UJI KETAHANAN 48 GALUR PADI TERHADAP PENYAKIT BLAST

i
UJI KETAHANAN 48 GALUR PADI TERHADAP PENYAKIT BLAST
(Pyricularia oryzae) RAS 001
YULITA FITRIANNA
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2011
ii
ABSTRAK
YULITA FITRIANNA. Uji Ketahanan 48 Galur Padi terhadap Penyakit Blast (Pyricularia
oryzae) Ras 001. Dibimbing oleh UTUT WIDYASTUTI dan HAJRIAL ASWIDINNOOR.
Penyakit blas yang disebabkan oleh cendawan Pyricularia oryzae Cav. merupakan salah satu
penyakit utama yang menyerang padi di Indonesia. Penelitian ini bertujuan untuk menguji tingkat
ketahanan galur-galur padi terhadap serangan penyakit blas dan mengidentifikasi keberadaan gen
ketahanan Pi-ta pada galur padi yang tahan. Penelitian dilakukan dengan menggunakan padi
varietas Kencana bali (peka) dan Cisadane (tahan) sebagai kontrol serta 48 galur padi hasil seleksi
Program Pemuliaan di Departemen Agronomi dan Hortikultura IPB dengan metode injeksi
menggunakan P. oryzae ras 001. Padi berumur 16 hari setelah tanam diinokulasikan dengan 1 ml
suspensi spora (104-105 spora/ml) isolat P. Oryzae. Tanaman diinkubasi pada kondisi gelap lalu
dipindah ke ruang terang dan dilakukan pengamatan hingga 7-9 hari setelah infeksi. Pengujian
tahan blas dilakukan 2 tahap, yaitu penapisan I dilakukan sebanyak 3 ulangan dan penapisan II
dilakukan sebanyak 2 ulangan untuk masing-masing galur terpilih dari penapisan I, dengan 10
tanaman pada tiap ulangan. Pengamatan hingga penapisan II menunjukkan adanya 13 galur padi
tahan terhadap P. oryzae ras 001 yaitu IPB140-F-2-1, IPB115-F-4-2-2, IPB113-F-2-2, IPB107-F7-3, IPB140-F-5, IPB149-F-2, IPB149-F-8, Martapura, IPB149-F-4, IPB149-F-5, IPB113-F-1,
IPB102-F-92-1-1, IPB107-F-5-1 dengan persentase ketahanan ≥ 80 %. Dua pasang primer spesifik
untuk gen Pi-ta didesain dari sekuen DNA dengan nomor aksesi AF207842 untuk
mengamplifikasi fragmen DNA gen Pi-ta dengan metode PCR. Hasil identifikasi gen ketahanan
Pi-ta menunjukkan bahwa 13 galur tahan maupun 2 galur rentan (IPB107-F-18-4-2 dan IPB107-F16E-6) mempunyai gen Pi-ta, bahkan pada Kencana Bali. Percobaan sebelumnya, menunjukkan
bahwa Kencana Bali tidak memiliki gen ketahanan Pi-ta. Diduga bahwa varietas Kencana Bali
mengalami delesi di daerah bagian belakang ekson 2. Hasil identifikasi gen Pi-ta juga
mengindikasikan gen Pi-ta tidak spesifik berperan dalam mekanisme pertahanan tanaman pada
galur-galur padi ini, sehingga diduga ada gen lain yang berperan dalam proses ketahanan tanaman
padi terhadap serangan P. oryzae ras 001.
Kata kunci: Padi (Oryza sativa), blas, Pyricularia oryzae, resisten
ABSTRACT
YULITA FITRIANNA. Resistance Test toward of 48 Lines Rice to Blast Disease (Pyricularia
oryzae) Race 001. Supervised by UTUT WIDYASTUTI and HAJRIAL ASWIDINNOOR.
Blast disease, caused by Pyricularia oryzae Cav., is one of the major fungal diseases
infected rice (Oryza sativa L.) in Indonesia. The aim of this research was to examine the resistance
of rice from the infection of P. Oryzae race 001 and to detect the existance of Pi-ta gene in
resistant lines of rice. Resistance evaluation to blast disease (Pyricularia oryzae) on Cisadane
(resistant), Kencana Bali (susceptible) as control, and 48 lines of rice was carried out in the green
house by using injection inoculated method with P. oryzae race 001. Rice seedling were planted on
sterilize soil, and sixteen days old of rice were soaked in the fungal spore suspension (105 spores/
ml) in the dark for 24 hours, and moved to the light. Rice disease was observered on 7-9th days
after infection. There were 2 step screening of blast-resistant, which screening I performed a total
of three replicates and screening II performed from selected plant in screening I a total of two
replicates for each line of rice, with 10 plants in each replication. The result of second screening at
green house showed that 13 lines resistant to P. oryzae 001 were IPB140-F-2-1, IPB115-F-4-2-2,
IPB113-F-2-2, IPB107-F-7-3, IPB140-F-5, IPB149-F-2, IPB149-F-8, Martapura, IPB149-F-4,
IPB149-F-5, IPB113-F-1, IPB102-F-92-1-1, IPB107-F-5-1 with the percentage of resistance ≥ 80
%. Two pairs of DNA primers specific to the dominant indica Pi-ta gene were designed from
DNA sequence in gene bank with accession number AF207842 to amplify the Pi-ta DNA
fragments by polymerase chain reaction (PCR) method. The results revealed that all of 13 resistant
and 2 susceptible lines (IPB107-F-18-4-2 and IPB107-F-16E-6) of rice carrying Pi-ta genes, even in
Kencana Bali. The previous experiment shown that Kencana Bali does not have Pi-ta resistance
gene. It is expected that Kencana Bali has deletion of Pi-ta resistance gene in the end part of exon
2. Further more, those results also indicated that Pi-ta gene did not confer resistance to race 001 of
Pyricularia oryzae. Resistance to P. oryzae race 001 might be controlled by different resistant
gene.
Keyword : Padi (Oryza sativa), blas, Pyricularia oryzae, resistant
iii
UJI KETAHANAN 48 GALUR PADI TERHADAP PENYAKIT BLAST
(Pyricularia oryzae) RAS 001
YULITA FITRIANNA
Skripsi
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains pada Departemen Biologi
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2011
iv
Judul
Nama
NIM
: Uji Ketahanan 48 Galur Padi terhadap Penyakit Blast (Pyricularia
oryzae) Ras 001
: Yulita Fitrianna
: G34062968
Disetujui :
Pembimbing 1,
Pembimbing 2,
Dr. Ir. Utut Widyastuti, M.Si.
Dr. Ir. Hajrial Aswidinnoor, M.Sc.
NIP 19640517 198903 2001
NIP 19590929 198303 1008
Diketahui :
Ketua Departemen Biologi,
Dr. Ir. Ence Darmo Jaya Supena, M.Si.
NIP 19641002 198903 002
Tanggal lulus :
v
PRAKATA
Alhamdulillah, puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas rahmat, nikmat dan
inayah-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan karya ilmiah. Tema yang dipilih pada karya
ilmiah ini ialah mengenai penyakit pada tanaman padi, dengan judul Uji Ketahanan 48 Galur Padi
terhadap Penyakit Blast (Pyricularia oryzae) Ras 001. Karya ilmiah ini dilaksanakan pada bulan
Februari 2010 sampai Maret 2011.
Terima kasih penulis sampaikan kepada Ibu Dr. Ir.Utut Widyastuti, M.Si. dan Bapak Dr. Ir.
Hajrial Aswidinnoor, M.Sc. selaku pembimbing atas semua ilmu, kesabaran, bimbingan, nasihat
dan saran yang diberikan selama ini. Terima kasih kepada Dr. Ir. Miftahudin, M.Si. selaku penguji
atas setiap sarannya. Terima kasih kepada proyek I-MHERE atas nama Dr. Ir. Utut Widyastuti
Suharsono, M.Si. yang telah membiayai penelitian ini. Terima kasih kepada direktur dan staf
PPSHB atas fasilitas, sarana dan prasarana yang diberikan selama penulis melakukan penelitian.
Terima kasih kepada Ibu Anggiani Nasution dan Pak Santoso atas ilmu yang telah diberikan.
Terima kasih penulis ucapkan kepada bapak dan ibu di Depok atas semua dukungan, doa, cinta
dan kasih sayangnya. Terima kasih kepada saudari-saudariku, kak Dina Riski dan kak Windy
Hadiana, yang tak henti memberi semangat dan dukungan agar penelitian ini cepat terselesaikan.
Terima kasih kepada keluarga besar Bapak H. Natsir atas semua doa dan kasih sayangnya. Terima
kasih kepada teman-teman seperjuangan Biologi 43. Terima kasih kepada saudari-saudariku
Pondok Sugih crew (sugihers) atas kebersamaan, keceriaan, semangat dan doanya. Terima kasih
kepada rekan-rekan peneliti di Laboratorium Biorin dan Biologi Molekuler Seluler Tanaman
(Indah Khayati, Hayatul Fajri, Laila Nur Syafitri, Iin Premitasari, Pak Muzuni, Pak Yustinus
Ulung Anggraito, Pak Radite Tistama, Bu Saleha Hanum, Bu Ratna Yuniati, Mbak Ulfah
Mushofa, Kak Ika Atifah Zahroh, Kak Goto Giok, Kak Luria Marlina Limbong, Bu Dini Tasuruni,
Mbak Anita Theresia, Kak Nurul Fitriah, Kak Novita Andriany, Kak Medikca Tanjung, dan Kak
Muchdar Davis) atas kerjasama, semangat, saran, bantuan, canda, kasih sayang, rasa kekeluargaan
dan kebersamaan yang akan selalu terkenang di hati. Terima kasih kepada Pak Yulianto, Mbak
Pepi Elvavina, Pak Abdul Mulya, Pak Adi Supardi, Pak Yusman, Pak Itar Suherman dan Pak Edi
atas semua bantuan dan dukungannya.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Agustus 2011
Yulita Fitrianna
vi
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Jakarta pada tanggal 16 Mei 1988 sebagai anak ketiga dari tiga
bersaudara pasangan bapak Yusuf Hadi dan Ibu Rohana. Penulis menyelesaikan pendidikan dasar
di SDN Depok Baru 3 pada tahun 2000. Tahun 2003 penulis menyelesaikan pendidikan menengah
pertama di SLTP Negeri 2 Depok. Dan pada tahun 2006 penulis menyelesaikan pendidikan
sekolah menengah atas di SMA Negeri 1 Depok. Penulis diterima di Institut Pertanian Bogor di
tahun yang sama melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB (USMI).
Selama masa perkuliahan penulis menjadi asisten Biologi Cendawan (2009/2010), Ilmu
Lingkungan (2009/2010), Genetika Dasar (2009/2010), dan Pengantar Genetika Molekuler
(2010/2011). Penulis melaksanakan Praktek Lapang di PT. Sucofindo pada bulan Juli-Agustus
2009dengan judul Pengawasan Mutu Produk Air dan Makanan secara Mikrobiologis di PT
Sucofindo Cibitung.
vii
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL .........................................................................................................
viii
DAFTAR GAMBAR ....................................................................................................
viii
DAFTAR LAMPIRAN .................................................................................................
viii
PENDAHULUAN
Latar Belakang ......................................................................................................
Tujuan Penelitian ..................................................................................................
1
2
BAHAN DAN METODE
Waktu dan Tempat ................................................................................................
Bahan ....................................................................................................................
Metode ..................................................................................................................
2
2
2
HASIL
Morfologi dan Perkecambahan Spora ...................................................................
Kemampuan Infeksi Penyakit Blas pada Padi .......................................................
Identifikasi Keberadaan Gen Pi-ta .........................................................................
3
3
5
PEMBAHASAN
Penyakit Blas Daun pada Padi ...............................................................................
Identifikasi Keberadaan Gen Pi-ta .........................................................................
6
7
SIMPULAN .................................................................................................................
8
SARAN ........................................................................................................................
8
DAFTAR PUSTAKA ...................................................................................................
9
LAMPIRAN .................................................................................................................
11
viii
DAFTAR TABEL
Halaman
1 Primer spesifik gen Pi-ta ..........................................................................................
3
2 Hasil penapisan I 48 galur padi harapan terhadap isolat P. oryzae ras 001 ..............
5
3 Hasil penapisan II galur padi harapan tahan dari hasil penapisan I ……………..
5
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1 Perkecambahan spora P. grisea pada media kaca ....................................................
4
2 Bercak blas pada daun padi ......................................................................................
4
3 Hasil elektroforesis identifikasi gen Pi-ta ...............................................................
6
4 Daerah penempelan primer dan daerah dugaan delesi ..............................................
8
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1 Skala penyakit blas berdasarkan sistem evaluasi standar IRRI (1996) ....................
12
2 Data morfologi dan panen galur padi tahan ..............................................................
13
3 Gambar morfologi galur padi yang tahan .................................................................
15
1
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Tanaman padi (Oryza sativa L.) di
Indonesia banyak terserang oleh bermacammacam penyakit (Semangun 1991). Salah satu
penyakit yang sangat merugikan petani adalah
penyakit blas. Penyakit blas yang disebabkan
oleh cendawan Pyricularia oryzae Cav. masih
merupakan masalah utama pada padi gogo
(Rais et al. 2001). Penyakit blas sebelumnya
diketahui hanya menyerang padi gogo
(Semangun 1991), tetapi saat ini penyebaran
penyakit blas sudah mulai menyerang
pertanaman padi sawah (Amir et al. 2000).
Serangan penyakit blas di Indonesia
diperkirakan mencapai 19.629 hektar dari total
luas lahan pertanaman padi Indonesia sebesar
12.833.578 hektar pada tahun 2009 (BPS
2010). Kehilangan hasil pada varietas yang
peka seperti Bical dapat mencapai 50-90%
(Rais et al. 2001).
Secara umum P. oryzae menyerang
tanaman padi pada bagian daun, buku, leher,
malai, cabang malai, bulir padi, kulit gabah
(Chen 1993; Rais et al. 2001), dan collar daun
(Scardaci et al. 1997). Gejala serangan
penyakit blas mempunyai bentuk khas, gejala
daun yang terserang oleh blas daun (leaf blast)
berupa bercak berbentuk belah ketupat sampai
elips dengan kedua ujungnya runcing. Bagian
tengah bercak berwarna abu-abu atau putih
keabu-abuan, pada bagian tepi berwarna
coklat sampai coklat kemerahan dengan
ukuran panjang bercak 1-1.5 cm dan lebar 0.30.35 cm (Ou 1985; Scardaci et al. 1997).
Bentuk, warna, dan ukuran bercak dapat
beragam bergantung pada ketahanan varietas,
umur tanaman, dan umur lesio. Bercak tidak
akan berkembang dan tetap seperti titik kecil
pada varietas yang tahan dan bercak akan
berkembang sampai beberapa milimeter
berbentuk bulat atau elips dengan tepi
berwarna coklat pada varietas dengan reaksi
sedang (Ou 1985). Blas daun kadang-kadang
menyebabkan kematian keseluruhan pada
tanaman yang masih muda sampai stadia
pembentukan anakan atau tillering (Scardaci
et al. 1997).
Menurut Amir et al. (2000) ras 001, 003,
033, dan 173 merupakan ras yang ada pada
setiap musim tanam, artinya isolat ini
memiliki penyebaran yang luas. Isolat ras 001
mempunyai tingkat patogenesitas yang paling
rendah virulensinya, menyebar luas dan
mampu bertahan lama di lapangan (Sari 2008;
Utami 2000). Adapun penentuan ras baru dari
patogen blas di Indonesia dilakukan dengan
menggunakan varietas diferensial yaitu
Asahan, Cisokan, IR64, Krueng Aceh,
Cisadane, Cisanggang, dan Kencana Bali
(Mogi et al. 1991).
Studi genetika untuk mendapatkan gen
resisten terhadap penyakit blas telah banyak
dilakukan. Pada tanaman padi telah
diidentifikasi sekitar 40 gen mayor yang
mengendalikan ketahanan terhadap penyakit
blas dan 5 gen resisten, Pi-b, Pi-ta, Piz-5(Pi2), Piz-t, dan Pi9 telah berhasil diisolasi
(Wang et al. 1999; Qu et al. 2006; Zhou et al.
2006). Menurut Ou (1985), gen-gen ketahanan
tersebut (Pi) akan berinteraksi secara spesifik
dengan ras-ras tertentu dari cendawan
Pyricularia grisea.
Menurut Suwarno et al. (2001) sumber
gen Pi banyak terdapat pada gene pool padi
Indonesia baik yang berasal dari varietas
budidaya maupun spesies padi liar. Dua puluh
delapan genotip padi indica yang terdapat di
Indonesia telah dianalisis oleh Santoso (2005)
dan ditemukan bahwa banyak padi indica
yang mempunyai gen ketahanan baik Pi-b
maupun Pi-ta. Gen Pi-b dan Pi-ta merupakan
2 gen mayor resisten blas hasil introgresi dari
kultivar padi indica. Kedua gen resisten
tersebut mempunyai struktur gen yang mirip,
yaitu NBS (nucleotide binding site) dan LRR
(leucine rich repeat) dan di duga
menyandikan protein sitoplasmik yang
bertanggung jawab merespon gen avirulen
AVR-Pita, memicu resisten ras spesifik (Wang
et al. 1999; Bryan et al. 2000; Sari 2008).
Padi indica dapat menjadi sumber genetik
untuk gen resistensi yang nantinya akan dapat
digunakan untuk pengembangan varietas padi
tahan blas di Indonesia (Kurnianingsih 2008).
Penggunaan varietas tahan blas merupakan
salah satu cara yang praktis, efisien, ekonomis
dan ramah lingkungan untuk menanggulangi
penyakit blas (Reflinur 2005). Hasil penelitian
Utami et al. (2000) mengenai penyakit blas
memperlihatkan kendali genetik ketahanan
terhadap penyakit blas dapat berbeda-beda
tergantung varietas padi yang digunakan dan
jenis isolat uji yang dipakai. Oleh karenanya
penelitian mengenai tingkat ketahanan galurgalur padi terhadap serangan penyakit blas
(Pyricularia oryzae) diperlukan untuk lebih
mengetahui tingkat ketahanan tanaman padi,
dalam hal ini terutama kultivar padi indica.
Selain itu, isolasi maupun identifikasi dari gen
resistensi (R gene) Pi, terutama gen Pi-ta yang
merupakan gen mayor ketahanan blas,
dibutuhkan untuk keperluan pengembangan
varietas padi yang lebih tahan terhadap
penyakit blas pada waktu yang akan datang.
2
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk menguji
tingkat ketahanan galur-galur padi terhadap
serangan penyakit Blas (Pyricularia oryzae)
ras 001 dan mengidentifikasi keberadaan gen
ketahanan Pi-ta pada galur padi yang tahan.
BAHAN DAN METODE
Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan
Februari 2010 – Maret 2011, bertempat di
laboratorium BIORIN dan Rumah Kaca Pusat
Penelitian
Sumberdaya
Hayati
dan
Bioteknologi (PPSHB), Institut Pertanian
Bogor.
Bahan dan Alat
Bahan tanaman yang digunakan yaitu 48
galur padi hasil seleksi Program Pemuliaan di
Departemen Agronomi dan Hortikultura IPB,
varietas peka (Kencana Bali) dan varietas
tahan (Cisadane) sebagai kontrol, dan isolat
cendawan P. oryzae ras 001. Bahan kimia
yang digunakan yaitu media oatmeal, Potato
Dextrose Agar (setiap liter mengandung 39 g
PDA dan supaya lebih padat ditambah 5 g
agar), antibiotik kloramfenikol, aquades,
larutan Tween 0.025% (v/v), nitrogen cair,
buffer ekstrak 2% (w/v) (dengan komposisi
2% CTAB (w/v), 0.1 M Tris HCl pH 8.0, 1.5
M NaCl, 0.02 M EDTA), 2% β-mercapto
etanol, kloroform, isoamil alkohol, phenol, Na
acetat 3.2 M, alkohol absolut, RNAse 10
µg/µl, aquabides, gel agarosa konsentrasi 1%
(b/v), larutan TAE 1X, loading dye, dan
ethidium bromida 0.5 mg/L.
Alat yang digunakan yaitu autoklaf,
laminar, mikroskop, hemasitometer, magnetik
stirrer, mikropipet berbagai ukuran, sentrifuse
Jouan BR-4i, shaker, cawan petri, jarum ose,
mesin PCR, dan alat elektroforesis.
Metode penelitian
Uji Ketahanan Tanaman Padi
Penyiapan Tanaman Padi. Benih padi
dicuci kemudian dikecambahkan dalam cawan
petri yang berisi kertas merang selama kurang
lebih empat hari lalu ditanam ke media tanah.
Masing-masing galur ditanam sebanyak 10
benih dan dibuat sebanyak 3x ulangan.
Produksi Spora. Potongan miselium
isolat cendawan P. oryzae ras 001 asal padi
diinokulasikan pada media oatmeal (30 g oat/l,
20 g agar/l, 5 g sukrosa/l), dan diinkubasi
selama 10-14 hari pada suhu ruang, lalu kultur
dimaserasi atau dicuci secara aseptik untuk
menghilangkan hifa aerial. Kultur disinari nUV (300-400 nm) terus menerus selama
kurang lebih enam hari untuk menginduksi
pembentukan spora. Sebanyak 1-3 ml air steril
yang mengandung 0.025% (v/v) Tween 20
disiramkan pada permukaan koloni cendawan.
Permukaan koloni cendawan diusap-usap
dengan bantuan kaca objek steril untuk
melepaskan spora dari konidiofor. Spora-spora
dari isolat yang sama dipanen dan
dikumpulkan kemudian dilakukan pengukuran
kerapatan spora dengan hemasitometer hingga
diperoleh suspensi spora 104-105 spora/ml
(Chao & Ellingboe 1997).
Uji Ketahanan terhadap Infeksi. Benih
padi yang telah berkecambah ditanam pada
bak berukuran 25x35x15 cm yang diberi tray
berisi campuran tanah dan pupuk dengan
perbandingan 10 kg tanah, 2.5 gr urea, 1.5 gr
TSP, dan 1.2 gr KCl. Tanah yang digunakan
adalah tanah yang telah disterilkan. Masingmasing galur ditanam sebanyak 10 benih dan
dibuat sebanyak 3x ulangan. Selanjutnya, padi
berumur 16 hari setelah tanam (memiliki ±5
daun) diinokulasikan dengan 1 ml suspensi
spora (104-105 spora/ml) isolat P. Oryzae
melalui penyuntikan di bagian pelepah daun
kelima. Sebagai kontrol negatif, padi disuntik
menggunakan akuades (tidak diinfeksi).
Selanjutnya semua tanaman diinkubasi pada
kondisi gelap dan lembab selama 24 jam,
kemudian dipindahkan ke ruang terang selama
enam hari pada suhu 25-30˚C dan kelembaban
70-90 %. Pengamatan kemampuan infeksi
terhadap inang berupa kemunculan bercak
pada daun dilakukan setiap hari selama kurang
lebih 7-9 hari setelah infeksi. Tingkat
ketahanan diukur dengan menggunakan tabel
skala penyakit yang ditentukan oleh IRRI
(Lampiran 1). Uji ketahanan terhadap infeksi
dilakukan sebanyak 2 tahap penapisan
(Screening). Penapisan I dilakukan sebanyak 3
ulangan untuk masing-masing galur dengan 10
tanaman pada setiap ulangan. Setelah
didapatkan galur padi dengan nilai persentase
ketahanan terhadap blas ≥ 80% dilakukan
tahap penapisan II yang dilakukan sebanyak 2
ulangan untuk masing-masing galur dengan 10
tanaman pada setiap ulangan. Persentase akhir
ketahanan merupakan rata-rata persentase
ketahanan dari kedua ulangan. Persentase
ketahanan ≥ 80% digolongkan menjadi
tanaman resisten (tahan).
Identifikasi Keberadaan Gen Ketahanan
Pi-ta pada Galur Padi Tahan Blas
Isolasi DNA. Isolasi DNA dilakukan
berdasarkan metode Sambrook et al.(1989)
yang telah dimodifikasi. Daun muda
diekstraksi dengan nitrogen cair sebanyak 0.1
3
– 0.2 g lalu ditambahkan 600 µL buffer
ekstrak (dengan komposisi 2% Cetyl
Trimethyl Ammonium Bromide [CTAB] (w/v),
0.1 M Tris HCl pH 8.0, 1.5 M NaCl, 0.02 M
Ethylene Diamine Tetra acetic Acid [EDTA] ),
dan mercapto etanol 0,2%. Campuran
dikocok, diinkubasi selama 30 menit pada
suhu 650C. Campuran dalam tabung
eppendorf didinginkan di es selama 5 menit,
kemudian ditambahkan 600 µL kloroform :
isoamil alkohol (24:1). Tabung eppendorf
kemudian disentrifuse pada 10000 rpm (g = ±
9.8 m/s2) dengan suhu 40C, selama 10 menit.
Supernatan bagian atas (mengandung DNA)
diambil dan dipindahkan pada tabung
ependorf lain kemudian ditambahkan PCI
(Phenol, Chloroform, dan Isoamil alkohol)
dingin dengan perbandingan (25:24:1)
sebanyak 500 µL, disentrifuse kembali pada
10000 rpm (g = ± 9.8 m/s2) dengan suhu 40C
selama 5 menit. Supernatan diambil kemudian
ditambahkan 2M NaOAC pH 5,2 (0.1x
volume supernatan) dan EtOH 100% sebanyak
2x volume supernatan. Presipitasi dilakukan
selama 30 menit dalam freezer. Pelet diambil
dan dibilas dengan 500 µL etanol 70% lalu
disentrifuse 5 menit dengan kecepatan 10000
rpm (g = ± 9.8 m/s2). Cairan dibuang dan pelet
dikeringkan dengan vakum. Pelet dilarutkan
ke dalam 20-50 µL aquades steril, diberi
RNAse (10 µg/µl) sebanyak 0.2x volume
aquades steril selama 30 menit pada suhu
370C. Tahap terakhir yaitu inaktif RNAse
pada suhu 700C, selama 10 menit.
Uji Kualitas dan Kuantitas DNA. Uji
kualitas dan kuantitas DNA dilakukan
menurut metode Sambrook et al. (1989)
dengan beberapa modifikasi. DNA padi yang
berhasil diisolasi dielektroforesis pada gel
agarosa dengan konsentrasi 1% (b/v) dalam
buffer penyangga 1x TAE. Perbandingan
DNA dengan loading dye adalah 5:2 µL.
Elektroforesis dilakukan selama kurang lebih
30 menit pada tegangan 100 volt. Selanjutnya
gel agarose hasil elektroforesis dimasukkan ke
dalam larutan ethidium bromida (konsentrasi
larutan 0.5 mg/L) selama 5 menit. Panjang
pita DNA diamati dengan melihat pita DNA
pada UV transiluminator.
Identifikasi Gen Pi-ta. Amplifikasi DNA
guna mengidentifikasi gen ketahanan Pi-ta
dilakukan dengan bantuan Polymerase Chain
Reaction (PCR). Primer yang digunakan
adalah Pi-ta ekson 1 dan Pi-ta ekson 2. Primer
spesifik ini didesain dari sekuen DNA pada
database dengan nomor kode aksesi
AF207842. Primer spesifik Pi-ta ekson 1
digunakan untuk amplifikasi gen Pi-ta di
ekson 1 dengan ukuran produk PCR sebesar
418 bp. Sedangkan, primer spesifik Pi-ta
ekson 2 digunakan untuk amplifikasi gen Pi-ta
di ekson 2 dengan ukuran produk PCR sebesar
448 bp.
Tabel 1 Primer spesifik gen Pi-ta
forward
reverse
forward
reverse
Primer spesifik Pi-ta ekson 1
5’ACTGCTGGTGCCAAGAAGAT3’
5’GGCCATGCAGACGATAGAAT3’
Primer spesifik Pi-ta ekson 2
5’CCCAGGATGACCTTGACACT3’
5’TGTGCCAAATCTTCATCCAA3’
Reaksi PCR mengikuti metode yang
dilakukan Naqvi dan Chattoo (1996). PCR
dilakukan dengan total reaksi 10µl
mengandung 100 ng DNA genomik cetakan (1
µl), dNTPmix (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
0.2 mM (1 µl), masing-masing primer
(forward dan reverse) 1 pmol (masing-masing
sebanyak 0.4 µl), enzim taq DNA polymerase
1 unit (0.2 µl) dalam larutan buffer 1X (1 µl)
dan ditambahkan air bebas ion hingga
mencapai volume 10 µl. Amplifikasi PCR
dilakukan sebanyak 30 siklus. Program PCR
terdiri dari Pra-denaturasi pada suhu 940C
selama 5 menit, dilanjutkan dengan 30 siklus
yang terdiri atas denaturasi pada suhu 94 0C ,1
menit, annealing pada suhu 550C, 30 detik,
dan extension pada suhu 720C, 1 menit. Tahap
akhir proses PCR yaitu final extension pada
suhu 720C selama 5 menit dan pendinginan
pada suhu 720C selama 10 menit. Produk PCR
kemudian dipisahkan dengan elektroforesis
pada gel agarosa 1% dalam larutan buffer
penyangga 1x TAE. DNA 1 kb (ladder)
diletakkan di sumur pertama untuk mengukur
panjang pita-pita DNA yang dihasilkan.
Proses elektroforesis dilakukan selama 26
menit pada tegangan 100 volt. Kemudian
diletakkan dalam larutan ethidium bromida
(0.5 mg/L) selama 5 menit lalu dibilas dengan
aquades. Hasil pita DNA pada agarose
divisualisasi dengan cahaya UV. Ada tidaknya
gen Pi dapat diketahui dengan melihat pita
DNA yang terkait dengan fragment gen Pi
yang dapat diamplifikasi dengan primer
spesifik.
HASIL DAN PEMBAHASAN
HASIL
Morfologi dan Perkecambahan Spora
Penelitian ini menggunakan isolat
Pyricularia oryzae ras 001 yang berasal dari
koleksi Balai Penelitian Tanaman Padi Muara,
Bogor. Jumlah spora dari hasil panen spora
dihitung
menggunakan
hemasitometer.
4
Konsentrasi rata-rata spora yang dihasilkan
adalah 105 sampai 5.105 sel/ml suspensi. Hasil
pengamatan
spora
dengan
mikroskop
menunjukkkan bahwa spora P. oryzae
berbentuk menyerupai buah pir, memiliki 2
sekat, dan berwarna hialin (Gambar 1a). Guna
mengetahui kemampuan infeksi spora P.
oryzae yang diinokulasi pada tanaman padi
maka
dilakukan
juga
pengamatan
perkecambahan spora yang membentuk
apresorium. Pengamatan terhadap kemampuan
perkecambahan spora memperlihatkan bahwa
spora mulai berkecambah pada jam ke empat
setelah panen, selanjutnya terbentuk tabung
kecambah yang muncul dari bagian apikal
atau basal dari sel spora (Gambar 1b). Satu
spora dapat membentuk lebih dari satu tabung
kecambah. Tabung kecambah selanjutnya
membentuk struktur apresorium pada bagian
ujungnya. Apresorium berbentuk bulat dan
membentuk tabung infeksi yang berfungsi
sebagai struktur penetrasi ke tanaman inang
(Gambar 1c).
Kemampuan Infeksi Penyakit Blas Pada
Tanaman Padi
Varietas padi Kencana Bali merupakan
varietas peka yang digunakan sebagai kontrol
positif pada penelitian ini menunjukkan gejala
penyakit blas pada bagian daun. Bercak pada
varietas Kencana bali mulai tampak pada hari
ke empat setelah infeksi dan bercak bertambah
lebar setelah hari ke tujuh. Gejala blas daun
yang teramati yaitu berupa bercak berbentuk
elips dengan ujung runcing, tepi bercak
berwarna coklat tua hingga hitam dengan
sedikit warna kuning, bagian tengah berwarna
abu-abu (Gambar 2). Bercak hanya berupa
bintik-bintik hitam dan tidak terlihat melebar
pada tanaman tahan (resisten).
spora
tabung kecambah
Apresorium
spora
spora
20 µm
a
30 µm
b
c
tabung kecambah
10 µm
Gambar 1 (a) Spora P. grisea pada jam ke-0 setelah panen, perbesaran 10x40; (b) Spora mulai
berkecambah pada jam ke-4 setelah panen, perbesaran 10x10; (c) Apresorium pada jam
ke-20 setelah panen perbesaran 40x10.
Varietas/ Galur
Ketahanan
0 hsi
5 hsi
7 hsi
bercak
Kencana bali
Cisadane
140-5
0.5 cm
0.5 cm
0.5 cm
0.5 cm
0.5 cm
0.5 cm
0.5 cm
0.5 cm
0.5 cm
100%
100%
bercak
102-92-1-1
80%
0.5 cm
0.5 cm
Gambar 2 Serangan blas pada hari ke-0, ke-5 dan ke-7 setelah infeksi.
0.5 cm
5
Hasil penapisan I atau uji di rumah kaca
terhadap 48 galur padi menunjukkan bahwa
terdapat 15 galur padi yang resisten terhadap
serangan isolat Pyricularia oryzae ras 001
(Tabel 2). Tiga belas galur tanaman padi
resisten dipilih dari kelima belas galur tersebut
berdasarkan nilai tingkat ketahanan ≥ 80 %
kemudian
diverifikasi
kembali
untuk
memastikan tingkat ketahanannya.
Hasil verifikasi atau penapisan II
menunjukkan bahwa terdapat 13 galur padi
yang memiliki tingkat ketahanan ≥ 80%
berdasarkan munculnya bercak (lesio) pada
tanaman uji saat hari ke-7 setelah infeksi
(Tabel 3). Tiga belas galur yang memiliki
tingkat ketahanan ≥ 80% setelah verifikasi
kembali yaitu IPB140-F-2-1, IPB115-F-4-2-2,
IPB113-F-2-2, IPB107-F-7-3, IPB140-F-5,
IPB149-F-2, IPB149-F-8,
Martapura,
IPB149-F-4,
IPB149-F-5,
IPB113-F-1,
IPB102-F-92-1-1, dan IPB107-F-5-1. Ketiga
belas galur tersebut kemudian diambil dan
menjadi sampel isolasi DNA. Selain itu,
pengamatan terhadap morfologi galur padi
tahan juga dilakukan dengan mengamati satu
rumpun padi hingga tahap panen kemudian
dilakukan pengambilan gambar morfologi
tanaman padi (Lampiran 2 dan 3).
Identifikasi Keberadaan Gen Pi-ta
Tiga belas galur tahan dan dua galur
rentan diambil kemudian DNA tanaman
diisolasi. Hasil isolasi DNA dikuantifikasi dan
dilakukan pengujian kemurnian DNA dengan
spektrofotometer pada panjang gelombang
260 dan 280. Rasio OD260/OD280 yang
diperoleh berkisar antara 1.44 hingga 2.22.
Amplifikasi
PCR
dilakukan
dengan
menggunakan 2 primer yang didesain untuk
menguji keberadaan gen Pi-ta. Sekuen DNA
gen Pi-ta diketahui memiliki dua daerah ekson
yang mengapit satu daerah intron.
Tabel 2 Hasil penapisan I 48 galur padi terhadap isolat P. oryzae ras 001
Tetua
Nama Galur
TK (%)
Tetua
IPB6-d-10s-1-1
x Fatmawati
Fatmawati x
IPB6-d-10s-1-1
Fatmawati x
Siam Sapat
Pare Bau x
Fatmawati
Fatmawati x
Lambau
Fatmawati x
Pinjan
IPB97-F-13-1-1
IPB97-F-15-1-1
IPB97-F-20-2-1
IPB97-F-31-1-1
IPB97-F-44-2-1
IPB102-F-91-2-1
IPB102-F-92-1-1
IPB107-F-5-1
IPB107-F-7-3
IPB107-F-8-3-3
IPB107-F-16-5-1
IPB107-F-16E-1
IPB107-F-16E-6
IPB107-F-18-4-2
IPB113-F-1
IPB113-F-2-2
IPB115-F-3-2
IPB115-F-4-2-2
IPB115-F-6-1
IPB15-F-11
IPB115-F-16-2
IPB116-F-1-1-2
IPB116-F-3-1
IPB116-F-3-2
IPB116-F-4-9-3
77
57
44
63
47
36
83
80
100
40
27
70
32
35
93
90
75
97
16
32
40
67
48
43
56
Fatmawati x
Pinjan
Fatmawati x
Pulu Mandoti
(Fatmawati x
IPB26-d-14J-1-1-2)
x Sintanur
Sintanur x
Lambau
Nama Galur
TK (%)
IPB116-F-24-2
IPB116-F-42-2-1
IPB116-F-44-1
IPB116-F-46-1
IPB116-F-46-2
IPB116-F-46-2-PG
IPB116-F-50-1
IPB117-F-17-4
63
57
48
40
57
57
53
79
IPB140-F-1-1
IPB140-F-2-1
IPB140-F-3
IPB140-F-4
IPB140-F-5
IPB140-F-7
79
97
57
80
100
17
IPB149-F-1
IPB149-F-2
IPB149-F-3
IPB149-F-4
IPB149-F-5
IPB149-F-7
IPB149-F-8
Martapura
Margasari
60
90
57
100
90
82
100
90
77
Keterangan: TK= Tingkat Ketahanan
Tabel 3 Hasil penapisan II galur padi tahan dari hasil penapisan I terhadap isolat P. oryzae ras 001
No Nama Galur
TK (%)
No Nama Galur
TK (%)
No Nama Galur
1
IPB140-F-2-1
100
6
IPB149-F-2
85
11 IPB113-F-1
2
IPB115-F-4-2-2
95
7
IPB149-F-8
90
12 IPB102-F-92-1-1
3
IPB113-F-2-2
95
8
Martapura
100
13 IPB107-F-5-1
4
IPB107-F-7-3
95
9
IPB149-F-4
100
5
IPB140-F-5
95
10
IPB149-F-5
85
Keterangan: TK= Tingkat Ketahanan
TK (%)
100
90
95
6
M
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
A Kb Ni 12 13
14
15
(-)
418 bp
a.
M
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
A
Kb
Ni 12 13 14 15
(-)
448 bp
b.
Gambar 3 Hasil elektroforesis amplifikasi DNA gen Pi-ta (a) ekson 1 (b) ekson 2 (M) DNA ladder 1 kb (1)
IPB140-F-2-1 (2) IPB115-F-4-2-2 (3) IPB113-F-2-2 (4) IPB107-F-7-3 (5) IPB140-F-5 (6)
IPB149-F-2 (7) IPB149-F-8 (8) Martapura (9) IPB149-F-4 (10) IPB149-F-5 (11) IPB113-F-1 (A)
Asahan (Kb) Kencana bali* (Ni) Nipon bare (12) IPB102-F-92-1-1 (13) IPB107-F-5-1 (14)
IPB107-F-18-4-2* (15) IPB107-F-16E-6* (-) kontrol negatif/ ddH2O. keterangan: *rentan
(susceptible).
Pi-ta diduga menyandikan protein
sitoplasmik dengan lokasi sentral NBS dan
daerah pemotongan tinggi LRR (yang
selanjutnya disebut LRD) pada daerah
terminal carboxyl yang cocok mengenali gen
avirulence AVR-Pita, sehingga dapat
menggerakkan
resisten
ras
spesifik.
Substitusi asam amino tunggal, serine (Ser)
ke alananin (Ala) pada posisi 918, pada LRD
protein Pita mendemonstrasikan untuk
menetapkan secara langsung interaksi dengan
AVR-Pita dan spesifik resisten untuk patogen
blas yaitu Magnaporthe oryzae (Bryan et al.
2000).
Hasil elektroforesis dari amplifikasi
DNA dengan menggunakan primer Pi-ta
ekson 1 dan Pi-ta ekson 2 menunjukkan
adanya pita yang terbentuk dengan ukuran di
antara 400-500 bp. Pita yang terbentuk
berukuran sesuai dengan target yang
diinginkan, hal itu menandakan bahwa gen
Pi-ta yang menjadi target telah berhasil
teramplifikasi.
PEMBAHASAN
Penyakit Blas Daun pada Padi
Galur padi yang digunakan merupakan
galur hasil persilangan dari varietas dan galur
tetua terpilih. Varietas Sintanur, Pare bau,
Lambau, dan Pinjan termasuk dalam padi
aromatik yang banyak ditanam di Sulawesi
Selatan, sedangkan varietas Fatmawati
memiliki
keunggulan
karena
tingkat
kerontokan gabah rendah hingga mengurangi
kehilangan hasil pada saat panen (Masniawati
2005). Galur IPB6-d-10s-1-1 memiliki
keunggulan karena bulir padi yang dimiliki
terisi penuh dari pangkal hingga ujung malai
(Dr. Hajrial 20 Januari 2010, komunikasi
pribadi). Jika dilihat dari segi ketahanan
terhadap penyakit, varietas Sintanur dan
Fatmawati memiliki ketahanan terhadap
Hawar Bakteri Daun (HBD) strain III.
Sedangkan, informasi mengenai ketahanan
akan blas pada varietas tetua belum
diketahui, sehingga dilakukan pengujian
tahan blas.
Penyakit blas disebabkan oleh cendawan
Pyricularia oryzae, cendawan ini termasuk
dalam kelompok Ascomycetes dan ditemukan
di alam dalam bentuk aseksualnya saja.
Sedangkan bentuk seksualnya (teleomorf)
Magnaporthe grisea (Hebert) Barr hanya
dihasilkan
dengan
pengkulturan
di
laboratorium (Agrios 1997). Pyricularia
oryzae mempunyai konidiofor bersekat-sekat
jarang
bercabang,
berwarna
kelabu,
membentuk konidium pada ujungnya,
konidium berbentuk bulat telur dengan ujung
runcing, jika masak bersekat 2, dengan
ukuran 20-22 x 10-12 µm.
Gejala blas daun diamati pada daun
berupa bercak berbentuk belah ketupat
berujung runcing. Bentuk warna dan ukuran
lesio atau bercak bervariasi tergantung pada
ketahanan varietas, umur tanaman dan
lingkungan. Bercak pada varietas yang tidak
tahan (rentan) pada kondisi yang lembab
memperlihatkan pinggiran coklat dengan
sedikit berwarna kuning (halo), sedangkan
pada varietas yang tahan bercak hanya berupa
bintik coklat sebesar jarum atau lebih (Ou
1985). Selain itu, dilihat dari waktu
kemunculan bercak, bercak pada varietas
yang peka lebih cepat timbul, dibandingkan
dengan varietas yang resisten.
Kemampuan
infeksi
cendawan
dipengaruhi haplotype suatu cendawan.
Keragaman haplotip P. oryzae antara lain
dipengaruhi oleh faktor lingkungan seperti
suhu, kelembaban, baik pada lokasi yang
sama maupun berbeda (Reflinur 2005). Suhu
yang digunakan pada penelitian ini berkisar
antara 26oC-30oC, dengan kelembapan
berkisar antara 75 sampai 90%. Hal ini
menunjukkan kondisi lingkungan yang
7
mendukung bagi perkembangan penyakit.
blas. Spora dihasilkan dan dilepaskan pada
kondisi kelembaban yang relatif tinggi, dan
tidak ada spora yang dihasilkan pada kondisi
kelembaban di bawah 89% (Bonman 1992).
Sporulasi berlangsung secara optimum pada
suhu 28°C dengan kelembaban 95% dan
dalam kondisi gelap selama 15 jam (Kato
1976), sedangkan temperatur optimum untuk
perkecambahan spora, pembentukan lesio
dan sporulasi adalah 77-82°C (32-35°C)
(Scardaci et al. 1997).
Hasil percobaan menunjukkan bahwa
gejala penyakit blas pada tanaman rentan
mulai muncul pada hari ke-3 dan ke-4 setelah
inokulasi. Hal ini sesuai dengan Leung dan
Shi (1994) yang menyatakan kelembaban
yang tinggi pada tanaman yang rentan akan
menyebabkan
cendawan
P.
oryzae
menghasilkan konidia dalam waktu 3-4 hari.
Sementara, menurut Ou (1985) periode laten
penyakit blas di daerah tropis adalah empat
sampai lima hari setelah inokulasi. Bercak
secara cepat berkembang menjadi lebih besar
pada
suhu
32°C
dan
sesudahnya
perkembangan bercak akan menurun.
Reaksi tanaman padi terhadap penyakit
blas dibagi menjadi tiga yaitu tahan
(completely resistant), moderat (partially
resistant) dan peka (susceptible). Kencana
Bali dan Cisadane digunakan sebagai varietas
peka dan tahan mengacu pada Santoso
(2005) yang membuktikan bahwa varietas
Cisadane merupakan varietas tahan blas, dan
varietas Kencana Bali merupakan varietas
yang peka dengan intensitas serangan
tertinggi di Indonesia (Mogi et al. 1991;
Nugraha 2005).
Faktor-faktor
yang
mempengaruhi
ketahanan atau kerentanan suatu varietas padi
terhadap cendawan P. oryzae adalah adanya
gen ketahanan pada tanaman inang, tingkat
virulensi cendawan P. oryzae dan lingkungan
(Ou 1985). Varietas Cisadane dan tiga belas
galur tahan memperlihatkan gejala adanya
blas dengan tingkat serangan yang rendah
dan sangat rendah. Hal tersebut diduga
karena galur tahan tersebut memiliki
kemampuan untuk membatasi penetrasi
apresorium blas dan mematikan patogen blas.
Deposisi senyawa silikat yang berada dalam
jaringan epidermis daun varietas tahan dapat
melindungi invasi hifa cendawan secara
mekanis (Takahashi 1997; Kim et al. 2002).
Selain itu, varietas padi yang tahan juga
cenderung menghambat pembentukan spora
blas dengan memproduksi
fitoaleksin
tertentu sebagai akibat interaksi antar patogen
dan tanaman padi (Dillon et al. 1997;
Rodrigues et al. 2004). Hal ini dapat pula
disebabkan adanya reaksi hipersensitif yang
cepat dari tanaman inang sehingga patogen
tidak berkembang.
Osburn (1996) menyatakan bahwa
sistem pertahanan tanaman terhadap serangan
pathogen terdiri dari pertahanan pasif dan
pertahanan aktif. Mekanisme pertahanan
pasif diantaranya adalah kultikula yang
berlilin dan senyawa antimikroba yang
bertujuan mencegah terjadinya kolonisasi
jaringan oleh cendawan. Sedangkan, aktifnya
mekanisme seluler yang terinduksi karena
elisitor yang dikeluarkan oleh pathogen
merupakan
sistem
pertahanan
aktif,
diantaranya adalah terjadi akumulasi
metabolit sekunder antimikroba dan ekspresi
protein pathogenesis related (Kim et al.
2000).
Hasil pengamatan menunjukkan bahwa
kebanyakan daun padi yang terserang adalah
daun bagian atas atau daun yang masih muda.
Menurut Ou (1985) kerentanan daun padi
terhadap infeksi patogen berhubungan
dengan kandungan silikat pada dinding sel
epidermis daun padi. Sel-sel daun muda
mempunyai kandungan silikat yang masih
rendah sehingga apresorium dapat menembus
dinding sel epidermis daun padi muda.
Isolat yang digunakan dalam penelitian
ini adalah isolat P. oryzae ras 001, yang
berasal dari koleksi Balai Penelitian Tanaman
Padi Muara Bogor. Utami et al. (2000), Amir
dan Nasution (2001) dan Utami et al. (2005)
menyatakan bahwa isolat 001 adalah isolat
yang selalu dijumpai pada setiap musim
tanam artinya isolat ini memiliki penyebaran
yang luas dan mampu bertahan lama di
lapangan. Oleh sebab itu isolat ini selalu
dipakai sebagai dasar dalam analisis rata-rata
generasi. Ras 001 mempunyai tingkat
patogenesitas
yang
paling
rendah
virulensinya dibandingkan ras lain (Sari
2008).
Identifikasi Keberadaan Gen Pi-ta
Konsep munculnya penyakit dan
interaksinya dengan inang dapat dijelaskan
berdasarkan konsep gene for gene (Flor
1971), pengenalan patogen oleh tanaman
yang tahan dikontrol oleh gen resistensi (R
gene) yang ada pada tanaman dan gen
avirulen (Avr gene) yang ada pada patogen
dan selanjutnya mengaktifkan sistem
pertahanan (defense response) (Suharsono et
al. 2002). Interaksi antara inang dan patogen
dijabarkan dalam konsep gene for gene,
8
dimana terdapat dua bentuk interaksi, yaitu
reaksi inkompatibel dan kompatibel. Interaksi
inkompatibel adalah interaksi antara gen
resisten (R gene) pada tanaman inang dengan
gen avirulen (Avr) pada patogen yang
selanjutnya
menyebabkan
terbentuknya
reaksi hipersensitif (HR) pada tanaman inang
(Agrios
1997).
Sedangkan
interaksi
kompatibel adalah interaksi antara tanaman
inang yang rentan dengan patogen yang
virulen hingga menyebabkan timbulnya
penyakit (Kurnianingsih 2008). Galur padi
resisten dengan tingkat ketahanan 100 %
yaitu IPB107-F-7-3, IPB140-F-5, IPB149-F4 dan IPB149-F-8 tidak memperlihatkan
gejala blas sampai akhir pengamatan (9 hsi),
hal ini mengindikasikan adanya reaksi
hipersensitif pada tanaman padi tersebut.
Oleh karenanya dapat dikatakan pada
keempat galur tersebut terdapat interaksi
inkompatibel yaitu interaksi antara R gene
pada padi terhadap gen Avirulen (Avr) pada
Pyricularia oryzae ras 001.
Perbedaan respon ketahanan dari 48
galur padi yang digunakan diduga disebabkan
karena perbedaan genotipe dari varietas
tersebut, yaitu adanya perbedaan gen
resistensi (gen Pi) yang dimiliki oleh masingmasing galur. Galur yang memiliki ketahanan
hingga 100% menunjukkan bahwa tidak ada
satupun tanaman yang diinfeksi yang
memperlihatkan gejala penyakit blas.
Pemilihan 13 galur resisten (tahan)
dikarenakan dugaan bahwa galur padi dengan
tingkat ketahanan ≥ 80% berpotensi
membawa gen ketahanan Pi. Gen Pi-ta
diduga menyandikan protein sitoplasmik
dengan lokasi sentral NBS dan daerah
pemotongan tinggi LRR pada daerah terminal
karboksil yang cocok mengenali gen avirulen
(AVR-Pita), sehingga dapat menggerakkan
resisten ras spesifik (Bryan et al. 2000).
Hasil elektroforesis dari hasil PCR
menunjukkan adanya gen Pi-ta yang
teramplifikasi baik dari DNA tanaman yang
tahan (resistence) maupun tanaman rentan
(susceptible) seperti varietas Kencana Bali,
galur IPB107-F-18-4-2 dan IPB107-F-16E-6
(Gambar 3). Hasil ini berbeda dengan
Santoso (2005), hal ini di duga karena
perbedaan primer yang digunakan. Primer
yang digunakan pada penelitian ini
mengamplifikasi daerah gen Pi-ta pada
daerah ekson 1 di urutan basa ke- 2772-3189
(F1 menempel pada urutan basa ke- 27712790; R1 menempel pada urutan basa ke3169 – 3188) dan daerah ekson 2 di urutan
basa ke- 6089-6536 (F2 menempel pada
urutan basa ke- 6089-6108; R2 menempel
pada urutan basa ke- 6517-6536), sedangkan
primer Santoso (2005) mengamplifikasi
daerah gen Pi-ta di urutan basa ke- 62576660. Primer Santoso (2005) memiliki primer
forward yang menempel pada urutan basa
ke-6257–6276 dan primer reverse yang
menempel pada urutan basa ke- 6640 – 6660
dengan hasil amplifikasi sebesar 404 bp
(Gambar 4).
404 bp
Gambar 4 Daerah penempelan primer.
Daerah dugaan delesi pada
bagian belakang ekson 2.
Sehingga, diduga adanya kemungkinan
delesi pada daerah ekson 2 di bagian
belakang pada Kencana Bali, hingga primer
Santoso tidak dapat mengamplifikasi gen Pita dari tanaman Kencana Bali. Sementara,
menurut Bustamam et al. (2004) Kencana
Bali diduga mempunyai gen ketahanan
terhadap penyakit blas namun isolat blas
yang tidak kompatibel (avirulen) untuk
varietas ini belum diketahui. Hasil ini
menunjukkan kemungkinan gen Pi-ta tidak
spesifik
berperan
dalam
mekanisme
pertahanan tanaman pada galur-galur padi ini,
sehingga diduga ada gen lain yang berperan
dalam proses ketahanan tanaman padi
terhadap serangan P. oryzae ras 001.
SIMPULAN
Tiga belas galur padi tahan blas
didapatkan dari hasil penapisan 48 galur padi
harapan yang diuji terhadap ras 001.
Kemunculan gen Pi-ta dijumpai baik pada
galur padi yang tahan maupun peka terhadap
P.oryzae ras 001, sehingga disimpulkan gen
Pi-ta tidak bertanggung jawab atas
ketahanan terhadap P.oryzae ras 001.
SARAN
Perlu adanya pengujian dengan desain
primer yang lain untuk kelanjutan identifikasi
gen Pi-ta guna mengetahui kemungkinan
adanya delesi yang terdapat pada sekuens
atau urutan basa bagian belakang ekson 2 di
gen Pi-ta tanaman Kencana Bali.
9
DAFTAR PUSTAKA
Agrios GN. 1997. Plant Pathology.
Academic Press. A Harcourt Science
and Technology Company. hlm 286.
Amir M, Nasution A, Santoso. 2000.
Inventarisasi ras P. grisea didaerah
Sukabumi Jawa Barat musim tanam
1995-1998. Prosiding Kongres Nasional
XV. PFI, Purwokerto. hal.148-151.
Amir M, Nasution A. 2001. Identification of
Major Genes for Blast Resistance.
Current Status and Future Direction.
Bogor: Central Research Institute for
Food Crops, Agency for Agriculture
Research and Development.
[BPS] Badan Pusat Statistik. 2010. Informasi
Data Luas Panen, Produksi Tanaman
Padi Seluruh Provinsi Jakarta.
Bonman JM. 1992. Durable resistance to rice
blast disease-environmental influences.
Euphytica 63: 115-123.
Bryan GT, Wu KS, Farrall L, Jia Y, Hershey
HP, McAdams SA, Faulk KN,
Donaldson GK, Tarchini R, and Valent
B. 2000. A single amino acid
differences distinguishes resistant and
susceptible alleles of the rice blast
resistance gene Pi-ta. The Plant Cell
12: 2033-2045.
Bustamam M, Reflinur, Agisimanto D,
Suyono. 2004.Variasi genetik padi
tahan blas berdasarkan sidik jari DNA
dengan markah gen analog resisten. J
Biotek Pertanian 9: 56-61.
Chen D. 1993. Population structure of
Pyricularia grisea (Cooke) Sacc. in two
screening
site
quantitive
characterization of mayor and minor
resistance genes [thesis doctor]. Los
Banos: University of Philippines.
Dillon VM, Overton J, Grayer RJ, Harborne
JB. 1997. Differences in phytoalexin
response among rice cultivars of
different resistance to blast. Phytochem
44: 599-603.
Flor HH. 1971. Curent status of the gene-forgene concept. Annu Rev Phytopathol 9:
275-296.
Kato H. 1976. Some topics in a disease cycle
of rice blast and climatic factors.
Proceeding of the symposium on
climate and rice. Los Banos,
Philippines. p.417-425
Kim S, Ahn IP, Park CH, Park SG, Park SY,
Jwa NS, and Lee YH. 2000. Molecular
characterization of the cDNA encoding
an acidic isoform of PR-1 Protein in
Rice. Mol Cells 11: 115-121.
Kim SG, Kim KW, Park EW, Choi D. 2002.
Silicon-induced cell wall fortification of
rice leaves: A possible celluler
mechanism of enhanced host resistance
to blast. Phytopathology 92: 1095-1103.
Kurnianingsih R. 2008. Ekspresi gen PR1
dan PBZ1 yang terlibat dalam sistem
toleransi tanaman padi terhadap
penyakit blas (isolat 173) [tesis]. Bogor:
Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor.
Leung H, Shi Z. 1994. Genetic regulation of
sporulation in the rice blast fungus. Di
dalam : Zeigler RS, Leong SA, Teng
PS, editor. Rice blast disease. Manila
Philippines : CAB International-IRRI.
hlm 65-68.
Masniawati. 2005. Karakterisasi molekuler
dan analisis stabilitas sifat aromatik
plasma nutfah padi aromatik Sulawesi
Selatan. [laporan penelitian]. Makasar :
Pascasarjana, Universitas Hasanudin.
Mogi S, Wibowo BS. 1991. Establishment of
the Differential Variety Series for
Pathogenic Race Identification of Rice
Blast Fungus and the Distribution of
Race Based on the New Differential in
Indonesia. Jatisari-Indonesia : Rice
Disease Study Group Karawang. 30
hlm.
Naqvi Ni, Chatto BB. 1996. Development of
sequences characterized amplified
region (SCAR) based indirect selection
method for a dominant blast resistences
in rice. Genome 39:26-30.
Nugraha MFI. 2005. Identifikasi genotipe
padi yang memiliki gen-gen ketahanan
terhadap penyakit blas [tesis]. Bogor :
Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor.
54 hlm.
Ou SH. 1985. Rice Disease. Ed ke-2.
England Commonwealth Mycological
Institut, CAB. Hal. 101.
Osbourn AE. 1996. Preformed antimicrobial
compounds and plant defense against
fungal attack. Plant Cell 8: 1821-1831.
Qu S, Liu G, Zhou B, Bellizzi M, Zeng L,
Dai L, Han B, and Wang GL. 2006. The
broad spectrum blast resistance gene
Pi9 encodes a nucleotide-binding siteleucine-rich repeat protein and is a
member of a multigene family in rice.
Genetics 172: 1901-1914.
Rais SA, Silitonga TS, Budiarti SG, dan
Nasution A. 2001. Evaluasi Ketahanan
Plasma Nutfah Padi dan Jagung
Terhadap Penyakit. Di dalam : Balai
10
Penelitian
Bioteknologi
dan
Sumberdaya Genetik Pertanian Pusat
Penelitian dan Pengembangan Tanaman
Pangan, editor. Prosiding Seminar
Hasil
Penelitian
Rintisan
dan
Bioteknologi Tanaman; Bogor, 26-27
Desember 2001. Bogor: BPP Press.
Hlm 52-62.
Reflinur. 2005. Keragaman genetik cendawan
Pyricularia grisea berdasarkan primer
spesifik gen virulensi dan interaksinya
terhadap gen ketahanan padi [tesis].
Bogor : Pascasarjana, Institut Pertanian
Bogor. 42 hlm.
Rodrigues FA, McNally DJ, Datnoff LE,
Jones JB. 2004. Silicon enhances the
accumulation
of
diterpenoid
phytoalexins in rice: a potential
mechanism
for
blast
resitance.
Phytopath 94: 177-183.
Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. 1989.
Molecular cloning a laboratory manual
(2nd ed.). USA : Cold Spring Harbor
Laboratory Press. 1567 hlm.
Santoso. 2005. Analisis ketahanan 28
genotipe padi terhadap penyakit blas
daun dan
hubungannya
dengan
keberadaan gen Pi-b dan Pi-ta1 [Tesis].
Bogor : Pascasarjana, Institut Pertanian
Bogor.
Sari L. 2008. Ekspresi gen penyandi
pathogenesis
related
protein
(PR1&PBZ1) pada padi indica yang
terlibat dalam sistem toleransi terhadap
penyakit blas isolat 001 [tesis]. Bogor:
Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian
Bogor.
Scardaci SC, Webster RK, Greer CA, Hill JE,
Williams JF, Mutters RG, Brandon
DM, McKenzie KS, and Oster JJ. 1997.
Rice blast: a new disease in California.
Agronomy Fact Sheet Series. Davis:
University of California.
Semangun H. 1991. Penyakit-penyakit
Tanaman Pangan di Indonesia.
Yogyakarta: Gadjah Mada University
Press.
Suharsono U, Fujisawa Y, Kawasaki T,
Iwasaki Y, Satoh H, and Shimamoto K.
2002. The heterotrimeric G protein α
subunit acts upstream of the small
GTPase Rac in disease resistance of
rice. Proc Natl Acad Sci USA 99(20):
13307-13312.
Suwarno, Lubis E, Soenarjo E. 2001.
Breeding of upland rice in Indonesia. Di
dalam: Kardin MK, Prasaja I, Syam M,
editor. Upland Rice Research in
Indonesia. Bogor: Central Research
Institute for Food Crops, Agency for
Agricultural
Research
and
Development. hlm. 1-6.
Takahashi E. 1997. Uptake mode and
physiological functions of silica. Di
dalam: Tanane M, Yuzo M, Fumio K,
Hikoyuki Y, editor. Science of Rice
Plant Physiology Volume 2. Tokyo:
Food and Agriculture Policy Research
Center. hlm: 420-433.
Utami DW. 2000. Evaluasi sifat ketahanan
terhadap tiga ras uji penyakit blas
(Pyricularia grisea) pada spesies padi
liar Oryza rufipogon dan populasi
tanaman BC2F3 turunannya [tesis].
Bogor: Pascasarjana, Institut Pertanian
Bogor.
Utami DW, Amir M, Moeljopawiro S. 2000.
Analisis RFLP kelompok ras dan
haplotipe isolat blas dengan DNA
pelacak MGR586. Biotek Pertanian 5:
28-33.
Utami DW, Moeljopawiro S, Aswidinnoor H,
Setiawan A, dan Hanarida I. 2005. Gen
Pengendali Sifat Ketahanan Penyakit
Blas (Pyricularia grisea Sacc.) pada
Spesies Padi Liar Oryza rufipogon
Griff. dan Padi Budi Daya IR64.
AgroBiogen 1(1):1-6.
Wang ZX, Yano M, Yamanouchi
U,
Iwamoto M, Monna L, Hayasaka H,
Katayose Y, and Sasaki T. 1999. The
Pib gene for rice blast resistance
belongs to the nucleotide binding and
leucine-rich repeat class of plant disease
resistance genes. Plant J 19:55-64.
Zhou B, Qu S, Liu G, Dolan M, Sakai H, Lu
G, Bellizzi M, and Wang GL. 2006.
The Eight Amino-Acid Differences
Within Three Leucine Rich Repeats
Between Pi2 and Piz-t Resistance
Proteins Determine the Resistance
Specificity to Magnaporthe grisea. Mol
Plant Microbe Interact Vol. 19 : 11 pp.
1216–1228.
11
LAMPIRAN
12
Lampiran 1 Skala penyakit blas berdasarkan sistem evaluasi standar IRRI (1996)
Skala
Gejala
0
Tidak ada bercak
1
Bercak kecil berukuran sebesar ujung jarum/lebih besar dan berwarna
coklat, tidak ada pusat sporulasi
2
Bercak abu-abu berbentuk bundar agak lonjong diameter 1-2 mm,tepi
warna coklat, pada daun bawah
3
Sama dengan skala 2, pada daun atas
4
Bercak khas blas ukuran 3 mm/lebih panjang, luas daun terinfeksi < 4%
5
Bercak khas blas, luas daun terinfeksi 4-10%
6
Bercak khas blas, luas daun terinfeksi 11-25%
7
Bercak khas blas, luas daun terinfeksi 26-50%
8
Bercak khas blas, luas daun terinfeksi 51-75%, banyak daun yang mati
9
Lebih dari 75% luas daun terserang
Keterangan : 0-2 = Resisten (R), 3 = Moderat Resisten (MR), 4-6 = Moderat Sensitif (MS),
7-9=Sensitif (S)
13
Lampiran 2 Data morfologi dan panen galur padi tahan
Tabel 1 Karakterisasi morfologi galur padi harapan yang tahan
No
1
Nama Galur
IPB107-F-5-1
Tanggal tanam/keluar
bunga
13/11/2010 -24/02/2011
UB
TT
103 hst
101
DB
PDB
33
LDB
BGB
2
*
BGK
*
Brt 1000 butir
PM
23,00 **
24,5
rata-rata
PM
Σ
anakan
Umur panen
8
157 hst
19/04/2011
12
157 hst
24/03/2011
11
135 hst
28/03/2011
9
127 hst
24/03/2011
5
135 hst
28/03/2011
2
131 hst
24/03/2011
3
156 hst
19/04/2011
4
142 hst
24/03/2011
20,5
21,5
2
IPB107-F-7-3
13/11/2010-24/02/2011
103 hst
106
0,71
34
2,2
25,77
20,11
17,85
22,17
28,2
26
3
IPB113-F-1
13/11/2010-23/02/2011
102 hst
106
0,46
29
2,7
4
IPB113-F-2-2
13/11/2010-17/02/2011
96 hst
137
0,92
54
3
25,8
26,67
*
*
15,76
24,06
*
18,25
15,76
28,16
33
31,5
30
5
IPB115-F-4-2-2
13/11/2010-19/02/2011
98 hst
87
0,61
32,5
2
*
6,59
24,86
31,5
24
24,5
25
6
IPB140-F-2-1
13/11/2010-01/03/2011
107 hst
117
0,82
41,5
2,4
11,15
7,68
23,07
24,5
20,5
26
26,5
7
IPB140-F-5
13/11/2010-18/03/2011
124 hst
112
0,64
31
1,8
*
*
18,52
24,33
25
26,8
25,1
8
IPB-149-F-2
04/11/2010-13/02/2011
101 hst
*
0,61
37
2,6
17,12
15,53
29,24
26
25,6
23,7
25,63
25,1
13
14
9
IPB149-F-4
13/11/2010-01/03/2011
107 hst
121
0,81
38
3,2
19,47
16,44
29,66
31
3
131 hst
24/03/2011
2
157 hst
19/04/2011
12
141 hst
24/03/2011
30
27
10
IPB149-F-5
13/11/2010-3 Maret 2011
110 hst
90
0,98
22,2
2,3
*
*
22,4
24,2
20,7
11
IPB149-F-8
4/11/2010-12/02/2011
101 hst
104
0,61
27,7
2,4
37,47
33,72
29,58
29,33
25,6
22,45
26,5
28
26,7
Keterangan : UB = Umur Bunga; TT = Tinggi Tanaman; DB= Diameter Batang; PDB = Panjang Daun Bendera; LDB = Lebar Daun Bendera; BGB = Berat Gabah Basah; BGK = Berat Gabah Kering; PM = Panjang
Malai; * = tidak diamati; ** = dari tetua.
Umur Bunga = Tanggal keluar bunga – tanggal tanam
14
15
Tabel 2 Pengamatan bobot dan jumlah anakan dari 18 galur yang tahan
No
Nama Galur
BBT
BKT
BBA
BKA
PA
∑ anakan produktif
1
2
IPB107-F-5-1
82
IPB107-F-7-3
87,79
26
30
12
29,5
7
45
43,28
13
62
9
3
IPB113-F-1
53
*
55
28
37,5
11
4
IPB113-F-2-2
5
IPB115-F-4-2-2
181,34
60
58,87
15
48,5
8
16
12.68
13
4
36,1
4
6
IPB140-F-2-1
41,01
22
8,79
2
50
2
7
IPB140-F-5
85
22
18
5
14,3
2
8
IPB149-F-2
37,91
18
19,88
7
34
3
9
IPB149-F-4
52,29
22
11,64
4,5
18
2
10
IPB149-F-5
43
11
11
5
9
1
11
IPB149-F-8
133,15
62
104,82
26
42
11
Jika dilihat dari banyaknya bernas dan panjang malai, maka galur yang mempunyai kualitas bagus yaitu IPB149-F-2, IPB149-F-4, IPB107-F-7-3, IPB140-F-2-1, dan IPB149-F-8.
15
16
Lampiran 3 Gambar morfologi galur padi yang tahan
16