14. Flowcytometry revised Mb` Sendy 2nd + Mb` Septi

Halaman 1 dari 7
CANCER CHEMOPREVENTION RESEARCH CENTER FARMASI UGM
Dokumen nomor
Mengganti nomor
URAIAN
Jabatan
: CCRC-02-014-00
:
~
Tanggal : 24 Maret 2009
Tanggal :
~
DIBUAT OLEH
Staf CCRC
DIPERIKSA OLEH
Staf CCRC
DIPERIKSA OLEH
Supervisor CCRC
DISETUJUI OLEH
Pimpinan CCRC
Aditya Fitriasari
24 Maret 2009
Sendy Junedi
Muthi’ Ikawati
Edy Meiyanto
Paraf
Nama
Tanggal
PROSEDUR TETAP
PREPARASI SAMPEL UNTUK FLOWCYTOMETRY
DAFTAR ISI
HALAMAN
DAFTAR ISI
1
A. RIWAYAT REVISI DOKUMEN
2
B. TUJUAN
2
C. PENDAHULUAN
2
D. OPERASIONAL
3
1. Alat
3
2. Bahan
3
3. Prosedur Kerja
3
4. Analisis dan Interpretasi Data
6
Halaman 2 dari 7
CANCER CHEMOPREVENTION RESEARCH CENTER
Dokumen nomor
Mengganti nomor
: CCRC-02-014-00
:
~
Tanggal : 24 Maret 2009
Tanggal :
~
A. RIWAYAT REVISI DOKUMEN
No
Dokumen
-
Isi
No
Dokumen
CCRC-02014-00
Isi
Tanggal
Dibuat oleh
Diperiksa oleh
Diperiksa oleh
Endah P
Riris Istighfari J
Septi
Staff
Supervisor
CCRC
CCRC
Menggunakan format lama
Belum ada penomoran dokumen
Belum ada prosedur pencatatan pada buku komunikasi harian
Tanggal
Dibuat oleh
Diperiksa oleh Diperiksa oleh
Aditya
Sendy Junedi
Muthi’ Ikawati
Fitriasari
Staff
Staff
Supervisor
CCRC
CCRC
CCRC
Menggunakan format baru
Sudah ada penomoran dokumen
Menyebutkan prosedur pencatatan pada buku komunikasi harian
Disetujui
oleh
Edy Meiyanto
Pimpinan
CCRC
Disetujui
oleh
Edy Meiyanto
Pimpinan
CCRC
B. TUJUAN
Memberikan panduan secara detail dan bertahap mulai dari persiapan, pembuatan sampel
dan reagen, perlakuan, preparasi sampel untuk flowcytometry, analisis dan interpretasi
data hasil flowcytometry.
C. PENDAHULUAN
Flowcytometry merupakan suatu teknik yang digunakan untuk menganalisis jenisjenis sel yang terdapat pada suatu populasi sel. Sel dilabel fluoresen, dilewatkan celah
sempit, dan ditembak sinar. Pada suatu populasi sel yang sejenis, misal pada sel kanker
yang diberi perlakuan suatu senyawa sitotoksik, dapat dilakukan analisis terhadap fasefase daur sel, sel apoptosis, serta sel yang mengalami poliploidi. Masing-masing jenis sel
tersebut memiliki perbedaan pada jumlah set kromosom di mana pada fase G0/G1, fase S,
fase G2/M berturut-turut memiliki 2, 3, dan 4 set kromosom. Semakin banyak jumlah set
kromosom, maka intensitas sinyal optik yang diberikan semakin kuat karena kemampuan
fluoresen untuk berinterkalasi pada DNA semakin besar. Pada sel yang mengalami
apoptosis (sub G0), intensitas fluoresen sangat lemah karena kromosom telah mengalami
fragmentasi. Sedangkan pada sel poliploidi, intensitas yang diberikan sangat kuat karena
jumlah set kromosom yang lebih dari 4 set.
Halaman 3 dari 7
CANCER CHEMOPREVENTION RESEARCH CENTER
Dokumen nomor
Mengganti nomor
: CCRC-02-014-00
:
~
Tanggal : 24 Maret 2009
Tanggal :
~
D. OPERASIONAL
1. Alat
a.
b.
c.
d.
e.
f.
g.
h.
6 well plate
Mikropipet 10, 20, 200, 1000 µl
Tabung sentrifus 1,5 ml
Rak tabung kecil
Sentrifugator
Inkubator CO2
Penangas air (37°C)
FACS-Calibur
2. Bahan
a.
b.
c.
d.
e.
f.
g.
h.
Sampel dengan konsentrasi tertentu
Phosphat Buffer Saline (PBS) 1x pH 7
Media kultur (MK)
Tripsin-EDTA 0,25%
RNase
Propidium iodide
Triton-X
Buangan untuk media bekas dan PBS
3. Prosedur
a. Perlakuan (treatment)
No
Pekerjaan
Persiapan
Kerja
Perhatian
1.
Ikuti protokol
Laboratorium.
In
Vitro
di
2.
Ambil sel dari inkubator CO2, amati kondisi sel.
Gunakan kultur sel dalam kondisi 70-80%
konfluen untuk dipanen.
3.
Panen sel sesuai dengan protokol panen.
-
4.
Hitung jumlah sel dan buat pengenceran sel dengan
MK
sesuai
kebutuhan
mengikuti
protokol
penghitungan sel.
Jumlah sel yang dibutuhkan untuk 6 well plate
5
5
adalah 5x10 sel/sumuran (5x10 sel/1000
µL).
5.
Transfer sel ke dalam sumuran 6 well plate, masingmasing 1000 µl (untuk perlakuan dan untuk kontrol
sel).
-
6.
Amati keadaan sel di mikroskop untuk melihat
distribusi sel. Dokumentasikan dengan kamera.
-
7.
Inkubasi sel di dalam inkubator selama semalam
(agar sel pulih kembali setelah panen).
Jika dalam waktu semalam kondisi sel belum
pulih, ganti media dan sel diinkubasikan
kembali. Selalu amati kondisi sel sebelum
perlakuan.
8.
Setelah sel normal kembali, segera buat seri
konsentrasi sampel dan agen kemoterapi (misal:
Doxorubicin) untuk perlakuan.
Untuk masing-masing konsentrasi sampel dan
agen kemoterapi buat volume 500 µL (bisa
dilebihkan sedikit).
Konsentrasi sampel dan Doxorubicin dibuat
dua kali konsentrasi untuk perlakuan, karena
Seri konsentrasi terdiri dari 2 konsentrasi: ¼ IC 50
dan 1/10 IC50.
-
Halaman 4 dari 7
CANCER CHEMOPREVENTION RESEARCH CENTER
Dokumen nomor
Mengganti nomor
: CCRC-02-014-00
:
~
Tanggal : 24 Maret 2009
Tanggal :
~
di
dalam
sumuran
akan
mengalami
pengenceran oleh sampel/Doxorubicin atau
MK.
9.
Ambil plate yang telah berisi sel dari inkubator.
-
10.
Buang media sel dengan menggunakan pipet
Pasteur secara perlahan-lahan.
-
11.
Cuci dengan 500 µl PBS ke dalam semua sumuran
yang terisi sel.
-
12.
Buang PBS dengan pipet Pasteur secara perlahanlahan.
-
13.
Untuk kelompok perlakuan kombinasi :
-
Masukkan 500 µl seri konsentrasi sampel ke dalam
sumuran. Kemudian tambahkan 500 µl seri
konsentrasi Doxorubicin untuk kombinasi.
14.
Untuk perlakuan tunggal :
-
Masukkan 500 µl seri konsentrasi sampel atau
Doxorubicin ke dalam sumuran. Kemudian
tambahkan 500 µl MK.
15.
-
Untuk kontrol sel :
Tambahkan 1000 µl MK ke dalam sumuran.
16.
Inkubasi di dalam inkubator CO2 selama 24 jam.
-
17.
Menjelang akhir waktu inkubasi, dokumentasikan
kondisi sel untuk setiap perlakuan dengan kamera.
-
b. Pembuatan reagen flowcytometry
1) Stok awal reagen :
a) Propidium Iodide (PI) : 1 mg/ml / 50x
•
Timbang 1 mg PI, larutkan dalam 1000 µl PBS.
•
Fungsi : Mewarnai DNA sel (fluorochrome).
•
Penyimpanan : Dibungkus aluminium foil dan di freezer.
b) RNase : 10 mg/ml
•
Fungsi : Mendegradasi RNA.
•
Penyimpanan : Di freezer.
c) Triton-X 100 (pro GC - Merck) : 1x
•
Fungsi : Melisis membran sel.
•
Penyimpanan : Di temperatur kamar.
Halaman 5 dari 7
CANCER CHEMOPREVENTION RESEARCH CENTER
Dokumen nomor
Mengganti nomor
: CCRC-02-014-00
:
~
Tanggal : 24 Maret 2009
Tanggal :
~
2) Reagen flowcytometry untuk 1 sampel :
25 µl PI (50x) + 2,5 µl RNase + 0,5 µl Triton-X + PBS ad 500 µl
•
Untuk 6 sumuran, buat untuk 6 sampel (dibuat berlebih untuk 7 sampel).
•
Bungkus aluminium foil.
•
Perhatian : Senyawa karsinogen (interkalasi DNA), pakai sarung tangan!
3) Konsentrasi akhir reagen dalam PBS 500 µl :
a) Propidium Iodide (PI) : 50
g/ml
b) RNase : 50 µg/ml
c) Triton-X 100 (pro GC - Merck) : 0.1 %
c.
No
Preparasi sampel untuk flowcytometry
Pekerjaan
Perhatian
1.
Siapkan 2 eppendorf untuk 1 jenis perlakuan.
Eppendorf I dan eppendorf II.
2.
Ambil media dari sumuran dengan mikropipet 1 ml,
transfer ke eppendorf I, jika kurang masukkan ke
eppendorf II.
-
3.
Sentrifus dengan kecepatan 2000 rpm selama 3
menit (Gambar A).
-
4.
Buang media dengan cara dituang.
-
5.
Isikan @ 500µl PBS ke dalam sumuran.
-
6.
Ambil PBS dengan mikropipet dan transfer ke
dalam eppendorf I.
-
7.
Sentrifus dengan kecepatan 2000 rpm selama 3
menit.
-
8.
Buang PBS dengan cara dituang.
-
9.
Ulangi pencucian dengan PBS (tahap 5-8) sekali
lagi .
-
10.
Tambahkan 150 µl tripsin-EDTA 0,25%, inkubasi di
inkubator selama 3 menit.
Hati-hati, jangan lebih dari 3 menit.
11.
Tambahkan @ 1 ml MK, resuspensi sampai sel
lepas satu per satu, amati di bawah mikroskop.
MK untuk menginaktivasi tripsin.
12.
Setelah sel terlepas satu-satu, transfer sel ke
eppendorf I dan/ II.
-
13.
Tambahkan kembali 500 µl PBS ke dalam sumuran
untuk mengambil sisa sel, kemudian transfer ke
dalam eppendorf II.
-
14.
Sentrifus semua eppendorf dengan kecepatan 2000
rpm selama 3 menit.
-
15.
Buang MK/PBS dengan cara dituang, tambahkan
dan resuspen pellet sel dengan @ 500 µl PBS
dingin.
-
16.
Gabungkan suspensi sel dalam kedua eppendorf ke
dalam eppendorf I. Bilas eppendorf kosong dengan
PBS, transfer ke eppendorf I.
-
Halaman 6 dari 7
CANCER CHEMOPREVENTION RESEARCH CENTER
Dokumen nomor
Mengganti nomor
: CCRC-02-014-00
:
~
Tanggal : 24 Maret 2009
Tanggal :
~
17.
Sentrifus eppendorf I dengan kecepatan 2000 rpm
selama 3 menit.
-
18.
Buang PBS dengan cara dituang.
-
19.
Tambahkan reagen flowcytometry
resuspen dengan homogen.
20.
Bungkus tiap eppendorf dengan alufoil.
penandaan pada bagian atas eppendorf.
21.
22.
Inkubasi di waterbath 37°C, 10 menit.
Jangan disimpan di kulkas/freezer/suhu kamar.
23.
Resuspen lagi sebelum ditransfer ke flowcyto-tube.
24.
Transfer suspensi sel ke dalam flowcyto-tube
melalui filter (kain nylon/kain kaca) menggunakan
mikropipet 1 ml.
Baca dengan flowcytometer FACS Calibur untuk
mengetahui profil cell cycle (Gambar B).
25.
26.
@ 400 µl,
Beri
Setiap selesai melakukan pekerjaan, lakukan
sanitasi seperti pada Protokol Persiapan Kerja In
Vitro di Laboratorium.
A
Untuk mengaktivasi RNase.
Penyimpanan pada kulkas, freezer, dan pada
suhu kamar akan meningkatkan debris.
Tutup flowcyto-tube dilubangi terlebih dahulu.
Deteksi dilakukan
20.000 sel.
terhadap
10.000
atau
-
B
Gambar. (A) Sentrifugator Sorvall; (B) Flowcytometer FACS-Calibur.
4. Analisis dan Interpretasi Data
Data flowcytometry dianalisis dengan program cell quest untuk melihat distribusi sel pada fase-fase
daur sel sub G1 (apoptosis), S, G2/M, dan sel yang mengalami poliploidi. Penghambatan daur sel
yang terjadi dapat diketahui dengan membandingkan antara efek perlakuan larutan uji dengan
kontrol.
Halaman 7 dari 7
CANCER CHEMOPREVENTION RESEARCH CENTER
Dokumen nomor
Mengganti nomor
: CCRC-02-014-00
:
~
Tanggal : 24 Maret 2009
Tanggal :
~
Contoh Hasil Flowcytometry :
44,81%
G1
27,64 %
G2/M
6,50 %
8,17 %
13,35 %
Sub G1
Polyploid
S
37,95%
35,76%
G1
G2/M
6,67%
Sub G1
9,86%
S
10,21
%
Polyploid
Analisis daur sel MCF-7 dengan flowcytometry
Perlakuan Doxorubicin 350 nM dengan inkubasi 24 jam menunjukkan penghambatan
pada fase G1 dan G2/M.
Jika ada sesuatu dalam SOP ini tidak bisa dilakukan atau tidak sesuai dengan kenyataan
dilapangan, segera laporkan kepada Staff/Supervisor
Staff/Supervisor CCRC