SINTESIS DAN PENGKLONAAN FRAGMEN GEN tat
advertisement
SINTESIS DAN PENGKLONAAN FRAGMEN GEN tat (TRANSAKTIVATOR) HIV-1 KE DALAM VEKTOR EKSPRESI PROKARIOT pQE-80L EKAWATI BETTY PRATIWI 0304040257 UNIVERSITAS INDONESIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM DEPARTEMEN BIOLOGI DEPOK 2008 Sintesis dan..., Ekawati Betty Pratiwi, FMIPA UI, 2008 SINTESIS DAN PENGKLONAAN FRAGMEN GEN tat (TRANSAKTIVATOR) HIV-1 KE DALAM VEKTOR EKSPRESI PROKARIOT pQE-80L Skripsi diajukan sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains Oleh: EKAWATI BETTY PRATIWI 0304040257 Depok 2008 Sintesis dan..., Ekawati Betty Pratiwi, FMIPA UI, 2008 SKRIPSI : SINTESIS DAN PENGKLONAAN FRAGMEN GEN tat (TRANSAKTIVATOR) HIV-1 KE DALAM VEKTOR EKSPRESI PROKARIOT pQE-80L NAMA : EKAWATI BETTY PRATIWI NPM : 0304040257 SKRIPSI INI TELAH DIPERIKSA DAN DISETUJUI DEPOK, 10 DESEMBER 2008 dr. BUDIMAN BELA, Sp.MK. PEMBIMBING I Dra. SITARESMI, M.Sc. PEMBIMBING II Tanggal lulus Ujian Sidang Sarjana: 23 Desember 2008 Penguji I : Dr. Andi Salamah (…………………..) Penguji II : Dra. Setiorini, M.Kes. (…………………..) Penguji III : Dr. Wibowo Mangunwardoyo (…………………..) Sintesis dan..., Ekawati Betty Pratiwi, FMIPA UI, 2008 Kupersembahkan Karya ini…. Teruntuk Mama dan Papa tercinta, Untuk sebuah harapan yang terpendam…. Untuk satu janji yang pernah terucap…. Untuk semua peluh dan doa yang selalu dipanjatkan…. Untuk cinta yang tak henti diberikan…. Janji dan harapan itu....terpenuhi kini.... Sintesis dan..., Ekawati Betty Pratiwi, FMIPA UI, 2008 KATA PENGANTAR Bismillahirrahmanirrahim. Alhamdulillahhirabbil alamin. Puji syukur penulis panjatkan ke hadirat Allah SWT, atas semua kesulitan dan kemudahan yang diberikan-Nya, sehingga perjuangan menuju keberhasilan ini menjadi satu pembelajaran yang begitu berarti dalam hidup penulis. Terima kasih yang sebesar-besarnya penulis sampaikan kepada dr. Budiman Bela, Sp.MK. dan Dra. Sitaresmi, M.Sc. selaku Pembimbing atas waktu, perhatian, pengertian, kesabaran, bimbingan, dan dukungan yang tak henti diberikan kepada penulis (terima kasih ibu, akhirnya saya berani naik elevator sendiri). Terima kasih pula kepada Dr. Andi Salamah, Dra. Setiorini, M.Kes., Dr. Wibowo Mangunwardoyo, Drs. Ellyzar I.M. Adil, MS., dan Dr. Wellyzar Sjamsuridzal, selaku Penguji untuk saran yang diberikan dalam menyempurnakan skripsi ini. Kebersamaan di Departemen Biologi tak akan berarti tanpa dukungan dari segenap Dosen dan Staf Departemen Biologi FMIPA UI, terima kasih kepada keluarga besar Departemen Biologi FMIPA UI. Laboratorium Genetika akan selalu menjadi tempat paling berkesan bagi penulis, ucapan terima kasih teristimewa penulis sampaikan kepada Dr. Abinawanto, Retno Lestari, M.Si. dan Mbak Asri untuk semangat dan bimbingan yang diberikan kepada penulis. Laboratorium Mikrobiologi Klinik FKUI pasti menjadi satu tempat tak i Sintesis dan..., Ekawati Betty Pratiwi, FMIPA UI, 2008 ii terlupakan dalam hidup penulis. Terima kasih kepada Andi Yasmon, M. Biomed., Mbak Heni, dr. Wani, dr. Ade, Ibu Yus, Mbak Fithri, Ibu Tati, Mas Heru, dan Alfian untuk bimbingan dan penerimaan yang baik selama penulis melakukan penelitian. Penulis menyampaikan ucapan terima kasih kepada Baliveau untuk persahabatan yang terjalin indah, khususnya kepada Aya, Aster, Ina, Afi, Elly, AE, Budi, dan Radutz. Terima kasih kepada Femy untuk kerjasama, kritik, saran dan persahabatan yang tak tergantikan. Terima kasih kepada Aditya Perkasa untuk satu cerita indah yang dirangkai bersama dan mewarnai lembar hidup penulis. Dua orang istimewa dalam hidup penulis, Mama dan Papa, terima kasih untuk semua doa dan dukungan yang tak henti diberikan kepada penulis. Terima kasih kepada tiga adik tersayang, Leo, Tiger, dan Munah, untuk semangat, cinta dan untuk jasa antar-jemput yang siap sedia setiap saat, Ucapan terima kasih saja tak akan cukup mengartikan betapa semua dukungan, doa, dan kasih sayang kalian kepada penulis menjadi kekuatan terbesar dalam menghadapi saat-saat tersulit. Penulis menyadari skripsi yang disusun belumlah sempurna. Teriring permohonan maaf atas segala keterbatasan dalam skripsi ini, dan semoga karya ini memberi manfaat bagi semua. Penulis 2008 Sintesis dan..., Ekawati Betty Pratiwi, FMIPA UI, 2008 ABSTRAK Telah dilakukan penelitian selama 9 bulan (Februari--Oktober 2008) di Laboratorium Mikrobiologi Klinik FKUI dengan tujuan memperoleh klona pembawa fragmen gen tat HIV-1 strain pNL43. Gen tersebut menyandikan protein Tat yang berperan dalam meningkatkan ekspresi gen-gen HIV. Sintesis fragmen gen tat HIV-1 dilakukan melalui PCR overlapping. Fragmen gen tat HIV-1 (326 pb) dan vektor plasmid pQE-80L (4700 kb) yang telah dipotong dengan enzim XmalI dan SalI kemudian diligasi menggunakan T4 DNA ligase. Hasil ligasi ditransformasi secara kejut panas ke dalam Escherichia coli TOP10 dan diseleksi pada medium LB agar (+ampisilin). Sebanyak 15 koloni transforman dari 81 koloni yang berhasil diperoleh, kemudian diisolasi DNA plasmidnya dan dianalisis digesti serta diverifikasi melalui PCR. Hasil analisis digesti menunjukkan terdapat 4 koloni pembawa plasmid rekombinan yang ditunjukkan oleh visualisasi pita DNA berukuran 316 pb. Verifikasi PCR dengan primer pQE-forward dan Ex2-TatpNL4C menunjukkan bahwa fragmen gen tat HIV-1 berhasil disisipkan dan diklona ke dalam E.coli TOP10. Kata kunci: fragmen gen tat; HIV-1, PCR overlapping, pengklonaan, pNL43, protein Tat. ix + 99 hlm; gbr; lamp; tab. Bibliografi: 79 (1982--2007) iii Sintesis dan..., Ekawati Betty Pratiwi, FMIPA UI, 2008 DAFTAR ISI Halaman KATA PENGANTAR……………………………………………………… i ABSTRAK…………………………………………………………………... iii DAFTAR ISI………………………………………………………………… iv DAFTAR GAMBAR………………………………………………………... vii DAFTAR TABEL…………………………………………………………… ix DAFTAR LAMPIRAN……………………………………………………… ix BAB I. PENDAHULUAN………………………………………………….. 1 BAB II. TINJAUAN PUSTAKA…………………………………………… 6 A. HUMAN IMMUNODEFICIENCY VIRUS…………………... 6 1. Struktur dan genom Human Immunodeficiency Virus-1 6 2. Siklus hidup Human Immunodeficiency Virus-1……….. 7 3. Regulasi ekspresi gen HIV………………………………. 8 B. GEN TRANSAKTIVATOR…………………………………... 9 C. SINTESIS FRAGMEN DEOXYRIBO NUCLEID ACID (DNA) MELALUI TEKNIK POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)…………………………………………… 11 D. PENGKLONAAN…………………………………………….. 12 1. Pengklonaan gen…………………………………………. 12 2. Tahap-tahap pengklonan DNA………………………….. 15 E. SISTEM PENGKLONAAN DI DALAM VEKTOR PLASMID……………………………………………………… 21 iv Sintesis dan..., Ekawati Betty Pratiwi, FMIPA UI, 2008 v A. LOKASI DAN WAKTU PENELITIAN………………………. 23 B. BAHAN............................................................................... 23 1. Cetakan DNA untuk sintesis fragmen gen..................... 23 2. Plasmid.......................................................................... 23 3. Primer............................................................................ 23 4. Bakteri............................................................................ 24 5. Medium…………………………………………………….. 24 6. Buffer............................................................................. 24 7. Bahan kimia................................................................... 25 C. PERALATAN...................................................................... 25 D. CARA KERJA.................................................................... 26 1. Pembuatan larutan, buffer, dan medium........................ 26 2. Sintesis fragmen gen tat HIV-1 dengan metode PCR overlapping.................................................................... 26 3. Purifikasi produk PCR .................................................... 31 4. Isolasi vektor plasmid pQE-80L....................................... 32 5. Digesti plasmid dan DNA target...................................... 33 6. Pengukuran konsentrasi DNA......................................... 34 7. Ligasi DNA sisipan ke dalam vektor pQE-80L................. 35 8. Pembuatan sel kompeten................................................ 35 9. Transformasi plasmid rekombinan.................................. 36 10. Isolasi plasmid rekombinan............................................... 37 11. Elektroforesis hasil isolasi plasmid rekombinan................ 38 Sintesis dan..., Ekawati Betty Pratiwi, FMIPA UI, 2008 vi 12. Analisis restriksi terhadap plasmid rekombinan................ 13. Verifikasi hasil pengklonaan dengan metode 39 PCR.................................................................................. 39 14. Prediksi konstruksi plasmid rekombinan.......................... 40 BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN..................................................... 41 A. SINTESIS DAN AMPLIFIKASI FRAGMEN GEN tat HIV-1 MELALUI TEKNIK PCR OVERLAPPING............................... 41 1. Sintesis dan amplifikasi fragmen ekson 1 dan 2 gen tat HIV-1............................................................................... 41 2. Sintesis fragmen gen tat HIV-1 full-length........................ 43 B. PENGKLONAAN FRAGMEN GEN tat HIV-1 KE DALAM VEKTOR EKSPRESI pQE-80L.............................................. 48 1. Konstruksi vektor rekombinan pQE-80L pembawa fragmen gen tat HIV-1...................................................... 48 2. Transformasi plasmid rekombinan..................................... 51 C. ANALISIS DAN VERIFIKASI PLASMID REKOMBINAN........ 53 1. Isolasi plasmid rekombinan dari koloni transforman hasil ligasi.................................................................................. 53 2. Analisis digesti menggunakan enzim XmaI dan SalI......... 55 3. Verifikasi rekombinan dengan PCR................................... 58 D. ANALISIS PREDIKSI KONSTRUKSI PLASMID REKOMBINAN....................................................................... 58 BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN..................................................... 62 Sintesis dan..., Ekawati Betty Pratiwi, FMIPA UI, 2008 vii A. Kesimpulan.................................................................... 62 B. Saran............................................................................. 62 DAFTAR ACUAN.................................................................................... Sintesis dan..., Ekawati Betty Pratiwi, FMIPA UI, 2008 63 DAFTAR GAMBAR Gambar Halaman 1. Skema penggolongan HIV………………………………………….. 75 2. Struktur virus HIV-1………………………………………………….. 75 3. Struktur genom HIV-1……………………………………………….. 76 4. Siklus hidup HIV-1…………………………………………………… 76 5. Pola pemotongan mRNA primer dan regulasi ekspresi gen HIV1.................................................................................................... 77 6. Skema overlapping extension PCR................................................. 77 7. Skema plasmid pQE-80L……………………………………………. 78 8. Sekuen fragmen ekson 1 dan 2 gen tat HIV-1, posisi primer Ex1-TatpNL4, Ex1-TatpNL4C, Ex2-TatpNL4 & Ex2-TatpNL4C, dan posisi situs restriksi XmaI dan SalI pada peta plasmid pNL43 [Accession number M19921.1]............................................. 79 Skema cara kerja ……………………………………………………. 80 10. Skema PCR overlapping fragmen gen tat HIV-1.......................... 81 11. Hasil elektroforesis produk PCR standar fragmen gen tat HIV-1 ekson 1 dan 2............................................................................... 82 12. Hasil elektroforesis optimasi kondisi annealing PCR overlapping fragmen ekson 1 dan 2 gen tat HIV-1……………………………… 83 13. Hasil elektroforesis PCR fragmen gen tat HIV-1.......................... 84 14. Pola migrasi vektor pQE-80L hasil isolasi ................................... 85 15. Purifikasi hasil digesti DNA vektor dan sisipan............................. 85 16. Koloni Escherichia coli TOP10 setelah ditransformasi dengan vektor pembawa fragmen gen tat HIV-1…………………………... 86 9. viii Sintesis dan..., Ekawati Betty Pratiwi, FMIPA UI, 2008 ix 17. Analisis perbandingan pola migrasi plasmid rekombinan dengan pQE-80L (wild type)....................................................... 87 18. Skema pQE-80L rekombinan yang tepat.................................... 88 19. Visualisasi hasil analisis plasmid rekombinan melalui digesti SalI dan XmaI………………………………………………………… 89 20. Hasil verifikasi PCR terhadap plasmid rekombinan……………… 90 21. Prediksi translasi sekuen fragmen gen tat HIV-1 yang diklona ke dalam plasmid pQE-80L…………………………………………. 91 Sintesis dan..., Ekawati Betty Pratiwi, FMIPA UI, 2008 DAFTAR TABEL Tabel Halaman 1. Pasangan primer untuk sintesis fragmen gen tat HIV-1 full length dari cetakan pNL43............................................................................... 93 Pengukuran konsentrasi DNA plasmid pQE-80L dan fragmen gen tat HIV-1………………………………………………………….. 93 3. Pengukuran konsentrasi DNA plasmid pQE-80L dan fragmen gen tat HIV-1 yang telah didigesti………………………………….. 93 2. DAFTAR LAMPIRAN Lampiran Halaman 1. Komposisi bahan kimia dan pembuatan larutan, buffer, dan medium yang digunakan dalam penelitian................................... 95 2. Perhitungan konsentrasi DNA sisipan untuk reaksi ligasi……………… 98 3. Perhitungan efisiensi transformasi sel Escherichia coli TOP10 kompeten.............................................................................................. 99 x Sintesis dan..., Ekawati Betty Pratiwi, FMIPA UI, 2008
