500688, dan AB500689. Ke empat fragmen gen
aktin ini adalah gen aktin yang pertama diisolasi dari M.
malabathricum. Gen aktin ini sangat penting untuk
analisis ekspresi gen di dalam M. malabathricum,
khususnya untuk analisis ekspresi gen secara kuantitatif.
Sementara A. thaliana mengelompok dengan yang lain
pada ketidakmiripan lebih dari 2%. Hasil ini semakin
menguatkan bahwa fragmen cDNA yang diisolasi dari
M. malabathricum adalah fragmen gen aktin.
Berdasarkan struktur umum gen aktin A. thaliana [13]
maka MmACT yang diisolasi dalam penelitian ini
terletak di daerah antara ekson 2 dan ekson 3 (Gambar
5). Posisi MmACT diantara ekson 2 dan ekson 3 ini
sangat penting dalam mendesain primer aktin yang
digunakan untuk verifikasi keberhasilan cDNA yang
Tabel 1. Persentase Kemiripan Nukleotida antar cDNA
MmACT
cDNA
MmACT1
MmACT2
MmACT3
MmACT4
MmACT1
100
99
89
78
MmACT2
100
89
78
MmACT3
100
80
MmACT4 PtACT9 GhACT1 OsACT
ZmACT MaACT AtACT1 PtACT5 1
2
3
4
MmACT1 MmACT2 MmACT3 1000 pb Æ
500 pb Æ
Gambar 3. Verifikasi DNA Plasmid Rekombinan Target
600 pb (1 & 2) dan 750 pb (3 & 4) dengan
Enzim Restriksi EcoR1
0,020 0,015 0,010 0,005 0,000 ketidakmiripan
Gambar 4. Hubungan Pylogenetik antara Aktin M.
malabathricum (Mm), Populus trichocarpa
(Pt), Gossypium hirsutum (Gh), Arabidopsis
thaliana (At), Oryza sativa (Os), Zea mays
(Zm) dan Musa acuminate AAA Group (Ma).
Angka Menunjukkan Ketidakmiripan
MAKARA, SAINS, VOL. 14, NO. 2, NOVEMBER 2010: 163-167
Ekson 1 ATG 5’UTR Ekson 3 Ekson 2 20 151 21 356 1 ∼ 120 nt 355 Ekson 4
TAA
377
Poly A
3’UTR 3 2 ∼ 200 nt
PIAc46S PIAc245N MmACT1;MmACT2 PIAc 284N MmACT3;MmACT4
Gambar 5. Posisi Fragmen MmACT dalam Struktur
Umum Gen Aktin A. thaliana [13]
dalam rangka perakitan tanaman yang toleran terhadap
cekaman asam dan aluminium”, dan Program Sandwich
DIKTI yang telah memberikan kesempatan kepada
Saleha Hannum untuk melakukan penelitian di Nara
Institute of Science and Technology Jepang.
DaftarAcuan
[1]
[2]
bebas dari kontaminasi DNA genom [11]. Sepasang
primer yang didisain berdasarkan dua daerah ekson
yang berbeda yang mengapit daerah intron dapat
digunakan untuk mengetahui keberhasilan sintesis dan
kemurnian cDNA karena amplifikasi dengan cetakan
cDNA yang murni menghasilkan ukuran yang berbeda
dibandingkan dengan menggunakan cetakan cDNA
yang terkontaminasi oleh DNA genom. cDNA yang
murni akan menghasilkan fragmen DNA yang
ukurannya lebih pendek dibandingkan dengan yang
terkontaminasi DNA genom karena hasil amplifikasi
cDNA yang murni tidak mengandung intron.
[3]
4. Simpulan
[8]
Empat fragmen cDNA aktin dari M. malabthricum yang
berhasil diisolasi berukuran 617 pb (MmACT1,
MmACT2) dan 735 pb (MmACT3, MmACT4). Ke empat
fragmen cDNA MmACT ini memiliki kemiripan
nukleotida sekitar 78%-99% dan kemiripan asam amino
sekitar 98%-100%. Analisis hubungan phylogenetik
berdasarkan urutan asam amino aktin menunjukkan
bahwa ke empat fragmen MmACT ini mengelompok
dengan ACT P. tricocharpa. Fragmen MmACT terletak
diantara ekson 2 dan ekson 3 pada struktur umum gen
aktin A.thaliana. Ke empat fragmen MmACT ini telah
didaftarkan di bank data GenBank/EMBL/DDBJ dengan
nomor aksesi AB500686, AB500687, AB500688, dan
AB500689.
167
[4]
[5]
[6]
[7]
[9]
[10]
[11]
[12]
[13]
[14]
[15]
UcapanTerimaKasih
[16]
Terima kasih disampaikan kepada Proyek Hibah
Kompetensi dari Ditjen Pendidikan Tinggi (DIKTI),
Kementerian Pendidikan Nasional yang telah membiayai
penelitian ini dengan judul: “Isolasi dan ekspresi gen
[17]
[18]
M. Vantard, L. Blanchoin, Curr. Opin. Plant. Biol.
5 (2002) 502.
C.A. Blessing, G.T. Ugrinova, H.V. Goodson,
Trends. Cell. Biol. 14 (2004) 435.
L.U. Gilliland, L.C. Pawloski, M.K. Kandasamy,
R.B. Meagher, Plant. J. 33 (2003) 319.
L.L. Tu, X.L. Zhang, D.Q. Liu, S.X. Jin, J.L. Cao,
L.F. Zhu, F.L. Deng, J.F. Tan, C.B. Zhang,
Chinese Sci. Bull. 52/22 (2007) 3110.
N. Nicot, J. F. Hausman, L. Hoffmann, D. Evers,
J. Exp. Bot. 56/421 (2005) 2907.
B. Jan, B. Liu, Y. Bin, W. Hou, C. Wu, T. Han,
BMC
Mol.
Biol.
9/59
(2008)
http://www.biomedcentral.com/1471-2199/9/59.
J.L. Zhang, D.H. Liu, Z.H. Wang, C. Yu, J.H.
Cao, C.T. Wang, D.M. Jin, Asian J. Plant Sci. 8
(2009) 285.
A. Maroufi, E.V. Bockstaele, M.D. Loose, BMC
Mol. Biol. 11 (2010).
http://www.biomedcentral.com/1471-2199/11/15.
T. Watanabe, M. Osaki, Tree Physiology 22
(2002) 785.
Suharsono, S. Firdaus, U.W. Suharsono, Makara
Sains 12 (2008) 102.
Suharsono, N. Trisnaningrum, L.D. Sulistyaningsih,
U. Widyastuti, Biotropia 16 (2009) 28.
Muzuni, D. Sopandie, U.W. Suharsono,
Suharsono. J. Agron. Indonesia 38 (2010) 67.
J.M. McDowell, S. Huang, E.C. McKinney, Y.Q.
An, R.B. Meagher, Genetics 142 (1996) 587.
Suharsono, Hayati 9 (2002) 67.
S.F. Altschul, T.L. Madden, A.A. Schaffer, J.
Zhang, W. Miller, Nucleic Acids Res. 25 (1997)
3389.
K. Tamura. J. Dudley, M. Nei, S. Kumar, Mol.
Biol. Evol. 24 (2007) 1596.
X.B. Li, X.P. Pan, X.L. Wang, L. Cai, W.C. Yang,
The Plant Cell 17 (2005) 859.
Y. Feng, Q. Liu, Q. Xue, J. Plant Physiol. 163
(2006) 67.