AMPLIFIKASI FRAGMEN DAN IDENTIFIKASI MUTASI PROMOTER
advertisement
AMPLIFIKASI FRAGMEN DAN IDENTIFIKASI MUTASI PROMOTER inhA, GEN inhA DAN GEN katG PADA ISOLAT MULTIDRUG RESISTANCE Mycobacterium tuberculosis (MDR-TB) DENGAN METODE MULTIPLEX POLYMERASE CHAIN REACTION SKRIPSI INDRA JUANA ADIKARA 1108505028 JURUSAN FARMASI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS UDAYANA 2015 AMPLIFIKASI FRAGMEN DAN IDENTIFIKASI MUTASI PROMOTER inhA, GEN inhA DAN GEN katG PADA ISOLAT MULTIDRUG RESISTANCE Mycobacterium tuberculosis (MDR-TB) DENGAN METODE MULTIPLEX POLYMERASE CHAIN REACTION SKRIPSI INDRA JUANA ADIKARA 1108505028 JURUSAN FARMASI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS UDAYANA 2015 i KATA PENGANTAR Puji syukur penulis panjatkan kehadapan Tuhan Yang Maha Esa, Ida Sang Hyang Widhi Wasa, karena berkat rahmat-Nya penulis dapat menyelesaikan tugas akhir II (Skripsi) yang berjudul “AMPLIFIKASI FRAGMEN DAN IDENTIFIKASI MUTASI PROMOTER inhA, GEN inhA DAN GEN katG PADA ISOLAT MULTIDRUG RESISTANCE Mycobacterium tuberculosis (MDR-TB) DENGAN METODE MULTIPLEX POLYMERASE CHAIN REACTION”. Tugas Akhir II (skripsi) ini diajukan sebagai syarat untuk memperoleh gelar sarjana farmasi (S. Farm) di Jurusan Farmasi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Udayana. Penulisan tugas ahir II (skripsi) tentunya tidak terlepas dari dukungan dan bantuan dari berbagai pihak, baik secara langsung maupun tidak langsung. Oleh karena itu, penulis ingin menyampaikan rasa terima kasih yang sebesar-besarnya kepada: 1. Tuhan Yang Maha Esa atas segala kekuatan yang diberikan sehingga penulis dapat menyelesaikan penyusunan proposal ini. 2. Ir. A. A. Gde Raka Dalem, M.Sc (Hons), selaku Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Udayana. 3. Dr. rer. nat. I Made Agus Gelgel Wirasuta, M.Si., Apt., selaku Ketua Jurusan Farmasi Fakultas MIPA Universitas Udayana. 4. Dr. Sagung Chandra Yowani, S.Si., Apt., M.Si., selaku dosen pembimbing I yang telah membantu dalam membimbing serta tak hentinya memberikan semangat dan dukungan hingga akhir penyusunan proposal ini. 5. Dr. I Nengah Wirajana, selaku dosen pembimbing II yang juga telah banyak membimbing demi kelancaran penyusunan proposal ini. 6. Seluruh dosen pengajar beserta staf/pegawai di Jurusan Farmasi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Udayana yang telah banyak membantu penulis, terutama para staf yang telah banyak membantu dalam hal pengurusan surat dan kelengkapan administratif lainnya. iii 7. Kedua orang tua penulis, I Wayan Yudaarta dan Iis Indriyani yang tak pernah henti memberikan dukungan, doa, dan semangat. 8. Saudara penulis, Alan Kusuma Dinakara beserta keluarga besar tersayang yang selalu mendukung dan memberikan semangat bagi penulis. 9. Sahabat seperjuangan penulis yaitu Prima, Sastra, Yan, Krisna, Dewa, Dwi, Agung, Andre, Suparwata, Ari, Redika, Sami, Roni, Krisnantara, Waisnawa, Jeffry, Yogi dan Fatwa yang telah berjuang bersama sejak awal menginjakan kaki di Jurusan Farmasi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Udayana. 10. Seluruh Mahasiswa Jurusan Farmasi Fakultas MIPA Universitas Udayana, khususnya Lumiere Onze Vauquelin yang telah berjuang bersama penulis. 11. Semua Pihak yang tidak bisa penulis sebutkan satu per satu. Penulis sepenuhnya menyadari bahwa penulisan tugas akhir II (skripsi) ini masih sangat jauh dari kesempurnaan. Untuk itu penulis mengharapkan kritik dan saran yang bersifat membangun dari semua pihak demi karya yang lebih baik di masa yang akan datang. Semoga skripsi ini dapat bermanfaat bagi semua pihak. Bukit-Jimbaran, Juli 2015 Penulis iv DAFTAR ISI Halaman HALAMAN JUDUL................................................................................. i LEMBAR PENGESAHAN.................................................................... ii KATA PENGANTAR............................................................................... iii DAFTAR ISI............................................................................................. v DAFTAR SINGKATAN........................................................................ viii DAFTAR ISTILAH................................................................................ x DAFTAR TABEL................................................................................... xiii DAFTAR GAMBAR.............................................................................. xiv DAFTAR LAMPIRAN........................................................................... xv ABSTRAK............................................................................................... xvi ABSTRACT............................................................................................ xvii BAB I BAB II PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang.................................................................... 1 1.2 Rumusan Masalah........................................................... 5 1.3 Tujuan Penelitian................................................................ 5 1.4 Manfaat Penelitian.............................................................. 6 TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Mycobacterium tuberculosis............................................... 7 2.2Multidrug Resistance Mycobacterium tuberculosis............. 8 2.3 Resistensi Isoniazid............................................................. 9 2.4 KatG................................................................................... 11 2.5 InhA.................................................................................... 12 2.6 Mutasi Gen......................................................................... 13 2.7 Polymerase Chain Reaction (PCR)..................................... 16 2.7.1 Tahapan Polymerase Chain Reaction (PCR) Secara Umum....................................................... 20 2.7.2 Multiplex PCR......................................................... 21 2.8 Sekuensing DNA............................................................... 22 v BAB III METODE PENELITIAN 3.1 Rancangan Penelitian.......................................................... 25 3.2 Lokasi dan Waktu Penelitian.............................................. 25 3.3 Bahan Penelitian............................................................... 26 3.4 Alat Penelitian.................................................................. 27 3.5 Prosedur Penelitian............................................................. 27 3.5.1 Desain Primer........................................................... 27 3.5.2 Isolasi DNA dari Isolat 151 M. Tuberculosis MDR.......................................................................... 28 3.5.3 Optimasi Suhu Annealing Amplifikasi Promoter inhA, Gen inhA dan Gen katG dari Isolat 151 M. tuberculosis MDR............................................................................. 29 3.5.4 Amplifikasi Promoter inhA, Gen inhA dan Gen katG dari Isolat 151 M. tuberculosis MDR dengan Metode Multiplex PCR............................... .. 30 3.5.5 Deteksi Produk PCR.................................................. 31 3.5.6 Sekuensing Produk PCR…........................................ 32 3.5.7 Analisis Sekuen Nukleotida....................................... 32 BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1 Desain Primer.................................................................... 33 4.2 Isolasi DNA dari Isolat 151 M. Tuberculosis MDR........... 37 4.3 Optimasi Suhu Annealing Amplifikasi Promoter inhA, Gen inhA dan Gen katG dari Isolat 151 M. tuberculosis MDR................................................................................. 40 4.4 Amplifikasi Promoter inhA, Gen inhA dan Gen katG dari Isolat 151 M. tuberculosis MDR dengan Metode Multiplex PCR....................................................... 42 4.5 Deteksi Produk PCR......................................................... 44 4.6 Sekuensing Produk PCR…................................................. 45 4.7 Analisis Sekuen Nukleotida................................................ 46 vi BAB V KESIMPULAN DAN SARAN 5.1 Kesimpulan......................................................................... 52 5.2 Saran.................................................................................... 52 DAFTAR PUSTAKA.............................................................................. 53 LAMPIRAN............................................................................................ 60 vii DAFTAR SINGKATAN ahpC = Alkyl hydroxy peroxidase reductase BLASTN = Basic Local Alignment Search Tool Nucleotide CoA = Koenzim A dATP = Deoxyadenocyne triphosphate dCTP = Deoxycytidyne triphosphate ddH 2 O = Double distilled water ddNTP = Dideoxynucleotide triphosphate dGTP = Deoxyguanocyne triphosphate DNA = Deoxyribonucleic acid dNTPs = Deoxynucleotide triphosphates dTTP = Deoxythymidyne triphosphate EDTA = Ethylenediaminetetraacetic Acid ER = Enoyl reductase EtBr = Ethidium bromide ETH = Ethionamid FAS I = Fatty Acid Synthesis I FAS II = Fatty Acid Synthesis II INH = Isoniazid MDR = Multidrug Resistance MDR-TB = Multidrug Resistance Tuberculosis MEGA4 = Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 4.0 NADH = Nicotinamide Adenine Dinukleotida Hidrogen OAT = Obat Antituberkulosis ORF = Open Reading Frame pb = Pasang basa PBS = Phosphate-buffered saline PCR = Polymerase Chain Reaction RIF = Rifampisin TAE = Tris-Acetic-EDTA viii Taq = Thermus Aquaticus TB = Tuberkulosis TBE = Tris-Boric Acid-EDTA Tm = Melting Temperature UV = Ultraviolet WHO = World Health Organization XDR-TB = Extensivelly Drug Resistance Drug-Tuberculosis ix DAFTAR ISTILAH Alignment = Proses pensejajaran sekuen DNA berdasarkan analisis homologi sekuen nukleotida dibandingkan dengan sekuen nukleotida subjek untuk mengidentifikasi kesamaan antar sekuen. Amplifikasi DNA = Perbanyakan DNA Amplikon = Produk amplifikasi DNA Chamber = Wadah untuk meletakkan gel agarose. DNA ladder = DNA dengan ukuran yang diketahui dan digunakan sebagai pembanding ukuran DNA lain dalam gel elektroforesis. DNA polimerase = Enzim yang diperlukan dalam proses sintesis DNA. DNA templat = DNA untai ganda yang membawa urutan basa fragmen atau gen yang akan digandakan. Elektroferogram = Grafik hasil analisis sekuensing Elektroforegram = Pita hasil analisis menggunakan elektroforesis Gen = Urutan DNA yang menyandi suatu protein. In vitro = Percobaan dalam tabung yang menyerupai sistem in vivo agar dapat memberikan hasil yang sama dengan proses in vivo. Kodon = Deret nukleotida pada mRNA yang terdiri atas kombinasi tiga nukleotida berurutan yang menyandi suatu asam amino tertentu. Lokus = Letak gen dalam suatu kromosom. Mispriming = Penempelan primer di tempat lain yang tidak diinginkan pada templat yang terjadi pada suhu annealing. Mutasi = Terjadinya perubahan basa dari urutan nukleotida yang lazim dari suatu sekuen DNA organisme yang dapat menyebabkan perubahan sifat fenotip. x Nukleotida = Molekul yang tersusun dari gugus basa heterosiklik, gula, dan satu atau lebih gugus fosfat. Operon = Sekelompok gen yang diapit secara bersamaan oleh sepasang promoter dan terminator. Open Reading Frame = Sekuens kodon yang dimulai dengan kodon inisiasi dan diakhiri dengan kodon terminasi yang mengkode polipeptida atau bagian polipeptida. Pelet = Substansi hasil sentrifugasi yang memiliki berat jenis yang lebih besar, terdapat pada lapisan bawah (berupa endapan) Primer = Oligonukleotida pendek yang mempunyai urutan nukleotida yang komplementer dengan urutan nukleotida DNA templat. Prodrug = Senyawa yang tidak aktif dan bersifat labil, di dalam tubuh akan mengalami perubahan, melalui proses kimia atau enzimatik, menjadi senyawa induk aktif yang kemudian berinteraksi dengan reseptor dan menghasilkan efek farmakologis. Promoter = Suatu urutan DNA spesifik yang berperan dalam mengendalikan transkripsi gen struktural dan terletak di hulu dari bagian struktural suatu gen. Resistensi = Kemampuan mikroorganisme seperti bakteri, virus dan jamur untuk tumbuh dalam suatu obat yang umumnya obat tersebut akan membunuh atau menghambat pertumbuhan mikroorganisme. Resistensi Silang = Fenomena resistensi terhadap satu obat yang digunakan untuk mengobati penyakit mendorong resistensi terhadap obat lain dalam kelas terapi obat yang sama. Sekuen = Urutan DNA. xi Sekuensing = Proses penentuan urutan basa nukleotida pada suatu molekul DNA. Supernatan = Substansi hasil sentrifugasi yang memiliki berat jenis yang lebih rendah, terdapat pada lapisan atas larutan. Tray = Alat yang digunakan sebagai cetakan gel agarose. Wild type = Organisme yang tidak mengalami mutasi dan digunakan sebagai sekuen pembanding terjadinya mutasi. xii DAFTAR TABEL Halaman Tabel 4.1 Hasil analisis primer forward pF-inhA dan reverse pR-inhA yang telah didesain secara In Silico dengan Clone Manager Suite 6 ........................................................... Tabel 4.2 Hasil analisis homologi sekuen fragmen promoter inhA isolat 151 M. tuberculosis MDR................................ .......... Tabel 4.3 47 Hasil analisis homologi sekuen fragmen gen inhA Isolat 151 M. tuberculosis MDR ............................................ Tabel 4.4 34 47 Hasil analisis homologi sekuen fragmen gen katG Isolat 151 M. tuberculosis MDR ............................................ xiii 48 DAFTAR GAMBAR Halaman Gambar 2.1 Koloni Mycobacterium tuberculosis dalam Media Lowenstein-Jensen (LJ). .............................................. 7 Gambar 2.2 Regio furA - katG ................................................................... 12 Gambar 2.3 Sistem operon mabA - inhA .................................................... 12 Gambar 2.4 Missense mutations ................................................................. 14 Gambar 2.5 Nonsense mutations ................................................................ 15 Gambar 2.6 Frameshift mutations .............................................................. 15 Gambar 2.7 Silent mutations ...................................................................... 15 Gambar 4.1 Elektroforegram Amplikon Hasil Optimasi Suhu Annealing Ketiga Primer pada Dua Suhu Berbeda .................................. 42 Gambar 4.2 Elektroforegram Hasil Amplifikasi Fragmen Promoter inhA, Gen inhA dan Gen katG Menggunakan Metode Multiplex PCR ........................................................................ xiv 44 DAFTAR LAMPIRAN Halaman Lampiran 1. Skema Alur Penelitian ............................................................ 60 Lampiran 2. Sekuen Nukleotida Gen inhA M. tuberculosis H37Rv (GenBank : AF106077.1)............................... ............ 61 Lampiran 3. Sekuen Nukleotida M. tuberculosis H37Rv (GenBank : U66801.1) ................................... ............ 62 Lampiran 4. Sekuen Nukleotida Gen katG M. tuberculosis H37Rv (GenBank : X68081.1) ................................... ............ 63 Lampiran 5. Primer Pair Report………......................................................... 64 Lampiran 6. Pembuatan Larutan………......................................................... 65 Lampiran 7. Skema Kerja Tahap Isolasi DNA.............................................. 67 Lampiran 8. Hasil Sekuensing Fragmen Promoter inhA Isolat 151 M. tuberculosis MDR............................................... 69 Lampiran 9. Hasil Sekuensing Fragmen Gen inhA Isolat 151 M. tuberculosis MDR............................................... 70 Lampiran 10. Hasil Sekuensing Fragmen Gen katG Isolat 151 M. tuberculosis MDR............................................... 72 Lampiran 11. Hasil alignment sekuen nukleotida promoter inhA Isolat P151 dengan menggunakan program MEGA4................ 75 Lampiran 12. Hasil alignment sekuen nukleotida dan asam amino gen inhA Isolat P151 dengan menggunakan program MEGA4...................................................................... 77 Lampiran 13. Hasil alignment sekuen nukleotida dan asam amino gen katG Isolat P151 dengan menggunakan program MEGA4....................................................................... 80 Lampiran 14. Surat Keterangan Kelaikan Etik (Ethical Clearance)………… 86 xv ABSTRAK Multi-Drug Resistance Mycobacterium tuberculosis (MDR-TB) adalah jenis Tuberkulosis (TB) yang resisten terhadap dua atau lebih Obat Anti Tuberkulosis (OAT) lini pertama, seperti rifampisin (RIF) dan isoniazid (INH). Resistensi yang terjadi pada INH disebabkan oleh adanya mutasi gen terutama mutasi pada katG dan inhA. Penelitian ini merupakan penelitian eksploratif laboratoris yang bertujuan untuk mengetahui kemampuan metode Multiplex Polymerase Chain Reaction (PCR) dalam mengamplifikasi fragmen promoter inhA (7-290 pb), gen inhA (31-490 pb) dan gen katG (2437-3160 pb) isolat 151 M. tuberculosis MDR secara bersamaan serta mengidentifikasi terjadinya titik dan jenis mutasi pada ketiga daerah tersebut. Penelitian ini terdiri dari beberapa tahap, yaitu desain primer, isolasi DNA, optimasi suhu annealing, amplifikasi promoter inhA, gen inhA dan gen katG dengan metode Multiplex PCR dan deteksi produk PCR. Tahap berikutnya adalah analisis produk PCR yang meliputi sekuensing nukleotida, analisis homologi dan analisis mutasi menggunakan program MEGA4. Amplifikasi promoter inhA, gen inhA dan gen katG dengan metode Multiplex PCR telah berhasil dilakukan. Hasil penelitian menunjukkan tidak ada mutasi pada gen inhA sedangkan pada promoter inhA dan gen katG terjadi mutasi. Pada promoter inhA, mutasi terjadi pada posisi –15 yaitu perubahan basa sitosin menjadi timin . Pada gen katG, mutasi terjadi pada nukleotida ke-703 sehingga menyebabkan perubahan asam amino pada kodon 235 (R235G). Dari penelitian ini dapat disimpulkan bahwa metode Multiplex PCR mampu mengamplifikasi fragmen promoter inhA, gen inhA dan gen katG isolat 151 M. tuberculosis MDR secara bersamaan. Jenis mutasi yang terjadi pada promoter inhA adalah mutasi titik yaitu substitusi transisi dan jenis mutasi yang terjadi pada gen katG adalah missense mutation. Kata kunci: promoter inhA, gen inhA, gen katG, MDR-TB, Multiplex PCR xvi ABSTRACT Multi-Drug Resistance Mycobacterium tuberculosis (MDR-TB) is a form of tuberculosis (TB) that is resistant toward two or more of the primary drugs i.e. rifampicin (RIF) and isoniazid (INH). Resistance to isoniazid is caused by gene mutations especially mutation in katG and inhA. The method of this research was a laboratory explorative method, aimed to find out the ability of Multiplex Polymerase Chain Reaction (PCR) method to amplify fragment of inhA promoter (7-290 bp), inhA gene (31-490 bp) and katG gene (2437-3160 bp) of 151 M. tuberculosis MDR isolate simultaneously and identify the point and type of mutation that occurred in the three region. This research were conducted in several steps, i.e. primer design, DNA isolation, annealing temperature optimation, amplification of inhA promoter, inhA gene and katG gene using multiplex PCR method and detection of PCR products. The next steps were PCR product analysis that include sequencing, homology analysis and mutation analysis using MEGA4 program. Amplification of inhA promoter, inhA gene and katG gene using multiplex PCR method had been successfully done. The result of this research showed there was not any mutation in inhA gene, while mutation was occured in inhA promoter and katG gene. In the inhA promoter, mutation was occurred at -15 namely substitusion of base cytosine to thymine . In the katG gene, mutation was occurred at nucleotide 703 that caused amino acid alteration at codon 235 (R235G). In conclusion, the multiplex PCR method could amplify fragment of inhA promoter, inhA gene and katG gene of 151 M. tuberculosis MDR isolate simultaneously. Type of mutation in inhA promoter was point mutations known as transition substitution and the type of mutation in katG gene was missense mutation. Key words: inhA promoter, inhA gene, katG gene, MDR-TB, Multiplex PCR xvii
