PROTOKOL IN VITRO

 CANCER CHEMOPREVENTION RESEARCH CENTER (CCRC)
FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS GADJAH MADA
PROTOKOL IN VITRO
NO.
JENIS PROTOKOL
1
PERSIAPAN KERJA IN VITRO DI LABORATORIUM
2
PEMBUATAN MEDIA KULTUR LENGKAP (MK)
3
MENUMBUHKAN SEL DARI TANGKI NITROGEN CAIR
SUMBER
TGL.
DIBUAT
28/02/08
(CELL THAWING)
4
MENYIMPAN SEL DI TANGKI NITROGEN CAIR
(CRYOPRESERVATION)
5
GANTI MEDIA
6
PANEN SEL
7
SUBKULTUR
8
PENGHITUNGAN SEL
9
PREPARASI SAMPEL
10
UJI SITOTOKSIK METODE MTT
11
UJI APOPTOSIS METODE DOUBLE STAINING
12
UJI IMUNOSITOKIMIA
13
UJI KOMBINASI SAMPEL (COMBINATORIAL ASSAY)
14
FLOWCYTOMETRY
15
TRANSFEKSI PLASMID
16
KLONING SEL
17
WESTERN BLOT
Disetujui oleh
ATCC
Diperiksa oleh
Dibuat oleh
Tanggal:
Tanggal:
Tanggal:
Dr. Edy Meiyanto, M.Si., Apt.
Riris Istighfari Jenie, M.Si., Apt.
Endah Puji Septisetyani
1 | P r o t o k o l i n v i t r o C C R C PROTOKOL 1
PERSIAPAN KERJA IN VITRO DI LABORATORIUM
1. Memasuki Lab
Ketika masuk ke dalam lab, tas dan jaket disimpan di dalam locker sedangkan sepatu dilepas ketika
akan memasuki ruangan kerja (jangan lupa membawa log book). Cuci tangan sebelum mulai bekerja.
2. Jas Lab, Masker, dan Sarung Tangan
Selalu gunakan jas lab ketika akan bekerja di laboratorium. Masker dan sarung tangan digunakan
untuk menghindari terjadinya kontaminasi dan paparan bahan yang berbahaya (misal: saat
menimbang MTT yang bersifat karsinogenik).
3. Perlengkapan Kerja
Siapkan lampu spiritus, semprotan alkohol 70 %, mikropipet, tisu gulung, korek, spidol marker,
buangan basah, dan buangan kering (dilapisi plastik bening) sebelum memasuki ruangan kerja.
Peralatan steril (botol duran, conical, tip, tabung reaksi kecil, dll. yang telah diautoklaf) disimpan di
dalam inkubator di ruang preparasi (sebelah oven di ruang pencucian alat). Jika tip (yellow dan blue
tip) yang digunakan habis, isi kembali kotaknya dengan tip baru kemudian seal dengan selotip dan
letakkan di meja di ruang pencucian untuk diautoklaf. Alat yang selesai dipakai, dicuci dengan air
biasa dan direndam di dalam air sabun di bawah bak cuci. Khusus botol media, cuci dengan sabun,
bilas dengan air murni/ aqua purificata (di dalam ember warna biru bertutup), dan masukkan ke
dalam oven. Sampah kering (tip, tisu, plate, dll.) dibuang di tempat sampah. Kembalikan mikropipet,
tisu, lampu spiritus, alkohol 70% di tempat semula setelah selesai bekerja.
4. Sterilisasi LAF
Nyalakan UV untuk sterilisasi LAF selama tidak kurang dari 20 menit. Jika memungkinkan, UV juga
peralatan yang akan digunakan (bahan-bahan jangan ikut di-UV). Kemudian, matikan lampu UV,
buka penutup LAF, dan nyalakan lampu biasa. Jangan berada di depan LAF saat udara laminar akan
berhembus dari LAF. Selanjutnya, semprot permukaan meja LAF dengan alkohol 70 % dan
keringkan dengan tisu. Jika saat ke lab LAF sudah dinyalakan, tidak perlu di-UV lagi, tetapi tetap
semprot dengan alkohol. Setelah selesai bekerja, semprot kembali LAF dengan alkohol, matikan dan
tutup kembali LAF.
5. Lampu Spiritus (Bunsen)
Nyalakan lampu spiritus. Jika isi spiritus habis, isi kembali terlebih dahulu. Jangan gunakan lampu
spiritus jika spiritus tinggal sedikit. Api digunakan untuk memanaskan ujung pipet, tip, tutup plate atau
disk, dan segala macam tutup botol, conical tube, dan mulut botol serta conical tube sebelum dituang
atau ditutup kembali. Hal ini dilakukan untuk menjaga sterilitas selama kerja.
6. Media (RPMI, DMEM), PBS, Tripsin-EDTA, dll.
Bahan-bahan yang disimpan di dalam lemari es, seperti media dan PBS 1x, dikeluarkan terlebih
dahulu agar saat akan dipakai tidak dalam keadaan dingin. Tripsin-EDTA harus dalam suhu kamar
saat akan digunakan karena Tripsin tidak akan bekerja jika masih dalam keadaan dingin. Bahanbahan ini jangan di-UV. Kembalikan bahan ke dalam lemari es setelah selesai digunakan. Jangan
memakai bahan-bahan yang tidak dilabel/ milik orang lain.
7. Pemakaian LAF
LAF maksimal dipakai oleh 2 orang secara bersamaan. Semprot semua peralatan dan botol bahan
dengan alkohol 70% sebelum dimasukkan ke dalam LAF. Semprot juga kedua tangan setiap kali
akan bekerja di LAF jika kedua tangan sempat keluar dari LAF.
2 | P r o t o k o l i n v i t r o C C R C 8. Inverted microscope
Mikroskop digunakan untuk mengamati keadaan sel setiap kali akan bekerja. Amati kondisi sel serta
kemungkinan kontaminasi bakteri atau jamur. Matikan lampu mikroskop (kembalikan ke posisi-0
dahulu) setiap kali selesai menggunakan. Dokumentasi (foto) sel juga diambil dari mikroskop ini.
9. Inkubator CO2
Inkubator digunakan untuk inkubasi sel (menyimpan sel). Jangan membuka inkubator terlalu lama
karena akan menurunkan kadar CO2 di dalamnya. Kendorkan tutup flask jika akan dimasukkan
inkubator. Flask diletakkan dengan posisi ujung flask berada di sisi dalam inkubator.
3 | P r o t o k o l i n v i t r o C C R C PROTOKOL 2
FORMULA MEDIA KULTUR LENGKAP (MK)
Alat:
1. Mikropipet 1 ml
2. Botol duran 100 ml
3. Stiker label
Bahan yang diperlukan setiap membuat media kultur lengkap (MK):
No.
Bahan
Jumlah (%)
Jumlah (per 100 ml)
1.
Penisilin-streptomisin
1%
1 ml
2.
FBS (Fetal bovine serum) quilified
10 %
10 ml
3.
Media (RPMI/DMEM)
4 | P r o t o k o l i n v i t r o C C R C Ad 100 %
ad 100 ml
PROTOKOL 6
PANEN SEL
Alat:
1.
2.
3.
4.
Pipet pasteur
Mikropipet 1 ml
Conical tube
Stiker label/ pulpen marker
Bahan:
1. PBS
2. Tripsin-EDTA 1x (Tripsin 0,25%)
3. MK (DMEM/RPMI)
Langkah
Pekerjaan
1.
Ambil sel dari inkubator CO2, amati kondisi sel. Panen sel dilakukan setelah sel 80%
konfluen.
2.
Buang media dengan menggunakan pipet Pasteur steril.
3.
Cuci sel 2 kali dengan PBS 1x (volume PBS + ½ volume media awal).
4.
Tambahkan tripsin-EDTA 1x (tripsin 0,25%) secara merata dan inkubasi di dalam
inkubator selama 3 menit1.
5.
Tambahkan media + 5 ml untuk menginaktifkan tripsin. Resuspensi sel dengan pipet
sampai sel terlepas satu-satu (tidak menggerombol).
6.
Amati keadaan sel di mikroskop. Resuspensi kembali jika masih ada sel yang
menggerombol.
7.
Transfer sel yang telah lepas satu-satu ke dalam conical steril baru.
Keterangan:
1. Untuk dish diameter 10 cm, tripsin-EDTA = 450 µl, untuk flask= 300 µl; dekantir tripsin yang
berlebih. Tripsin-EDTA digunakan untuk melepaskan sel.
5 | P r o t o k o l i n v i t r o C C R C PROTOKOL 7
SUBKULTUR
Alat:
1.
2.
3.
4.
5.
Pipet pasteur
Mikropipet 1 ml
Conical tube
Culture dish
Stiker label/ pulpen marker
Bahan:
1. MK (DMEM/RPMI)
Langkah
Pekerjaan
1.
Lakukan panen sel sesuai dengan protokol panen sel (protokol 6).
2.
Resuspensi suspensi sel di dalam conical tube.
3.
Ambil + 300 µl panenan sel dan masukkan ke dalam conical yang lain. Tambahkan 7 ml
MK dan resuspensi kembali.
4.
Tuang sel ke dalam wadah (dish) yang telah disiapkan. Homogenkan dan amati kondisi
dan jumlah sel secara kualitatif.
5.
Inkubasi semalam dan ganti MK esok harinya. Amati keadaan sel sebelum dan setelah
diganti media.
6 | P r o t o k o l i n v i t r o C C R C PROTOKOL 8
PENGHITUNGAN SEL
Alat:
1.
2.
3.
4.
Mikropipet 20 µl
Hemacytometer/ hemocytometer
Counter
Mikroskop (inverted/cahaya)
Bahan:
1. Suspense sel hasil panen sel (protokol 6)
Langkah
Pekerjaan
1.
Ambil sel dari inkubator CO2, amati kondisi sel. Panen sel dilakukan setelah sel 80%
konfluen.
2.
Buang media dengan menggunakan pipet Pasteur steril.
3.
Cuci sel 2 kali dengan PBS 1x (volume PBS + ½ volume media awal).
4.
Tambahkan tripsin-EDTA 1x (tripsin 0,25%) secara merata dan inkubasi di dalam
inkubator selama 3-5 menit1.
5.
Tambahkan media + 2-3 ml untuk menginaktifkan tripsin. Resuspensi sel dengan pipet
sampai sel terlepas satu-satu (tidak menggerombol).
6.
Amati keadaan sel di mikroskop. Resuspensi kembali jika masih ada sel yang
menggerombol.
7.
Transfer sel yang telah lepas satu-satu ke dalam conical steril baru. Tambahkan MK + 23 ml. Resuspensi sel.
8.
Ambil 10 µl panenan sel dan pipetkan ke hemacytometer.
9.
Hitung sel di bawah mikroskop (inverted atau mikroskop cahaya biasa) dengan counter2.
10.
Transfer sejumlah sel yang diperlukan ke dalam conical yang lain dan tambahkan MK
sesuai dengan konsentrasi sel yang dikehendaki3.
Keterangan:
1. Untuk dish, tripsin-EDTA = 0,75 ml, untuk flask = 0,5 ml; dekantir tripsin yang berlebih. TripsinEDTA digunakan untuk melepaskan sel.
7 | P r o t o k o l i n v i t r o C C R C 2. Hemacytomete
H
er memiliki 4 kamar hitung (chamber), sbb:
s
(A)
(B)
Gam
mbar 1. (A) He
emacytometer terdiri dari 4 kamar
hitun
ng. Setiap ka
amar hitung terdiri
t
dari 16
6 kotak.
Sel yang gelap (mati) dan sel
s yang berada di
belah atas da
an di sebelah
h kanan
batass luar di seb
tidakk ikut dihitun
ng. Sel di ba
atas kiri dan
n batas
bawa
ah ikut dihitung.
d
(B) Counter untuk
mem
mudahkan dala
am penghitun
ngan sel.
umlah sel yan
ng dihitung/ml = Σsel kama
ar A + Σsel ka
amar B + Σsell kamar C + Σsel
Σ
kamar D x 104
Ju
4
3. Ju
umlah ml pan
nenan sel yan
ng ditransfer = Jumlah total sel yang dip
perlukan ;
Jumlah se
el terhitung/ml
ke
emudian ditam
mbahkan MK
K ad sejumlah ml yang dipe
erlukan.
misal:
m
h total sel yan
ng diperlukan
n untuk menanam 5x103 se
el WiDr di settiap sumuran pada
a. Jumlah
3
96-well plate Æ 5x1
10 x 100 sum
muran (dibuatt lebih) = 5x10
05 sel.
me panenan se
el yang diperllukan (dalam ml) = 5x105 : jumlah sel terhitung/ml
t
b. Volum
c. Karena
a setiap sum
muran akan diisi 100 µl MK berisi sel, maka total volume yang
diperlu
ukan untuk menanam sel = 100 µl x 100
0 sumuran = 10 ml.
d. Jadi, setelah
s
sejum
mlah volume panenan
p
sel ditransfer ke conical baru, ditambahka
an MK
ad 10 ml.
U
Untuk
perlakua
an sel MCF-7
7 = 5x103 sel/ssumuran,
sel T47D = 5x103 sel/ssumuran,
sel HeLa = 5x103 sel/ssumuran,
8 | P r o t o k o l i n v i t r o C C R C PROTOKOL 9
PREPARASI SAMPEL
Alat:
1.
2.
3.
4.
5.
Mikropipet 20, 200, 1000 µl
Tabung reaksi kecil
Rak tabung kecil
Vortex
Conical tube
Bahan:
1. Stok sampel (10 mg) dalam eppendorf
2. DMSO
3. MK
Langkah
Pekerjaan
1.
Timbang sampel kurang lebih 10 mg dengan saksama (gunakan neraca analitik
semimikro) di dalam eppendorf.
2.
Uji kelarutan sampel dalam DMSO.
3.
Tambahkan 50 µl DMSO dan coba larutkan dengan bantuan vortex.
4.
Jika belum larut, tambahkan 50 µl DMSO lagi dan larutkan kembali.
5.
Buat baru stok sampel dalam DMSO setiap kali akan digunakan untuk perlakuan
(recentur paratus).
Buat seri kadar sampel dengan pengenceran stok dalam DMSO menggunakan MK. Jika
terjadi endapan pada pengenceran pertama, jangan dilanjutkan. Pikirkan dahulu
solusinya agar sampel bisa larut, kemudian ulangi lagi pembuatan seri kadar dari stok
DMSO.
Catatan:
1. Range seri konsentrasi untuk orientasi 7-8 seri kadar + 1 – 500 µg/ml (ppm)
Contoh: 1, 10, 25, 50, 100, 150, 200, 400 µg/ml
2. Volume akhir tiap seri konsentrasi untuk perlakuan dibuat 400 µl (100 µl/sumuran, triplo).
9 | P r o t o k o l i n v i t r o C C R C PROTOKOL 10
UJI SITOTOKSIK METODE MTT
Alat:
1.
2.
3.
4.
5.
Mikropipet 20, 200, 1000 µl
Tabung reaksi kecil
Rak tabung kecil
Vortex
Conical tube
Bahan:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Stok sampel (10 mg) dalam eppendorf
DMSO
MK
PBS
96-well plate
Tisu makan (kotak)
Buangan untuk media bekas dan PBS
Langkah
Pekerjaan
1.
Ambil sel dari inkubator CO2, amati kondisi sel. Gunakan kultur sel dalam kondisi 80%
konfluen untuk dipanen.
2.
Panen sel sesuai dengan protokol panen.
3.
Hitung jumlah sel dan buat pengenceran sel dengan MK sesuai kebutuhan mengikuti
protokol penghitungan sel.
4.
Transfer sel ke dalam sumuran, masing-masing 100 µl. Setiap kali mengisi 12 sumuran,
resuspensi kembali sel agar tetap homogen.
5.
Sisakan 3 sumuran kosong (jangan diisi sel).
6.
Amati keadaan sel di mikroskop untuk melihat distribusi sel. Dokumentasikan.
7.
Inkubasi sel di dalam inkubator selama semalam (agar sel pulih kembali setelah panen).
8.
Perlakuan sel dengan sampel dilakukan setelah sel kembali dalam keadaan normal. Jika
dalam waktu semalam kondisi sel belum pulih, inkubasikan kembali. Selalu amati kondisi
sel sebelum perlakuan.
9.
Setelah sel normal kembali, segera buat seri konsentrasi sampel untuk perlakuan
(termasuk kontrol sel dan kontrol DMSO)1 sesuai dengan protokol preparasi sampel
(protokol 9).
10.
Ambil plate yang telah berisi sel dari inkubator.
10 | P r o t o k o l i n v i t r o C C R C 11.
Buang media sel (balikkan plate 180° di atas tempat buangan, kemudian tekan plate
secara perlahan di atas tisu makan untuk meniriskan sisa cairan)
12.
Masukkan 100 µl PBS ke dalam semua sumuran yang terisi sel, kemudian buang PBS
dengan cara membalik plate seperti no. 10. Tiriskan sisa cairan dengan tisu.
13.
Masukkan seri konsentrasi sampel ke dalam sumuran (triplo).
14.
Inkubasi di dalam inkubator. Lama inkubasi tergantung pada efek perlakuan terhadap
sel. Jika dalam waktu 24 jam belum terlihat efek sitotoksik, inkubasi kembali selama 24
jam (waktu inkubasi total: 24-48 jam).
15.
Menjelang akhir waktu inkubasi, dokumentasikan kondisi sel untuk setiap perlakuan (foto
dahulu).
16.
Buang media sel, cuci PBS 1x (seperti pada no. 11), dan tambahkan reagen MTT 100 µl
ke setiap sumuran, termasuk kontrol media (tanpa sel)2. Inkubasi sel selama 2-4 jam di
dalam inkubator (sampai terbentuk formazan).
17.
Periksa kondisi sel dengan mikroskop inverted. Jika formazan telah jelas terbentuk,
tambahkan stopper SDS 10% dalam 0,1 N HCl. Pekerjaan tidak perlu dilakukan di dalam
LAF hood.
18.
Bungkus plate dengan kertas atau alumunium foil dan inkubasikan di tempat gelap (suhu
ruangan) semalam (jangan diletakkan di inkubator!).
19.
Hidupkan ELISA reader, tunggu proses progressing hingga selesai.
20.
Buka pembungkus plate dan tutup plate. Masukkan ke dalam ELISA reader (posisi
jangan terbalik). Baca absorbansi masing-masing sumuran dengan ELISA reader
dengan λ=550-600 nm (595 nm, tekan tombol START).
21.
Matikan kembali ELISA reader. Simpan dan temple kertas hasil ELISA pada LOG
BOOK. Setiap kali pembacaan di ELISA reader, catat di buku catatan pemakaian ELISA
READER.
22.
Buat grafik absorbansi (setelah dikurangi kontrol media) vs konsentrasi (jangan di-logkan) untuk melihat profil sel hidup.
Hitung prosentase sel hidup3 dan analisis harga IC50 dengan Excell (Regresi linear dari
log konsentrasi) atau SPSS (Probit/Logit).
Keterangan:
1. Kontrol negatif = sel + media. Kontrol DMSO = sel + % terbesar DMSO yang digunakan dalam
MK. % DMSO terbesar dilihat dari konsentrasi DMSO dalam seri konsentrasi sampel yang paling
pekat.
2. Stok MTT (5mg/ml) Æ timbang 50 mg sebuk MTT, larutkan dalam 10 ml PBS (dengan bantuan
vortex).
Reagen MTT untuk perlakuan (0,5 mg/ml) Æ ambil 1 ml stok MTT dalam PBS (5mg/ml),
encerkan dengan MK ad 10 ml (untuk 1 buah 96 well plate).
11 | P r o t o k o l i n v i t r o C C R C Gunakan sarung tangan! (MTT – karsinogenik).
3. Prosentase sel hidup =
(Absorbansi perlakuan – Absorbansi kontrol media)
(Absorbansi kontrol negatif – Absorbansi kontrol media)
x 100%
4. Grafik yang dibuat:
a. Profil sel hidup: Absorbansi terkoreksi (absorbansi perlakuan-absorbansi kontrol media)
v.s. konsentrasi. Profil SD (standar deviasi) juga diperhitungkan.
b. Profil persentase sel hidup: % sel hidup v.s. konsentrasi. Profil SD juga diperhitungkan.
c. Untuk regresi linear: % sel hidup v.s. log konsentrasi, dicari persamaan regresi dan R2,
dihitung harga IC50.
5. Contoh desain plate:
12 | P r o t o k o l i n v i t r o C C R C PROTOKOL 11
UJI APOPTOSIS METODE DOUBLE STAINING
Alat:
1.
2.
3.
4.
5.
Mikropipet 20, 200, 1000 µl
Tabung reaksi kecil
Rak tabung kecil
Vortex
Cover slip
Bahan:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Stok sampel (10 mg) dalam eppendorf
DMSO
MK
PBS
24-well plate
Buangan untuk media bekas dan PBS
Reagen etidium bromida-akridin oranye (karsinogen)
Hati-hati, reagen mudah menguap! Gunakan sarung tangan dan masker saat pengecatan.
Langkah
Pekerjaan
1.
Ambil sel dari inkubator CO2, amati kondisi sel. Gunakan kultur sel dalam kondisi 80%
konfluen untuk dipanen.
2.
Panen sel sesuai dengan protokol panen.
3.
Hitung jumlah sel sesuai dengan protokol penghitungan sel. Jumlah sel yang dibutuhkan
untuk uji imunositokimia adalah 5x104 sel/sumuran (5x104 sel/1000 µl MK). Buat
pengenceran suspensi sel sehingga konsentrasi sel akhir 5x104 sel/1000 µl MK.
4.
Siapkan 24 well plate dan cover slip.
5.
Masukkan cover slip ke dalam sumuran menggunakan pinset dengan hati-hati. Transfer
1000 µl suspensi sel ke atas cover slip. Setiap akan mengisi sumuran, resuspensi sel
kembali.
6.
Amati keadaan sel di mikroskop untuk melihat distribusi sel.
7.
Inkubasi sel di dalam inkubator selama semalam (agar sel pulih kembali setelah panen).
8.
Perlakuan sel dengan sampel dilakukan setelah sel kembali dalam keadaan normal. Jika
dalam waktu semalam kondisi sel belum pulih, ganti media sel (MK) dan inkubasikan
kembali. Selalu amati kondisi sel sebelum perlakuan.
9.
Setelah sel normal kembali, segera buat satu konsentrasi sampel (cukup satu – pada
IC50) untuk perlakuan dan satu kontrol DMSO. Kontrol sel hanya ditambah MK.
13 | P r o t o k o l i n v i t r o C C R C 10.
Ambil 24 well plate dari inkubator.
11.
Buang semua MK dengan pipet Pasteur secara perlahan-lahan.
12.
Isikan PBS masing-masing 500 µl.
13.
Buang PBS dengan pipet Pasteur secara perlahan-lahan.
14.
Masukkan sampel ke dalam sumuran.
15.
Masukkan juga media dan kontrol DMSO.
16.
Inkubasi di dalam inkubator. Lama inkubasi tergantung pada efek perlakuan dalam
mengakibatkan apoptosis (10-24 jam).
17.
Amati kondisi sel setelah 10 jam, dokumentasikan. Konsultasikan untuk menentukan
waktu inkubasi.
18.
Setelah inkubasi selesai, keluarkan plate dari inkubator.
19.
Buang semua media dengan pipet Pasteur secara perlahan.
20.
Isikan PBS 500 ml ke dalam sumuran secara perlahan.
21.
Buang PBS dengan pipet Pasteur secara perlahan.
22.
Ambil cover slip dengan pinset dengan bantuan ujung jarum dengan hati-hati.
23.
Letakkan di atas object glass (kaca obyek). Posisi sel harus berada di atas, jangan
sampai terbalik.
24.
Beri label.
25.
Teteskan 10 µl reagen campuran etidium bromida-akridin oranye di atas cover slip.
Ratakan dengan cara menggoyang secara perlahan.
26.
Amati di bawah mikroskop fluoresen.
27.
Jika pewarnaan belum optimal, tunggu beberapa menit dan amati kembali.
28.
Dokumentasikan. Set kamera dengan setting khusus untuk fluoresen.
29.
Setelah selesai, buang cover slip dan cuci kembali object glass.
14 | P r o t o k o l i n v i t r o C C R C PROTOKOL 12
UJI IMUNOSITOKIMIA
Alat:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Mikropipet 20, 200, 1000 µl
Tabung reaksi kecil
Rak tabung kecil
Vortex
Cover slip
Object glass
6-well plate bekas/ dish bekas yang bersih.
Bahan:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
Stok sampel (10 mg) dalam eppendorf
DMSO
MK
PBS
24-well plate
Buangan untuk media bekas dan PBS
Tisu basah (untuk inkubasi).
Reagen imunositokimia (Metanol, Novostain universal detection kit, antibodi COX-2/VEGF/dll.)
Langkah
Pekerjaan
1.
Ambil sel dari inkubator CO2, amati kondisi sel. Gunakan kultur sel dalam kondisi 80%
konfluen untuk dipanen.
2.
Panen sel sesuai dengan protokol panen.
3.
Hitung jumlah sel sesuai dengan protokol penghitungan sel. Jumlah sel yang dibutuhkan
untuk uji imunositokimia adalah 5x104 sel/sumuran (5x104 sel/1000 µl MK). Buat
pengenceran suspensi sel sehingga konsentrasi sel akhir 5x104 sel/1000 µl MK.
4.
Siapkan 24 well plate dan cover slip.
5.
Masukkan cover slip ke dalam sumuran menggunakan pinset dengan hati-hati. Transfer
1000 µl suspensi sel ke atas cover slip. Setiap akan mengisi sumuran, resuspensi sel
kembali.
6.
Amati keadaan sel di mikroskop untuk melihat distribusi sel.
7.
Inkubasi sel di dalam inkubator selama semalam (agar sel pulih kembali setelah panen).
8.
Perlakuan sel dengan sampel dilakukan setelah sel kembali dalam keadaan normal. Jika
dalam waktu semalam kondisi sel belum pulih, ganti media sel (MK) dan inkubasikan
kembali. Selalu amati kondisi sel sebelum perlakuan.
9.
Setelah sel normal kembali, segera buat satu konsentrasi sampel (cukup satu – pada
15 | P r o t o k o l i n v i t r o C C R C IC50) untuk perlakuan dan satu kontrol DMSO. Kontrol sel hanya ditambah MK.
10.
Ambil 24 well plate dari inkubator.
11.
Buang semua MK dengan pipet Pasteur secara perlahan-lahan.
12.
Isikan PBS masing-masing 500 µl.
13.
Buang PBS dengan pipet Pasteur secara perlahan-lahan.
14.
Masukkan sampel ke dalam sumuran.
15.
Masukkan juga media untuk kontrol sel (2 kontrol sel).
16.
Inkubasi di dalam inkubator. Inkubasi 15 jam.
17.
Amati kondisi sel setelah 14 jam, dokumentasikan. Siapkan metanol dingin dan PBS.
18.
Pada jam ke-15, inkubasi dengan sampel dihentikan. Pekerjaan selanjutnya, tidak perlu
di dalam LAF.
19.
Buang semua media dengan pipet Pasteur secara perlahan.
20.
Isikan PBS 500 ml ke dalam sumuran secara perlahan.
21.
Buang PBS dengan pipet Pasteur secara perlahan.
22.
Ambil cover slip dengan pinset dengan bantuan ujung jarum dengan hati-hati.
23.
Letakkan di dalam sumuran 6-well plate bekas atau dish bekas yang bersih.
24.
Beri label.
25.
Teteskan 300 µl metanol dingin, inkubasi 10 menit di dalam freezer.
26.
Buang metanol secara perlahan, jangan sampai cover slip terbalik. Jika pengecatan
akan dilanjutkan pada hari berikutnya, simpan cover slip di dalam freezer.
27.
Tambahkan 500 µl PBS pada cover slip, diamkan 5 menit. Ambil PBS dengan mikropipet
1 ml, buang. Lakukan 2 kali. (intinya, dicuci dengan PBS)
28.
Tambahkan 500 µl akuades, diamkan 5 menit. Buang akuades. Lakukan 2 kali. (intinya,
dicuci dengan akuades)
29.
Teteskan larutan hidrogen peroksidase (blocking solution). Inkubasi 10 menit. Buang
larutan (dengan mikropipet).
30.
Teteskan prediluted blocking serum, inkubasi 10 menit. Buang larutan.
31.
Teteskan antibodi monoklonal primer untuk antigen yang ingin diamati (missal: COX-2),
inkubasi 10 menit.
16 | P r o t o k o l i n v i t r o C C R C 32.
Tambahkan 500 µl PBS, inkubasi 5 menit. Buang PBS.
33.
Teteskan antibody sekunder (biotinylated universal secondary antibody), inkubasi 10
menit.
34.
Tambahkan 500 µl PBS, inkubasi 5 menit. Buang PBS.
35.
Teteskan reagen yang berisi kompleks streptavidin-enzim peroksidase, inkubasi 10
menit.
36.
Tambahkan 500 µl PBS, inkubasi 5 menit. Buang PBS.
37.
Teteskan larutan DAB, inkubasi 10 menit.
38.
Tambahkan akuades 500 µl, kemuadian buang kembali akuadesnya.
39.
Teteskan larutan MayeHaematoxylin, inkubasi 3 menit.
40.
Tambahkan akuades 500 µl, kemuadian buang kembali akuadesnya.
41.
Angkat cover slip dengan pinset secara hati-hati, kemudian celupkan dalam xylol.
42.
Celupkan cover slip dalam alkohol. Keringkan cover slip.
43.
Letakkan cover slip di atas object glass, tetesi dengan lem (mounting media). Tutup
cover slip dengan cover slip kotak.
44.
Amati dengan mikroskop cahaya.
Catatan:
1. Untuk imunositokimia, minimal diperlukan 3 perlakuan (3 cover slip):
a. Kontrol sel tanpa antibodi (akan menunjukkan warna biru).
b. Kontrol sel dengan antibodi.
c. Perlakuan dengan sampel.
2. Ekspresi protein tertentu akan ditunjukkan dengan warna coklat pada sitoplasma (bukan inti sel).
Warna biru menunjukkan tidak adanya protein yang ingin diamati.
17 | P r o t o k o l i n v i t r o C C R C PROTOKOL 10
UJI KOMBINASI DENGAN AGEN KEMOTERAPI
Alat:
1.
2.
3.
4.
5.
Mikropipet 20, 200, 1000 µl
Tabung reaksi kecil
Rak tabung kecil
Vortex
Conical tube
Bahan:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Stok sampel (10 mg) dalam eppendorf
DMSO
MK
PBS
96-well plate
Tisu makan (kotak)
Buangan untuk media bekas dan PBS
Langkah
Pekerjaan
1.
Ambil sel dari inkubator CO2, amati kondisi sel. Gunakan kultur sel dalam kondisi 80%
konfluen untuk dipanen.
2.
Panen sel sesuai dengan protokol panen.
3.
Hitung jumlah sel dan buat pengenceran sel dengan MK sesuai kebutuhan mengikuti
protokol penghitungan sel.
4.
Transfer sel ke dalam sumuran, masing-masing 100 µl. Setiap kali mengisi 12 sumuran,
resuspensi kembali sel agar tetap homogen.
5.
Sisakan 3 sumuran kosong (jangan diisi sel).
6.
Amati keadaan sel di mikroskop untuk melihat distribusi sel. Dokumentasikan.
7.
Inkubasi sel di dalam inkubator selama semalam (agar sel pulih kembali setelah panen).
8.
Perlakuan sel dengan sampel dilakukan setelah sel kembali dalam keadaan normal. Jika
dalam waktu semalam kondisi sel belum pulih, inkubasikan kembali. Selalu amati kondisi
sel sebelum perlakuan.
9.
Setelah sel normal kembali, segera buat seri konsentrasi sampel dan agen kemoterapi
(misal: Doxorubicin) untuk perlakuan (termasuk kontrol sel). Seri konsentrasi terdiri dari 4
konsentrasi: IC50, ¾ IC50 , ½ IC50,dan ¼ IC50.
10.
Ambil plate yang telah berisi sel dari inkubator.
18 | P r o t o k o l i n v i t r o C C R C 11.
Buang media sel (balikkan plate 180° di atas tempat buangan, kemudian tekan plate
secara perlahan di atas tisu makan untuk meniriskan sisa cairan)
12.
Masukkan 100 µl PBS ke dalam semua sumuran yang terisi sel, kemudian buang PBS
dengan cara membalik plate seperti no. 10. Tiriskan sisa cairan dengan tisu.
13.
Masukkan seri konsentrasi sampel ke dalam sumuran @ 50 µl (triplo). Masukkan seri
konsentrasi Doxorubicin untuk kombinasi @ 50 µl.
14.
Inkubasi di dalam inkubator. Lama inkubasi tergantung pada efek perlakuan terhadap
sel. Jika dalam waktu 24 jam belum terlihat efek sitotoksik, inkubasi kembali selama 24
jam (waktu inkubasi total: 24-48 jam).
15.
Menjelang akhir waktu inkubasi, dokumentasikan kondisi sel untuk setiap perlakuan (foto
dahulu).
16.
Buang media sel, cuci PBS 1x (seperti pada no. 11), dan tambahkan reagen MTT 100 µl
ke setiap sumuran, termasuk kontrol media (tanpa sel)2. Inkubasi sel selama 2-4 jam di
dalam inkubator (sampai terbentuk formazan).
17.
Periksa kondisi sel dengan mikroskop inverted. Jika formazan telah jelas terbentuk,
tambahkan stopper SDS 10% dalam 0,1 N HCl. Pekerjaan tidak perlu dilakukan di dalam
LAF hood.
18.
Bungkus plate dengan kertas atau alumunium foil dan inkubasikan di tempat gelap (suhu
ruangan) semalam (jangan diletakkan di inkubator!).
19.
Hidupkan ELISA reader, tunggu proses progressing hingga selesai.
20.
Buka pembungkus plate dan tutup plate. Masukkan ke dalam ELISA reader (posisi
jangan terbalik). Baca absorbansi masing-masing sumuran dengan ELISA reader
dengan λ=550-600 nm (595 nm, tekan tombol START).
Desain plate
1
A
B
C
D
E
F
G
H
2
3
4
5
6
7
8
9
Seri konsentrasi
1-4
sampel
Seri konsentrasi
1-4 Sampel
+ Doxo kons 1
Seri konsentrasi
1-4 Sampel
+ Doxo kons 3
Seri konsentrasi
1-4
Doxorubicin
Seri konsentrasi
1-4 Sampel
+ Doxo kons 2
Seri konsentrasi
1-4 Sampel
+ Doxo kons 4
19 | P r o t o k o l i n v i t r o C C R C 10
11
12
Kontrol Sel
Kontrol Media
PROTOKOL 14
FLOWCYTOMETRY
1. Perlakuan
20 | P r o t o k o l i n v i t r o C C R C 2. Preparasi Sel untuk Flowcytometry
Langkah
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
25.
6 well plate
Siapkan 2 eppendorf untuk 1 jenis perlakuan.
Ambil media dengan mikropipet 1 ml (blue), transfer ke eppendorf I,
jika kurang masukkan ke eppendorf II.
Sentrifus (2000 rpm, 5 menit)
Buang media.
Isikan PBS (@ 500µl) ke dalam sumuran.
Ambil PBS dan transfer ke dalam eppendorf I.
Sentrifus (2000 rpm, 5 menit)
Buang PBS.
24 well
@ 500 µl
@ 500 µl
Ulangi tahap 5-6 sekali lagi.
Tambahkan tripsin 0,25% (200 µl), inkubasi di inkubator 2 menit
Tambahkan media (@ 1 ml), resuspensi, dan pindah ke eppendorf I
dan/ II.
(sel harus lepas satu per satu – amati di mikroskop inverted)
50 µl
@ 500 µl
Tambahkan kembali PBS 500 µl ke dalam sumuran untuk
mengambil sisa sel, kemudian transfer ke dalam eppendorf II.
Sentrifus semua eppendorf (2000 rpm, 30 detik) – tekan “pulse” di
sentrifugator
Buang media/PBS, cuci pellet sel dengan PBS dingin @ 500 µl
Gabungkan suspensi sel dalam eppendorf I. Bilas eppendorf
kosong dengan PBS, transfer ke eppendorf I.
Sentrifus lagi eppendorf yang berisi PBS (2000 rpm, 30 detik)
@ 500 µl
Buang PBS, cuci kembali pellet dengan PBS dingin @ 500 µl.
Sentrifus (2000 rpm, 30 detik).
Buang PBS.
@ 500 µl
Tambahkan reagen flowcytometry 300 µl – buat stok reagen dahulu
dan bungkus alufoil.
Bungkus tiap eppendorf dengan alufoil.
sama
Inkubasi di waterbath 37°C, 10 menit.
Jika akan disimpan, masukkan ke dalam lemari es (jangan di
freezer).
Jika langsung di-flocyto, vortex eppendorf (tanpa membuka
bungkus alufoil).
Masukkan ke flowcyto-tube yang sudah diberi filter (kain nylon/kain
kaca) menggunakan mikropipet 1 ml.
Baca di FACS Calibur.
Catatan:
1. Konsentrasi akhir dalam PBS 500 µl =
a. Propidium Iodide (PI): 50 µg/ml
b. RNase : 20 µg/ml
c.
Triton-X 100 (pro GC - Merck) : 0.1 %
21 | P r o t o k o l i n v i t r o C C R C 2. Stok awal reag
gen:
a. PI : 2,5
5 mg/ml / 50xx (penimbangan 0,7 mg dilarutkan dalam
m 700 µl PBS
S)
b. RNase
e : 10 mg/ml
c.
Triton--X : 1x
3. Reagen
R
flowcy
ytometry untuk 1 sampel: 25
2 µl PI (50x) + 1 µl RNase
e + 0,5 µl TX + PBS ad 500 µl
Gam
mbar. Sentrifu
ugator Sorva
all. Æ : Pulse
e
3. Runnin
ng Flowcytom
metry
4. Analisis
A
Data
a
22 | P r o t o k o l i n v i t r o C C R C Gambar.. Tangki nitrog
gen cair temp
pat penyimpanan sel yang dikryo ( - 179
9°C).
23 | P r o t o k o l i n v i t r o C C R C