4 hasil dan pembahasan

4
1
(http://www.tools.neb.com/NEBcutter2/htm).
Analisis kesamaan, filogenetik, dan profil
berdasarkan urutan nukleotida dan deduksi
asam amino dengan Mt2 dari spesies lain
menggunakan program MAFFT ver.6.0.
(http://align.bmr.kyushu-.ac.jp/mafft/online/
server/) (Katoh et al. 2005). Analisis urutan
nukleotida untuk mencari ORF (open reading
frame) menggunakan program BESTORF
(http://www.softberry/bestorf/).
Analisis
domain terkonservasi pada cDNA MmMt2
menggunakan program conserved domain
NCBI
(http://www.ncbi.nlm.nih.
gov/
structure/cdd/wrpsb.cgi).
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil
Isolasi RNA total dari daun
RNA total dari M. malabatrichum
berhasil diisolasi dari daun
muda.
Kuantifikasi
RNA
total
dengan
spektrofotometer pada λ260 menunjukkan
bahwa total RNA yang berhasil diisolasi
berkisar antara 242-360 µg setiap gram bahan
tanaman (Tabel 1).
Tabel 1 Hasil isolasi RNA total
No
Bahan
Absorban
pada
λ260
1
2
3
0.5 g daun
muda
(MD1)
0.5 g daun
muda
(MD2)
0.5 g daun
muda
(MD3)
0.451
λ280
0.265
Rasio
λ260/
λ280
Total
RNA
(µg/g
sampel)
1.70
360.4
2
3
28S
18S
Gambar 2 Elektroforesis RNA total dari daun
muda MD1 (1), MD2 (2), dan MD3
(3).
Sintesis cDNA
PCR dengan primer spesifik gen aktin
digunakan sebagai kontrol untuk melihat
keberhasilan sintesis cDNA dan kemurnian
RNA total dari hasil reaksi RT. PCR dengan
menggunakan primer untuk ekson1-ekson2
dari gen aktin (ActF dan ActR) dan
menggunakan cetakan cDNA, menghasilkan
pita DNA yang berukuran sekitar 450 pb
(Gambar 3).
M
1
2
3
450 pb
Gambar 3 Hasil PCR aktin menggunakan cDNA
total MD1 (1), MD2 (2), dan MD3 (3)
sebagai cetakan.
Amplifikasi fragmen cDNA MmMt2
dengan primer spesifik
Amplifikasi fragmen cDNA MmMt2
dilakukan dengan menggunakan cDNA total
dari daun (cDNA MD2) sebagai cetakan dan
primer spesifik Mt2F dan Mt2R. Hasilnya
ialah satu fragmen cDNA yang berukuran
sekitar 250 pb (Gambar 4).
M MmMt2
0.303
0.162
1.87
242.4
0.315
0.190
1.66
252.0
Kualitas RNA total dianalisis dengan
melakukan elektroforesis di gel agarosa
terdenaturasi oleh formaldehida dengan
buffer MOPS 1x. Hasil elektroforesis tersebut
menunjukkan adanya 2 pita dominan yang
merupakan RNA ribosomal (rRNA) 28S dan
18S (Gambar 2).
250 pb
Gambar
4
Fragmen MmMt2 hasil PCR
menggunakan cDNA MD2 sebagai
cetakan.
Pengklonan cDNA MmMt2 ke dalam
pGEM®-T Easy
Setelah 16 jam di media seleksi, E.coli
yang ditransformasi dengan hasil ligasi antara
pGEM®-T Easy dan cDNA MmMt2
menghasilkan koloni putih dan biru (Gambar
5).
15
koloni putih
koloni biru
Gambar
5
1 M
Koloni E. coli
DH5α yang
ditransformasi dengan hasil ligasi
pGEM®-T Easy
dan cDNA
MmMt2 yang tumbuh di media
seleksi
yang
mengandung
ampisilin, X-gal dan IPTG.
cDNA MmMt2 yang menyisip pada
pGEM®-T Easy di dalam koloni E. coli putih
dikonfirmasi dengan PCR yang selanjutnya
disebut PCR koloni. PCR koloni terhadap
koloni
putih
menghasilkan
fragmen
berukuran sekitar 250 pb yang sama dengan
cDNA MmMt2 hasil isolasi dengan PCR
(Gambar 6A). Selain itu, konfirmasi cDNA
sisipan juga dilakukan dengan pemotongan
DNA plasmid rekombinan yang telah
Analisis cDNA MmMt2
Berdasarkan urutan nukleotida dari
kodon awal (ATG) sampai dengan kodon
akhir, diperoleh cDNA MmMt2 yang
1
diisolasi dari koloni putih menggunakan
enzim EcoR1 yang mengapit daerah
penyisipan.
Pemotongan
tersebut
menghasilkan dua fragmen yaitu fragmen
berukuran sekitar 3000 pb yang merupakan
vektor pGEM®-T Easy dan fragmen
berukuran sekitar 250 pb (Gambar 6B).
M
2
3000 pb
250 pb
250 pb
A
B
Gambar 6 Hasil analisis sisipan cDNA
MmMt2 dengan PCR koloni
(A) dan pemotongan DNA
plasmid rekombinan dengan
EcoR1 (B).
berukuran 246 pb ORF yang menyandikan
81 asam amino dengan 14 Cys (Gambar 7).
1
ATG TCT TGC TGT GGA GGA AAC TGC GGA TGT GGA TCT GGC TGC AAG
Met Ser Cys Cys Gly Gly Asn Cys Gly Cys Gly Ser Gly Cys Lys
45
15
46
16
TGC GGC AAC GGT TGT GGA GGT TGC AAA ATG TAC CCT GAC TTG GGA
Cys Gly Asn Gly Cys Gly Gly Cys Lys Met Tyr Pro Asp Leu Gly
90
30
91
31
TTC TCC GGC GAG ACA ACC ACA ACT GAG ACT TTT GTC TTG GGC GTT
Phe Ser Gly Glu Thr Thr Thr Thr Glu Thr Phe Val Leu Gly Val
135
45
136
46
GCA CCG GCG ATG AAG AAT CAG TAC GAG GCT TCA GGG GAG AGT AAC
Ala Pro Ala Met Lys Asn Gln Tyr Glu Ala Ser Gly Glu Ser Asn
180
60
181
61
AAC GCT GAG AAC GAT GCT TGC AAG TGT GGA TCT GAC TGC AAG TGT
Asn Ala Glu Asn Asp Ala Cys Lys Cys Gly Ser Asp Cys Lys Cys
225
75
226
76
GAT CCT TGC ACC TGC AAG TGA
Asp Pro Cys Thr Cys Lys End
246
Gambar 7 Urutan nukleotida cDNA MmMt2 dari kodon awal (ATG) sampai dengan kodon akhir serta
deduksi asam aminonya.
Analisis keberadaan situs pemotongan
enzim restriksi pada cDNA MmMt2
menunjukkan bahwa pada cDNA MmMt2
mempunyai situs BbvI, BsaBI, BtsCI, TseI,
FokI, ApeKI, CspCI, HpyCH4III, PshAI,
BsrFI, SgrAI, AcuI, BtgZI, MboII, SfaNI,
Cac8I, danHpy188I (Gambar 8). Selain itu,
tidak ada situs restriksi yang terdapat pada
situs multi pengklonan (MCS: multiple
cloning sites). sites sites sites sites sites).
6
2
Gambar 8 Peta restriksi yang terdapat pada cDNA MmMt2.
Berdasarkan hasil analisis kesejajaran
lokal dengan program BLAST (Lampiran 4
dan 5), diambil Mt2 dari beberapa spesies
yang memiliki tingkat kesamaan (max indent)
lebih dari 70% termasuk MaMt2 dan GmMt2
(kedelai kultivar Slamet) untuk penyusunan
pohon filogenetik berdasarkan kesamaan
urutan nukleotida Mt2 dan deduksi asam
aminonya (Gambar 9 dan Gambar 10).
Berdasarkan pohon filogenetik tersebut,
cDNA MmMt2 memiliki kekerabatan yang
sangat dekat dengan AtMt2A dari Arabidopsis
thaliana, MaMt2 dari M. affine, GmMt2 dari
kedelai kultivar Slamet, BjMt2 dari Brassica
juncea, dan BoMt2 dari Brassica oleracea.
Selanjutnya, kelima spesies yang sangat dekat
kekerabatannya
tersebut
dianalisis
perbandingan motif asam amino Cys-nya
(Tabel 2) dan profil domain (Gambar 11).
MmMT2, AtMT2A, MaMT2, dan GmMT2
dimasukkan
dalam
satu
kelompok
(selanjutnya disebut kelompok MmMT2)
karena memiliki kesamaan urutan nukleotida
dan asam amino. dan asam amino.
Gambar 9 Pohon filogenetik berdasarkan urutan nukleotida dari Mt2 berbagai spesies.
27
Gambar 10 Pohon filogenetik berdasarkan urutan asam amino dari MT2 berbagai spesies.
Tabel 2 Perbandingan ORF dan motif asam amino Cys pada kelompok MmMT2 (MmMT2 dari M.
malabatrichum, AtMT2A dari A. thaliana, MaMT2 dari M. affine, dan GmMT2 dari kedelai
kultivar Slamet), BjMT2 dari B. juncea, dan BoMT2 dari B. oleracea
Kelompok
MmMT2
BjMT2
BoMT2
ORF aa 1
1 fragment(s)
1 – 246
1 aa
MSCCGGNCGCGSGCKCGNGCGGCKMYPDLGFSGETTTTETF
**
*x*
*x*
*xx*
VLGVAPAMKNQYEASGESNNAENDACKCGSDCKCDPCTCK*x*
*x* *x*
ORF aa 1
1 fragment(s)
1 – 243
80 aa
MSCCGGNCGCGSGCKCGNGCGGCKMYPDLGFSGESTTTETF
**
*x*
*x*
*xx*
VFGVAPAMKNQYEASGEGVAENDACKCGSDCKCDPCTCK*x*
*x*
*x*
ORF aa 1
1 fragment(s)
1 – 243
80 aa
MSCCGGNCGCGSGCKCGNGCGGCKMYPDLGFSGELTTTETF
**
*x*
*x*
*xx*
VFGVAPTMKNQHEASGEGVAENDACKCGSDCKCDPCTCE*x*
*x* *x*
38
1
2
Gambar 11 Perbandingan daerah domain asam amino terkonservasi antara MmMT2, MaMT2, GmMT2, dan
AtMT2A (1); serta BjMT2 dan BoMT2 (2).
Pembahasan
RNA total yang diisolasi dalam
penelitian ini mempunyai kemurnian dari
kontaminan protein yang baik karena
mempunyai rasio OD260/OD280 berkisar antara
1.66 dan 1.87. Menurut Saunders & Parker
(1999), rasio OD260/OD280 sebesar 1.8 sampai
2.0 menunjukkan RNA total yang diisolasi
mempunyai
kemurnian
yang
tinggi.
Berdasarkan rasio tersebut, maka MD2 yang
mempunyai tingkat kemurnian paling tinggi
selanjutnya digunakan sebagai cetakan untuk
sintesis cDNA total. Hasil elektroforesis
RNA total (Gambar 2) menunjukkan adanya
dua pita dominan. Hal ini menunjukkan
bahwa RNA total mempunyai integritas yang
baik.
RNA total yang berhasil diisolasi
digunakan sebagai cetakan untuk sintesis
cDNA melalui reaksi transkripsi balik
(reverse
transcription/RT).
Oligo(dT)
digunakan sebagai primer spesifik reaksi ini
supaya hanya mRNA yang disintesis dan
diamplifikasi menjadi cDNA karena ciri khas
mRNA ialah memiliki ujung poli-A. PCR
dengan primer spesifik gen aktin digunakan
sebagai kontrol untuk melihat keberhasilan
sintesis cDNA dan kemurnian RNA total dari
kontaminan DNA genom. Amplifikasi DNA
genom ekson1-ekson2 akan menghasilkan
fragmen berukuran sekitar 600 pb karena
intron yang terdapat antara ekson1 dan
ekson2 ikut teramplifikasi. Teramplifikasinya
cDNA dengan primer ActF dan ActR dengan
ukuran 450 pb tersebut menunjukkan bahwa
sintesis cDNA total melalui proses transkripsi
balik telah berlangsung dengan baik. Hal ini
juga membuktikan bahwa RNA total yang
telah diisolasi mempunyai kualitas yang baik
karena terbebas dari kontaminasi DNA
genom.
E. coli galur DH5α
yang
ditransformasi dengan hasil ligasi cDNA
MmMt2 dengan pGEM®-T Easy diseleksi
dalam media yang mengandung ampisilin, Xgal, dan IPTG. E. coli yang tumbuh dalam
media seleksi tersebut disebut transforman
(mengandung vektor plasmid pGEM®-T
Easy). Koloni E. coli putih ialah E. coli yang
mengandung plasmid rekombinan (plasmid
pGEM®-T Easy yang membawa cDNA
MmMt2), sedangkan koloni biru ialah E. coli
yang mengandung plasmid nonrekombinan
(hanya mengandung plasmid pGEM®-T
Easy) (Gambar 5). Gen lacZ menyandikan βgalaktosidase (β-gal) yang mengubah substrat
X-gal menjadi berwarna biru. Bila cDNA
MmMt2 berhasil menyisip pada gen lacZ,
maka gen lacZ tidak dapat berekspresi
sehingga muncul koloni E. coli yang
berwarna putih. Bila tidak terdapat fragmen
yang menyisip pada gen lacZ, maka gen lacZ
akan berekspresi membentuk koloni berwarna
biru.
Pengurutan nukleotida terhadap cDNA
MmMt2 dilakukan melalui dua arah
menggunakan primer T7 dan SP6 (Lampiran
1).
Berdasarkan
keseluruhan
urutan
nukleotida, hanya bagian yang diapit oleh
kodon awal (ATG) yang merupakan bagian
dari primer Mt2F dan kodon akhir (TGA)
yang merupakan bagian dari primer Mt2R,
yang akan digunakan untuk analisis lebih
lanjut.
Analisis situs restriksi menunjukkan
bahwa cDNA MmMt2 tidak mengandung
situs yang terdapat pada MCS pGEM®-T
Easy sehingga semua situs yang terdapat pada
MCS dapat digunakan untuk mengeluarkan
sisipan cDNA MmMt2 dari vektor pGEM®-T
Easy. Analisis situs restriksi sangat penting
untuk pemanfaatan cDNA ini dalam rekayasa
genetika.
Kesejajaran lokal nukleotida dan asam
amino dianalisis menggunakan program
BLAST. BLAST dapat digunakan sebagai
alat untuk menentukan identitas suatu
fragmen DNA yang belum diketahui
berdasarkan tingkat homologi dengan gen
atau fragmen DNA yang telah diketahui di
GeneBank (Mount 2001). Hasil analisis
kesejajaran lokal menunjukkan bahwa cDNA
MmMt2 memiliki kesamaan 100% dengan
49
bagian AtMt2A (Nomor aksesi: NM111773)
dan dengan bagian AtMt-K (U15108), 99%
dengan bagian AtMt1 (X62818), 99% dengan
bagian AtMt1G (D11394) dari Arabidopsis
thaliana, 90% dengan bagian BjMt2 (Y10850
dari Brassica juncea, dan 88% dengan
bagian BoMt (AF200712) dari B. oleracea.
Analisis kesejajaran lokal cDNA MmMt2
berdasarkan nukleotida dengan BLASTn
disajikan dalam Lampiran 3. Hasil analisis
kesejajaran lokal berdasarkan peptida
menunjukkan bahwa protein yang dideduksi
dari cDNA MmMt2 (MmMT2) memiliki
kesamaan 100% dengan bagian AtMT2A
(P25860) dari A. thaliana, 95% dengan
bagian BrMT2 (P69164) dari B. rapa, dan
95% dengan bagian BjMT2 (P69163) dari B.
juncea. Analisis kesejajaran lokal peptida
MmMT2 dengan BLASTp disajikan pada
Lampiran 4. MmMt2 juga memiliki kesamaan
urutan nukleotida dengan MaMt2 dari M.
affine (Suharsono et al. in press) dan GmMt2
dari kedelai kultivar Slamet (Anwar 2008).
Oleh karena urutan nukleotidanya sama,
maka urutan asam amino MmMT2, AtMT2A,
MaMT2, dan GmMT2 juga sama. Hal ini
menunjukkan bahwa MmMT2 memiliki
peranan yang sama dengan AtMT2A yaitu
mengikat dan mendetoksifikasi logam berat
serta membatasi kerusakan oksidatif pada
tanaman (Zhou & Goldsbrough 1995).
Hasil deduksi asam amino dari cDNA
MmMt2 (Tabel 2) menunjukkan bahwa motif
urutan asam amino Cys pada MmMT2 terdiri
atas Cys-Cys (residu 3-4), Cys-X-Cys (8-10,
14-16, 67-69, 73-75, 78-80) dan Cys-X-XCys (20-23). Ketiga motif tersebut
merupakan tipikal komposisi Cys pada
protein MT tipe 2 tanaman. Perbedaan
MmMT2, BjMT2, dan BoMT2 terletak pada
posisi motif Cys di dalam MT2. Pada BjMT2
dan BoMT2 posisinya ialah Cys-X-Cys (810, 14-16, 66-68, 72-74, 77-79).
Analisis
domain
terkonservasi
berfungsi untuk mengetahui pola konservasi
dan perbedaan protein dalam evolusi
molekular (Marchler-Bauer et al. 2002).
Analisis domain konservasi terhadap
MmMT2, MaMT2, GmMT2, dan AtMT2A
(kelompok MmMT2), BjMT2, dan BoMT2
menunjukkan
bahwa
domain
yang
terkonservasi adalah dari asam amino ke-25
sampai dengan asam amino ke-79 walaupun
mempunyai urutan yang berbeda (Gambar
11). Urutan asam amino kelompok MmMT2,
BjMT2, dan BoMT2 termasuk ke dalam
metallothionein 2 superfamily. Namun ada
perbedaan
letak
metallothionein
2
superfamily pada dua kelompok urutan asam
amino tersebut. Pada kelompok MmMT2,
metallothionein 2 superfamily dijumpai pada
asam amino ke-25 sampai urutan ke-80.
Sedangkan pada BjMT2 dan BoMt2,
metallothionein 2 superfamily dijumpai pada
asam amino ke-25 sampai urutan ke-79.
SIMPULAN
cDNA MmMt2 telah berhasil diisolasi
dengan ukuran 246 pb dan menyandikan 81
asam amino. MmMt2 ini memiliki urutan
nukleotida yang sama dengan AtMt2A dari A.
thaliana, MaMt2 dari M. affine, dan GmMt2
dari kedelai kultivar Slamet. MmMT2 diduga
memiliki peranan yang sama dengan
AtMT2A
yaitu
mengikat
dan
mendetoksifikasi
logam
berat
serta
membatasi kerusakan oksidatif pada tanaman.
SARAN
Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut
untuk mengetahui ekspresi MmMt2. cDNA
MmMt2 yang telah berhasil diisolasi dapat
digunakan sebagai pelacak yang digunakan
dalam hibridisasi northern.
UCAPAN TERIMA KASIH
Penelitian ini didanai oleh DIPA
Biotrop
tahun
2005
dengan
judul
”Construction of Genomic Library and
Isolation of Gene Involved in the Plant
Tolerant to Low pH and High Solubility of
Aluminium from Melastoma” dengan
contract agreement No: 13.1/PSRP/SPPEN/IV/2005 atas nama Dr. Ir. Suharsono,
DEA.
DAFTAR PUSTAKA
Anwar Y. 2008. Isolasi dan Karakterisasi
Fragmen cDNA dari Gen Penyandi
Metallothionein dari Kedelai Kultivar
Slamet [tesis]. Bogor: Sekolah
Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor.
Chang S, Puryear J, Cairney J. 1993. A
simple and efficient method for
isolation RNA from pine trees. Plant
Mol Biol Rep 11:113-116.