IDENTIFIKASI BAKTERI PENGHASIL FITASE DAN
advertisement
EL-VIVO Vol.1, No.1, 2013 (hal 34 – 44), September 2013 ISSN: 2339-1901 http://jurnal.pasca.uns.ac.id IDENTIFIKASI BAKTERI PENGHASIL FITASE DAN KARAKTERISASI FITASE DARI KAWAH SIKIDANG DIENG Evy Novita Sari1, Sajidan2, Sugiyarto3 1 2 3 Mahasiswa Prodi Biosain Pascasarjana UNS Dosen Pembimbing I Program Studi Biosain Pascasarjana UNS Dosen Pembimbing II Program Studi Biosain Pascasarjana UNS ( e-mail: [email protected] ) ABSTRAK - Asam fitat merupakan bentuk utama penyimpanan fosfat di dalam bahan makanan yang tidak dapat dihidrolisis dalam saluran pencernaan hewan monogastrik, yang berasosiasi dengan protein dan garam mineral membentuk senyawa kompleks yang tidak larut sehingga menghambat penyerapan fosfat, protein dan mineral di dalam tubuh. Fitase atau mio inositol heksakisfosfat fosfohidrolase adalah enzim yang dapat menghidrolisis ikatan fosfoester pada asam fitat, menghasilkan inositol, fosfat anorganik, protein dan mineral, sehingga fosfat, protein dan mineral mudah diserap oleh usus, dapat meningkatkan kualitas nutrisi dan mengurangi polusi fosfat. Tujuan dari penelitian ini yaitu: 1). Menguji adanya bakteri dengan aktivitas fitase pada air dan lumpur kawah Sikidang Dieng. 2). Mengidentifikasi bakteri penghasil fitase tersebut berdasarkan morfologi dan gen 16S rRNA. 3). Mengkarakterisasi ekstrak kasar fitase yang diperoleh dari hasil isolat terpilih. Bakteri diisolasi dari sampel air dan lumpur kawah Sikidang Dieng, kemudian diseleksi dalam media Luria bertani + fitat + bekatul. Aktivitas fitase diukur dengan spektrofotometer dengan kalibrasi KH2PO4. Tiga isolat bakteri dengan aktivitas fitase terbesar identifikasi berdasarkan morfologi dan gen 16S rRNA, sedangkan fitase yang dihasilkannya dikarakterisasi lebih lanjut meliputi suhu optimum, pH optimum, stabilitas suhu dan pH, dan pengaruh ion logam terhadap aktivitas fitase. Hasil penelitian diperoleh 3 isolat yang memiliki aktivitas fitase tertinggi yaitu Bacillus cereus EN 10, Bacillus cereus EN 16, dan Bacillus sp EN 6 dengan aktivitas fitase sebesar 0,32893 U/ml, 0,324953 U/ml, dan 0,32182 U/ml. Fitase dari ketiga bakteri tersebut memiliki suhu optimum 60ºC, 50ºC, dan 60º; dan memiliki pH optimum 4, 6, dan 6. Aktivitas fitase mengalami peningkatan karena penambahan ion Ca2+ dan Mg2+, dan mengalami penurunan karena penambahan ion Fe2+ dan Zn2+. Kata kunci: asam fitat, fitase, karakterisasi fitase, 16S rRNA PENDAHULUAN menghambat Asam fitat merupakan bentuk utama dalam tubuh. Kekurangan mineral di penyimpanan fosfat di dalam tanaman dalam biji-bijian, sereal dan leguminose, yang gangguan digunakan menyebabkan berbagai jenis penyakit. dalam bahan makanan manusia maupun makanan ternak. Asam fitat tidak dapat dapat metabolisme mineral di menyebabkan yang dapat Asam fitat yang tidak dapat di- dalam hidrolisis tersebut tidak dapat dicerna di saluran pencernaan hewan monogastrik, dalam saluran pencernaan sehingga akan dan asam fitat tersebut akan berasosiasi diekskresikan melalui kotoran. Kotoran dengan garamnya membentuk senyawa yang mengandung gugus fosfat tersebut kompleks dapat mencemari tanah dan perairan di yang dihidrolisis tubuh penyerapan tidak larut sehingga 34 EL-VIVO Vol.1, No.1, 2013 (hal 34 – 44), September 2013 sekitarnya. Untuk menanggulangi ISSN: 2339-1901 http://jurnal.pasca.uns.ac.id hidup pada suhu 45-80ºC (Vieille dan masalah pencemaran tersebut, biasanya Zeikus, pada pakan ternak ditambah dengan panas dapat diperoleh pada sumber air senyawa fosfat anorganik atau enzim panas atau kawah gunung berapi. Oleh fitase. karena itu, pada penelitian ini mengambil Fitase atau Mikroorganisme tahan inositol air kawah Sikidang Dieng untuk di- adalah identifikasi dan dikarakterisasi bakteri enzim yang dapat menghidrolisis ikatan yang dapat menghasilkan enzim fitase, fosfoester pada asam fitat, menghasilkan agar enzim tersebut dapat dimanfaatkan fosfat anorganik dan ester fosfat. Fitase lebih baik di bidang industri pangan dan terdapat pakan ternak. heksakisfosfat mio 2001). fosfohidrolase di dalam mikroorganisme. tumbuhan dan Fitase dari mikroorganisme yang telah diteliti oleh METODE PENELITIAN para Waktu dan Tempat Penelitian ahli antara Aspergillus niger lain: fitase (Nagashima, dari Penelitian 1999), laboratorium dilaksanakan Aspergillus ficuum (Irving et al., 1972) mulai bulan Oktober 2011 sampai April Bacillis subtilis (Kerouvo et al., 2000), 2012. Sampel lumpur dan air kawah Eschercia coli (Greiner et al., 1993), dan Sikidang Klebsiella kultur pneumonia (Sajidan et al., diambil bakteri, dilaksanakan 2004). dari dan di Dieng. Isolasi, karakterisasi Laboratorium Mikrobiologi FKIP Biologi, Laboratorium Fitase banyak dimanfaatkan dalam pakan ternak. Biologi FMIPA, dan UPT Laboratorium bahan pangan Pusat MIPA Universitas Sebelas Maret dalam Surakarta. Sedangkan sequencing DNA pencernaan asam fitat, sedangkan fitase dilaksanakan di Laboratorium 1st Base pada Singapura. industri pangan Adanya fitase manusia pada akan memudahkan bahan meningkatkan dan pakan ternak akan kualitas nutrisi pakan ternak dan mengurangi polusi fosfat. Alat dan Bahan Pemanfaatan industri Alat-alat yang digunakan terdiri dari: tinggi tabung reaksi, rak tabung reaksi, cawan dalam pengolahannya, sehingga dibutuh- petri, gelas beker, gelas benda, jarum ose, kan tahan pipet mikro (20l, 200l, 1000l), tip terhadap suhu tinggi. Fitase yang dapat (20l, 200l, 1000l), ependorf (100l, tahan 1,5ml), tersebut fitase dalam membutuhkan enzim fitase terhadap diperoleh dari yang suhu suhu dapat tinggi dapat mikroorganisme bunsen, sentrifuge, yang vortex, autoklaf, neraca, sarung tangan, dapat hidup di daerah dengan suhu masker, inkubator, lemari es, Laminar Air tinggi Flow pula. Mikroorganisme tersebut 35 Cabinet, Waterbath, Digital EL-VIVO Vol.1, No.1, 2013 (hal 34 – 44), September 2013 ISSN: 2339-1901 http://jurnal.pasca.uns.ac.id Mikroskop, PCR, Spektofotometer UV-VIS, yang terdiri dari 2,5% bekatul, 0,5% yeast, Elektroforesis DNA horizontal, Gel Doc, 1% NaCl, 0,25% glukosa, dan 2% bacto dan DNA sequencer. agar. Bakteri diinkubasi pada suhu 37ºC Bahan-bahan yang digunakan antara selama 24 jam. Bakteri yang dapat lain: tripton 1%, NaCl 1%, yeast extract tumbuh pada media tersebut berarti 0,5%, bacto agar 2%, glukosa 2,5%, Na-fitat memiliki 0,4%, bekatul 2,5%, aquades, kristal violet, Penggunaan bekatul sebagai bahan dalam iodium, safranin, CaCl2, NH4NO3, KCl, media seleksi mengacu pada penelitian MgSO4.7H2O, Rosmimik et al., (1998), bahwa Bacillus FeSO4.7H2O, KH2PO4, MnSO4.H2O, Ammonium molibdat, kemampuan coagulans EI.4.4 aktivitas yang fitase. menghasilkan Ammonium metavanadat, HNO3, Natrium fitase mampu menghidrolisis fitat pada asetat, 70%, bekatul. Bakteri kemudian di subkultur- isopropanol, agarosa, DNA kit (Promega), kan lagi pada media LB padat tanpa buffer bekatul, lalu dipindahkan ke media LB HCl, TBE, NaOH, EDTA, alkohol lisozym, etidium bromida, loading dye, master mix PCR cair. (Gotaq green), ddH2O, marka DNA 1kb, primer forward (5’GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG3’), primer reverse 27f c. Penentuan aktivitas Fitase dan Satu ml kultur hasil skrening pada LB cair 765r kemudian disentrifus dengan kecepatan (5’CTGTTTGCTCCCCACGCTTTC 3’). 4000 rpm selama 5 menit. Supernatan yang Prosedur Penelitian a. Pengayaan air dan dan kemudian ditentukan aktivitas fitasenya. Penentuan aktivitas Pemurnian Fitase dilakukan dengan metode Sajidan Mikroorganisme Sampel diperoleh (2002), yaitu dengan 150l filtrat enzim + lumpur diencerkan 750l substrat (0,4% Na-fitat dalam 0,82% sampai 10-8 lalu diinokulasikan pada larutan media Luria Bertani (LB) padat yang diinkubasi pada suhu 37ºC selama 1 jam. terdiri dari: 1% tripton, 0,5% yeast, 1% Kemudian NaCl, dan 2% bacto agar, yang diinkubasi penambahan 2400l larutan stop yang selama 24 jam pada suhu 37ºC. Koloni terdiri dari larutan Amonium molibdat tunggal yang tumbuh pada media LB (2,352 g ammonium molibdat + 2 ml selanjutnya HNO3 + 100 ml aquades), HNO3, aquades, dimurnikan dengan cara melakukan subkultur beberapa kali. Na-asetat pada reaksi pH dihentikan 5) yang dengan dan 10% Amonium metavanadat dengan perbandingan 1,5 : 1 : 2 : 1,5. Absorbansi b. Seleksi bakteri penghasil Fitase diukur Koloni tunggal yang diperoleh kemudian spektrofotometer UV-VIS pada panjang diinokulasikan pada media seleksi padat dengan gelombang 415 nm. 36 menggunakan EL-VIVO Vol.1, No.1, 2013 (hal 34 – 44), September 2013 d. Karakterisasi ekstrak kasar Fitase Karakterisasi ekstrak kasar ISSN: 2339-1901 http://jurnal.pasca.uns.ac.id e. Identifikasi isolat terpilih fitase Identifikasi isolat bakteri meliputi penentuan suhu optimum fitase, meliputi pH optimum fitase, stabilitas suhu dan identifikasi molekuler dengan penanda pH gen 16S rRNA. Ekstraksi DNA bakteri fitase, dan pengaruh ion logam pewarnaan terpilih menggunakan optimum fitase dilakukan dengan cara Promega, kemudian DNA diamplifikasi menentukan pada dengan menggunakan sedangkan primer, dengan rentang suhu 30-90 enzim ºC, ekstraksi dan terhadap aktivitas fitase. Penentuan suhu aktivitas kit gram PCR primer dari universal forward 27f penentuan pH optimum fitase dilakukan (5’GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG3’), dan dengan cara menentukan aktivitas enzim primer pada rentang pH 3-9. (5’CTGTTTGCTCCCCACGCTTTC3’) Penentuan dilakukan enzim stabilitas dengan pada suhu suhu cara reverse 765r fitase (Sajidan, 2004). Reaksi PCR terdiri dari memanaskan 12,5 l master mix PCR (Gotaq green), optimumnya pada 2l DNA, 0,5l primer f, 0,5 l primer r, selang waktu tertentu dan ditentukan dan aktivitasnya volumenya adalah 25 l. Siklus PCR sampai memperlihatkan enzim tidak aktivitas secara l 9,5 meliputi 3 ddH2O, tahap sehingga yaitu: total denaturasi, signifikan. Penentuan stabilitas pH fitase anneling, dilakukan dengan cara melarutkan enzim sebanyak 30 siklus. Denaturasi awal dalam larutan buffer dengan berbagai pH pada suhu 94ºC selama 2 menit, dilanjut 3-9. dengan 30 siklus denaturasi 94ºC selama Masing-masing pada suhu reaksi optimum diinkubasi selama 1 jam. 1 dan menit, extention, anneling pada dilakukan suhu 58ºC Kemudian dilakukan penentuan aktivitas selama 45 detik, extention pada suhu enzim pada pH optimum dan suhu 72ºC selama 90 detik, kemudian extra optimum. extention pada suhu 72ºC selama 5 Penentuan pengaruuh ion logam menit, yang terakhir disimpan pada suhu terhadap aktivitas fitase dilakukan pada 4ºC. Pita DNA hasil PCR diamati dengan kondisi pH dan suhu optimum fitase. Ion agarose gel 1%, diletakkan pada marka logam yang digunakan berasal dari garam 1kb, kemudian ZnCl2, FeCl2, MgCl2 dan CaCl2, masing- untuk masing dengan konsentrasi 10 M. 150l DNAnya, yang kemudian akan dibuat enzim + 750l substrat + 30l efektor konstruksi logam diinkubasi pada suhu dan pH dibandingkan dengan sekuens dari gen optimum fitase selama 1 jam, kemudian bank. -3 ditentukan aktivitasnya. 37 dilakukan mengetahui pohon sequencing susunan filogenetik basa yang EL-VIVO Vol.1, No.1, 2013 (hal 34 – 44), September 2013 ISSN: 2339-1901 http://jurnal.pasca.uns.ac.id Analisa Data bergelombang, tepi Data yang diperoleh dari uji aktivitas tebal, dan koloni tipis. bergerigi, koloni fitase adalah jumlah kandungan fosfat Hasil seleksi fitase diperoleh 28 anorganik yang dihasilkan ketika terjadi isolat bakteri yang terdiri dari 16 isolat rekasi enzimatis antara ekstrak kasar bakteri yang berasal dari sampel air fitase dengan substrat yang mengandung kawah dan 12 isolat bakteri yang berasal asam fitat. Satu unit aktivitas enzim dari sampel lumpur kawah. Hasil ke- fitase didefinisikan sebagai jumlah enzim seluruhan uji aktivitas fitase dari 28 yang mengkatalisis reaksi yang meng- isolat hasilkan 1 mol fosfat organik per menit aktivitas pada Penentuan sampai dengan 0,3250933 U/ml. Dari 28 konsentrasi fosfat anorganik dilakukan isolat tersebut kemudian diambil 3 isolat dengan bakteri yang memiliki aktivitas fitase kondisi optimum. menggunakan ammonium bakteri fitase menunjukkan antara kisaran 0,30088 U/ml diukur yang terbesar, untuk dikarakterisasi lebih menggunakan lanjut. Tiga isolat bakteri yang dapat spektrofotometer UV-VIS. Untuk pem- menghasilkan enzim fitase tertinggi yaitu buatan kurva kalibrasi digunakan larutan isolat EN 10, EN 16, dan EN 6. molibdat-vanadat, absorbansinya kemudian dengan 100–1000 Uji aktivitas fitase akhirnya diperoleh ppm. Tiga isolat bakteri yang memiliki 3 isolat bakteri yang dapat menghasilkan aktivitas fitase terbesar kemudian di- enzim fitase tertinggi yaitu fitase dari identifikasi dan dikarakterisasi enzimnya isolat EN 10, EN 16, dan EN 6. Aktivitas lebih lanjut. fitase dari isolat EN 10 sebesar 0,32893 KH2PO4 dengan konsentrasi Data karakterisasi enzim meliputi: U/ml, aktivitas fitase dari isolat EN 16 suhu optimum fitase, pH optimum fitase, sebesar 0,324953 U/ml, dan aktivitas stabilitas dan fitase dari isolat EN 6 sebesar 0,32182 pengaruh ion logam terhadap aktivitas U/ml (Gambar 1). Satu U = 1 μmol fosfat fitase anorganik yang dibebaskan pada kondisi suhu dianalisis dan pH fitase, secara deskriptif optimum selama 1 menit. kualitatif. Data yang diperoleh. HASIL DAN PEMBAHASAN Isolasi dari sampel air diperoleh 104 koloni bakteri, sedangkan isolasi dari sampel lumpur diperoleh 30 koloni bakteri. Dilihat secara morfologi, ada tipe koloni bakteri yang memiliki permukaan Gambar 1. Diagram batang hasil uji aktivitas mengkilat dan tampak licin, permukaan fitase dari 3 isolat tertinggi. tidak mengkilat, tepi rata halus, tepi 38 EL-VIVO Vol.1, No.1, 2013 (hal 34 – 44), September 2013 Aktivitas fitase dari ketiga isolat ini ISSN: 2339-1901 http://jurnal.pasca.uns.ac.id memiliki suhu optimum 41ºC (Yuanita et masih lebih tinggi daripada fitase Bacillus al., 2010). cereus RW Sm A 0,1071 U/ml, fitase B. Isolat EN 10 menghasilkan aktivitas aryabhattai RW Sm C 0,102 U/ml, fitase fitase yang optimal pada pH 4, sedangkan B. U/ml isolat EN 16 dan EN 6 menghasilkan (Wulandari, 2011), fitase Bacillus sp AP-17 aktivitas fitase yang optimal pada pH 6. 0,0296 U/ml (Kusumadjaja, 2009), fitase Hasil ini berbeda dengan yang dinyatakan B. subtilis 0,044 U/ml (Shimizu, 1992), oleh Keruovo (2000) bahwa pH optimum fitase B. subtilis HG 0,283 U/ml (Yuanita untuk bakteri penghasil fitase, khususnya et al., 2010), dan fitase Bacillus sp. KHU- yang 10 0,2 U/ml (Choi et al., 2001), namun mamiliki pH optimum antara 6,5 sampai lebih rendah daripada fitase B. cereus 7,5. B. subtilis HG memiliki pH optimum ASUIA260 1,160 U/ml (Shobirin et al., antara 2009). Artinya bahwa isolat EN 10, EN 16 Bacillus sp KHU-10 memiliki pH optimum dan EN 6 memiliki kemampuan meng- antara 6-8 (Choi et al., 2001), sedangkan hasilkan enzim fitase yang dapat di- B. amyloliquefaciens DS11 memiliki pH manfaatkan sebagai sumber penghasil optimum antara 7-8 (Kim et al., 1998). pH enzim fitase yang baru. sangat berpengaruh terhadap aktivitas cereus RW Sl 5 0,0874 Suhu optimum untuk enzim fitase berasal enzim 6,5–7 karena dari kelompok (Yuanita et Bacillus al., perubahan 2010), pH dapat hasil dari isolat EN 10 dan EN 6 adalah menyebabkan perubahan muatan pada 60ºC, sedangkan suhu optimum untuk residu enzim fitase hasil dari isolat EN 16 menyusun pusat aktif enzim, sehingga adalah 50ºC. Suhu optimum fitase dari akan ketiga isolat ini lebih rendah bila di- konformasi enzim, daya katalitik, dan bandingkan dengan fitase yang dihasil- efisiensi kan oleh Bacillus sp. strain DS11 yang (Nelson dan Cox, 2000). memiliki suhu optimum 70ºC (Kim et al., 1998), dan memiliki Bacillus suhu (Kusumadjaja, sp AP-17 optimum 2009); sama asam amino, berpengaruh pengikatan terutama pula yang terhadap substrat-enzim Setelah mencapai aktivitas optimum, yang ketiga isolat akan mengalami penurunan 75ºC aktivitas fitase. Isolat EN 10 mengalami dengan penurunan aktivitas fitase menjadi Bacillus sp KHU-10 dan B. subtilis CH92 88,98% setelah dipanaskan selama 1 jam yang memiliki suhu optimum 60ºC (Choi dan aktivitasnya menjadi 36,83% setelah et al., 2001; Hong et al., 2010); namun dipanaskan selama 5 jam. Isolat EN 16 lebih tinggi bila dibandingkan dengan mengalami penurunan aktivitas fitase fitase yang dihasilkan oleh B. cereus RW menjadi Sm A yang memiliki suhu optimum 40ºC selama 1 jam dan aktivitasnya menjadi (Wulandari, 2010), dan B. subtilis HG yang 29,11% setelah dipanaskan selama 5 jam. 39 83,08% setelah dipanaskan EL-VIVO Vol.1, No.1, 2013 (hal 34 – 44), September 2013 Isolat EN 6 mengalami penurunan ISSN: 2339-1901 http://jurnal.pasca.uns.ac.id 731bp, isolat EN 16 menghasilkan 717bp, aktivitas fitase menjadi 89,84% setelah dan isolat EN 6 menghasilkan 709bp. dipanaskan selama 1 jam dan aktivitasnya menjadi 27,80% setelah dipanaskan selama 5 jam. EN 6 EN 10 EN 16 2000 bp 1500 bp 1000 bp 900 bp 800 bp 700 bp 600 bp 500 bp Ketiga isolat mengalami kenaikan aktivitas karena adanya penambahan ion Ca2+. Ion Mg2+ juga dapat meningkatkan aktivitas fitase, namun peningkatanya lebih sedikit bila dibandingkan dengan ion Ca2+. Penambahan ion Zn2+ dapat Gambar 2. Foto pita DNA hasil elektroforesis menurunkan aktivitas fitase dari ketiga setelah di PCR. isolat, namun penambahan ion Fe2+ hanya Sekuens dapat menurunkan aktivitas fitase pada morfologi dari sederhana, bakteri homologi bulat isolat terpilih dengan sekuens yang ada pada berwarna Sekuens tunggal DNA yang berukuran sekitar kemudian 700bp. Produk PCR tersebut kemudian dengan mendapatkan dari ketiga dibandingkan sekuens DNA isolat ini kemiripannya dari bakteri (no. akses JQ740157.1); B. subtilis strain program Peak Trace untuk memperbaiki kemudian DNA yaitu: fitase B. amiloliquefasciens AP-17 DNA kemudian dimasukkan ke dalam DNA, bahwa penghasil fitase yang lain dari gen bank, susunan basa DNAnya. Susunan basa sekuens menunjukkan EN 6 adalah jenis bakteri Bacillus sp. Hasil PCR menunjukkan satu pita kualitas bank bakteri Bacillus cereus, sedangkan isolat 5m. untuk gen isolat EN 10 dan EN 16 adalah jenis putih. Ukuran panjang bakteri antara 2- disekuensing bakteri Berdasarkan hasil kemiripan sekuens dengan warna ungu, dan memiliki banyak berbentuk spesies BLAST dari NCBI. termasuk bakteri gram positif, yang ditunjukkan endospora dengan tertentu, dengan menggunakan program pewarnaan tersebut isolat bank NCBI, untuk mencari kemiripan/ bahwa semua isolat sel bakteri berbentuk Berdasarkan ketiga sekuens DNA yang terdapat pada gen sel bakteri penghasil fitase menunjukkan basil/batang. dari tersebut kemudian dibandingkan dengan isolat EN 6 dan EN 16. Pengamatan DNA CF92 (no. akses HQ127622.1); B.cereus di (no. akses JQ993365.1); Bacillus sp. 1052 alignment untuk mendapatkan sekuens (no. akses JX566534.1); B. aryabhattai RW yang utuh dengan menggunakan program SM C dan B. cereus RW SM A (Wulandari Bioedit. Sekuens yang dihasilkan oleh 3 2011). Kumpulan sekuens tersebut di isolat yaitu: isolat EN 10 menghasilkan 40 EL-VIVO Vol.1, No.1, 2013 (hal 34 – 44), September 2013 ISSN: 2339-1901 http://jurnal.pasca.uns.ac.id sejajarkan dengan cara multiple sequen Fitase Bacillus alignment. Hasil identifikasi bakteri menunjukkan Kumpulan sekuens yang telah di bahwa ketiga isolat yang memiliki alignment kemudian dibuat konstruksi aktivitas fitase tertinggi adalah Bacillus pohon filogenetik untuk menunjukkan cereus EN 10, B. cereus EN 16, dan hubungan kekerabatan antara fitase yang Bacillus sp. EN 6. Ketiga bakteri tersebut dihasilkan dalam penelitian ini dengan memiliki genus yang sama yaitu Bacillus. fitase dari spsesies Bacillus yang lain Fitase yang berasal dari kelompok bakteri (Gambar 3). B. cereus EN 10 dan EN 16 Bacillus secara homologi memiliki kemiripan yang Alkalin β-Propeler. Alkaline ß-propeller besar dengan Bacillus sp 1052 (no. akses phytase (BPP) merupakan metalo enzim JX566534.1) dan B. cereus (no. akses dengan dua sisi pengikat kalsium yang JQ993365.1), berbeda (3 sisi pengikatan ion kalsium filogenetik dan juga berdasarkan memiliki pohon hubungan dengan merupakan afinitas kelompok tinggi dan fitase 3 sisi kekerabatan yang dekat pula. B. cereus pengikatan ion kalsium dengan afinitas EN 10 dan EN 16 memiliki hubungan rendah), kekerabatan yang dekat dengan B. cereus bedaan bentuk hidrolisis fitase. sehingga menyebabkan per- RW SM A yang juga merupakan bakteri Struktur fitase β-propeller terdiri dari penghasil fitase, dan ketiga bakteri dari lembaran β pada 6 bilah yang tersusun penelitian ini (B.cereus EN 10, B. cereus seperti EN 16, dan Bacillus sp EN 6) juga masih sempit dan sangat bermuatan negatif di memiliki kekerabatan yang dekat dengan bagian atas molekul enzim (Gambar 4). B. alimoliquefasciens AP-17 dan B. subtilis Setiap CF92, tetapi berkerabat jauh dengan B. propeller terdiri dari 4-5 strand β anti aryabhattai parallel. Strand keempat dari setiap bilah RW SM C yang juga merupakan bakteri penghasil fitase. baling-baling bilah dari dengan molekul belahan fitase β- dihubungkan dengan strand pertama dari bilah berikutnya yang bersilangan dengan ujung atas molekul enzim. Bilah keenam terletak sepanjang poros pusat propeller, merupakan sebuah saluran pusat yang terisi dengan molekul-molekul air yang terikat erat. Bilah keenam ini terdiri dari strain 1β dari akhir ujung-N dan strain 3β dari akhir ujung-C menggabungkan Gambar 3. Pohon filogenetik dari B. cereus EN dua molekul protein, ujung molekul 10, B. cereus EN 16, Bacillus sp. EN 6 dan enzim, dan menjaga stabilitas enzim. beberapa jenis Bacillus lain penghasil fitase. Strain β ekstra pada ujung-N dari molekul 41 EL-VIVO Vol.1, No.1, 2013 (hal 34 – 44), September 2013 ISSN: 2339-1901 http://jurnal.pasca.uns.ac.id protein menghubungkan bilah keenam jenis Bacillus menunjukkan bahwa fitase dan yang dihasilkan oleh Bacillus memiliki kelima, terhadap yang juga stabilitas berkontribusi enzim. Ini juga kisaran suhu optimum dan pH optimum disebut dengan struktur “jepitan ganda” yang luas, yaitu dengan suhu optimum bersama dengan 3 ion kalsium pada sisi antara 40-75ºC, dan pH optimum antara pengikat kalsium yang memiliki afinitas 4-8 (Tabel 1). tinggi, yang bertanggung jawab pada termostabilitas propeller tinggi Bacillus pada fitase Kelompok bakteri Bacillus merupakan β- mikroorganisme yang disebut amyloliquefaciens sebagai GRAS “generally recognized as DS11. Tiga pengikat ion kalsium yang safe” oleh American Food and Drug berafinitas rendah yang ditemukan untuk Administration karena mikroorganisme berkoordinasi di dalam sisi aktif TS-phy ini dari fitase B. amyloliquefaciens DS11, suplemen pangan yang aman (Hong et al., bersama dengan rantaian sisi di sekitar 2011). Fitase dari kelompok Bacillus ini asam amino, memiliki sebuah fungsi sangat katalis (Ha et al., 2000). suplemen pakan ternak karena memiliki digunakan cocok secara luas sebagai dimanfaatkan pada suhu optimum yang tinggi sehingga tidak mudah terdenaturasi selama proses pengolahan. Adanya penambahan fitase pada pakan ternak dapat meningkatkan kecernaan fosfat dan menurunkan polusi fosfat pada area sekitar peternakan. Tabel 1. Suhu optimum dan pH optimum dari beberapa spesies Bacillus. Suhu optimum 60ºC 60ºC 50ºC pH optimum 6 4 6 60ºC 6 50ºC 5 B. cereus RW SL 5 50ºC 5 Bacillus sp 55ºC 4,5 - 6 yang berbeda-beda, begitu pula dengan Bacillus sp KHU-10 60ºC 6–8 karakteristik enzim fitase. Fitase dari B. Amyloliquefaciens DS11 B. subtilis N-77 B. subtilis CF92 70ºC 7–8 60ºC 60ºC 6 – 6,5 7 B. subtilis HG 41ºC 6,5 - 7 B. subtilis AP-17 75ºC 6 Spesies Bacillus sp EN 6 Bacillus sp EN 10 Bacillus cereus EN 16 B.aryabhattai RW SM C B. cereus RW SM A Gambar 4. Skema struktur fitase β propeller (Ha et al., 2000) Setiap individu memiliki karakteristik kelompok Bacillus memiliki karakteristik suhu optimum dan pH optimum yang berbeda-beda. Dari data suhu optimum dan pH optimum fitase dari beberapa 42 Pustaka Penelitian ini Penelitian ini Penelitian ini Wulandari, 2011 Wulandari, 2011 Wulandari, 2011 Pandey et al., 2001 Choi et al., 2001 Kim et al., 1998 Shimizu, 1992 Hong et al., 2011 Yuanita et al., 2010 Kusumadjaja, 2009 EL-VIVO Vol.1, No.1, 2013 (hal 34 – 44), September 2013 KESIMPULAN Ha, N.C, Oh B.C, Shin S, Kim H.J, Oh T.K, et al. 2000. Crystal structures of a novel, thermostable phytase in partially and fully calcium-loaded states. Nat Struct Biol 7: 147-153. Hong, S.W, In H.C, Kun S.C. 2011. Purification and Biochemical Characterization of Thermostable Phytase from Newly Isolated Bacillus subtilis CF92. J. Korean Soc. Appl. Biol. Chem. 54 (1): 89-94. Irving, G.C.J and D.J. Cosgrove. 1972. Inositol Phosphate Phosphatases of Microbiological Origin: the Inositol Pentaphosphate Products of Aspergillus ficuum Phytases. J.Bacteriol 112 (1) : 434-438. Kerovuo, J. 2000. A novel phytase from Bacillus: Characterization and production of the enzyme, Ph.D dissertation, Univ. Helsinki, Finland Kim, O.H, Kim Y.O, Shim J.H, Jung Y.S, Jung W.J, Choi W.C, Lee H, Lee S.J, Auh J.H and Kim K.K. 2010. βPropeller phytase hydrolyzes insoluble Ca2+-phytate salts and completely abrogates the ability of phytate to chelate metal ions. J.Biochemistry 49: 10216–10217. Kusumadjaja, A.P. 2009. Skrening dan Karakterisasi Enzim Fitase Termofilik Hasil Isolasi dari Bakteri Kawah Ijen Banyuwangi. Laporan Hibah Penelitian Program Doktor Universitas Airlangga. Liu, J., D.R. Ledoux and T.L. Veum. 1997. In vitro procedure for predicting the enzymatic dephosphorylation of phytate in corn-soybean meal diets for growing swine. J. Agric. Food Chem. 45: 2612-2617 Marlinda, Y. 2001. Isolation and Purification of Raw Starch Degrading Enzyme from Acremonium endophytic Fungus and Its Aplication for Glucosa Production. Dissertation of Doctoral at University Putra Malaysia. Malaysia. Mullaney, E.J. and A.H.J. Ullah. 2003. The term phytase comprises several different classes of enzymes. Biochem Biophys Res Comm 312: 179-184. Isolat bakteri yang berasal dari air kawah Sikidang Dieng memiliki potensi sebagai sumber enzim Fitase, yaitu ISSN: 2339-1901 http://jurnal.pasca.uns.ac.id dari kelompok bakteri Bacillus. Jenis dari bakteri tersebut adalah Bacillus cereus EN 10, Bacillus cereus EN 16, dan Bacillus sp. EN 6. Karakterisasi bakteri penghasil enzim Fitase dari air kawah Sikidang Dieng yang memiliki 3 aktivitas Fitase terbesar yaitu: 1. Bacillus sp EN 10 dengan aktivitas sebesar 0,32893 U/ml, memiliki suhu optimum 60ºC, memiliki pH optimum 4, aktivitas Fitase dapat ditingkatkan dengan penambahan ion Ca2+ dan Mg2+, dan dihambat oleh ion Zn2+. 2. Bacillus cereus EN 16 dengan aktivitas sebesar 0,324953 U/ml, memiliki suhu optimum 50ºC, memiliki pH optimum 6, aktivitas Fitase dapat ditingkatkan dengan penambahan ion Ca2+ dan Mg2+, dan dihambat oleh ion Zn2+ dan Fe2+. 3. Bacillus sp EN 6 dengan aktivitas sebesar 0,32182 U/ml, memiliki suhu optimum 60ºC, memiliki pH optimum 6, aktivitas Fitase dapat ditingkatkan dengan penambahan ion Ca2+ dan Mg2+, dan dihambat oleh ion Zn2+ dan Fe2+. DAFTAR PUSTAKA Choi, Y.M, Hyung J.S, Jin M.K. 2001. Purification and Properties of Extracellular Phytase from Bacillus sp. KHU-10. Journal of Protein Chemistry 20 (4): 287-292. 43 EL-VIVO Vol.1, No.1, 2013 (hal 34 – 44), September 2013 Nelson, D.L. and M.M. Cox. 2000. Lehninger Prinsiples of Biochemistry. 3rd edition. Wort Pub: New York. Rosmimik, Widowati S. Andriani U, Indarwati S. Damardjati US. 1998. Skrining bakteri penghasil fitase dan pengujian aktivitasnya pada media PSM dan bekatul. Prosiding Temu Ilmiah Bioleknologi Pertanian. Bogor, 26 Mar 1998. hlm 43-48. Sajidan, A. farouk, R. Greiner, P. Jungblut, E.C. Muller, R. Borriss. 2004. Molecular and physiological characterization of a 3-phytase from soil bacterium Klebsiella sp ASR1. Appl Microbiol Biotechnol. 65 (1):110-118. Shimizu, M. 1992. Purification and characterization of phytase from Bacillus subtilis (natto) N-77. Biosci. Biotechnol. Biochem. 56, 1266-1269. Syahbirin G, Syatria A. Ambarsani L, Widowati S. 2000. Optimasi dan karakterisasi enzim fitase dan Bacillus coagulans. Di dalam: Mikrobiologi, Enzim, dan Bioleknologi dalam Perspekuf Ekonomi dan Industri. Prosiding Seminar Naslonal Industri dan Bioteknologi. Jakarta, 15-16 Feb 2000. hlm 361-369. Vieille, C., and G.J. Zeikus. 2001. Hyperthermophilic Enzymes: Sources, Uses, and Molecular Mechanisms for Thermostability. Microbio and Molecular Bio 64 (1): 143. Wulandari, R. 2011. Analisis Gen 16S rRNA pada Bakteri Penghasil Enzim Fitase. Tesis Universitas Sebelas Maret Surakarta. Yuanita, L., Aline P., Suzana S., Sri H., Farid A.A., dan Arif B. 2010. Isolasi, Pemurnian dan Karakterisasi Fitase Bacillus subtilis dari Holiwood Gresik. Berk. Penel. Hayati 15:113119. 44 ISSN: 2339-1901 http://jurnal.pasca.uns.ac.id
