Karakterisasi Fisiologi dan Identifikasi Molekuler

2
BAHAN DAN METODE
Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan mulai bulan
Februari 2008 sampai dengan bulan Juni 2008
di Laboratorium Mikrobiologi, Departemen
Biologi, FMIPA, IPB.
Bahan dan Alat
Isolat-isolat Bacillus sp. yang digunakan
ialah isolat LTC8, LTC13, LTW54, LTW4,
LTS36, dan LTS40 hasil penelitian
sebelumnya yang berhasil diisolasi dari
tambak udang di Lampung Tengah (Lestari
2008). Bakteri indikator yang digunakan
untuk menguji aktivitas antimikrob Bacillus
sp. ialah V. harveyi, E. coli, dan S. aureus
koleksi
Laboratorium
Mikrobiologi
Departemen Biologi, FMIPA, IPB.
Metode Penelitian
Pemurnian dan Peremajaan Isolat
Isolat dimurnikan dan diremajakan pada
media NA yang ditambahkan dengan NaCl
2% melalui metode kuadran dan diinkubasi
pada suhu ruang selama dua hari. Koloni
murni yang diperoleh ditumbuhkan kembali
pada media agar-agar miring NA dengan NaCl
2%.
Verifikasi Daya Hambat Isolat Bacillus sp.
terhadap Bakteri Indikator
Verifikasi daya hambat isolat Bacillus sp.
dilakukan dengan mengamati zona bening
yang terbentuk menggunakan metode cawan
sebar. Zona bening yang terbentuk diukur
pada tiga posisi lalu dirata-ratakan. Bakteri
indikator yang digunakan ialah V. harveyi, E.
coli, dan S.
aureus (Suparnika 2007).
Besarnya indeks penghambatan (IP) dihitung
dengan rumus:
IP =
diameter zona (mm) - diameter koloni (mm)
diameter koloni (mm)
Isolasi, Amplifikasi, dan Visualisasi DNA
Genom
Isolasi DNA genom dilakukan dengan
metode Lazo (Lazo et al. 1987). DNA genom
hasil isolasi digunakan untuk amplifikasi gen
16S rRNA. Amplifikasi gen 16S rRNA
dilakukan dengan mesin Polymerase Chain
Reaction (PCR) menggunakan kit Ready To
Go PCR Beads (Pharmacia-Biothec) dan
primer spesifik 16S rRNA untuk prokariot,
yaitu
63f
(5’CAGGCCTAACACATGCAAGTC)
dan
1387r
(5’-GGGCGGWGTGTACAAGGC)
(Marchesi et al. 1998).
Kondisi PCR yang digunakan meliputi
pradenaturasi (94oC, 2 menit), denaturasi
(92oC, 30 detik), Annealing primer (55oC, 30
detik), Elongation atau perpanjangan primer
(75oC, 1 menit), dan pascaPCR (75oC, 5
menit), dengan jumlah siklus sebanyak 30
kali.
Pemisahan DNA produk PCR dilakukan
pada
Elektroforesis
mini-gel
dengan
menggunakan agarose 1% pada tegangan
listrik 70-75 volt selama 45 menit. Ethidium
Bromida (EtBr) digunakan untuk mewarnai
DNA dan diamati di atas UV Transluminator.
Sekuensing DNA
DNA hasil amplifikasi lalu disekuen di
First Base Laboratories Sdn Bhd, Syah Alam,
Selangor, Malaysia untuk mengetahui urutan
basa DNA-nya. Hasil sekuen kemudian
dijajarkan dengan data GenBank menggunakan
program Blast-N dari situs NCBI (National
Center for Biotechnology Information) melalui
http://www.ncbi.nlm.nih.gov. untuk mengetahui
kemiripan spesies dari isolat yang diuji.
Analisis Filogenetik
Konstruksi pohon filogenetik dilakukan
dengan menggunakan program MEGA 4.0
(Tamura et al. 2007), metode Neighbor
Joining (NJ) dengan bootstrap 1000x.
HASIL
Uji Morfologi dan Fisiologi Isolat
Isolat-isolat Bacillus sp. yang telah murni
dan berumur kurang dari 24 jam dan ± 72 jam
secara berurutan diamati bentuk dan
morfologinya melalui pewarnaan Gram dan
spora (Hadioetomo 1993). Selanjutnya
dilakukan karakterisasi fisiologi dan biokimia
dengan menggunakan MicrogenTM GN-ID
A+B Panel dan uji pati secara manual.
Verifikasi Daya Hambat Isolat Bacillus sp.
terhadap Bakteri Indikator
Enam isolat Bacillus sp. penghasil
antimikrob dari penelitian sebelumnya di
verifikasi daya hambatnya terhadap V.
harveyi, E. coli, dan S. aureus dengan
menggunakan metode cawan sebar. Tahap ini
dilakukan untuk mengetahui bahwa isolat
yang digunakan ialah isolat Bacillus sp. yang
menghasilkan antimikrob. Keenam isolat